Summary
Il VisioTracker è un sistema automatizzato per l'analisi quantitativa di prestazioni visive dei pesci adulti e larve piccole basa sulla registrazione dei movimenti oculari. È dotato di un controllo completo sulle proprietà stimolo visivo e analisi in tempo reale, consentendo di alto-rendimento di ricerca in settori quali lo sviluppo del sistema visivo e la funzione, farmacologia, studi di circuiti neurali e l'integrazione senso-motoria.
Abstract
Indagini per lo sviluppo del sistema visivo e la funzione richiederà quantificabili modelli comportamentali di prestazioni visive che sono facili da suscitare, robusta e semplice da manipolare. Un modello adatto è stato trovato nella risposta optokinetic (OKR), un comportamento riflessivo presente in tutti i vertebrati dovute al valore di selezione elevato. Il OKR consiste in lenti stimolo-seguenti movimenti di occhi alternati a rapidi movimenti saccadici reset. La misurazione di questo comportamento può essere facilmente effettuata in larve di zebrafish, a causa della sua insorgenza precoce e stabile (pienamente sviluppata dopo 96 ore dopo la fecondazione (HPF)), e beneficia della conoscenza approfondita su zebrafish genetica, per decenni uno dei modelli favorita organismi in questo campo. Nel frattempo, l'analisi dei meccanismi simili a pesci adulti ha acquisito importanza, in particolare per le applicazioni farmacologiche e tossicologiche.
Qui descriviamo VisioTracker, completamente automatizzata, ad alta throughput sistema per l'analisi quantitativa delle prestazioni visive. Il sistema è basato su una ricerca svolta nel gruppo del Prof. Stephan Neuhauß ed è stato ri-progettato da sistemi di TSE. Esso consiste in un dispositivo di immobilizzazione per piccoli pesci monitorata da una elevata qualità video camera dotata di un obiettivo ad alta risoluzione zoom. Il contenitore pesce è circondato da uno schermo tamburo, sul quale generate dal computer pattern stimolo può essere proiettata. Movimenti oculari vengono registrati e analizzati automaticamente dal pacchetto software VisioTracker in tempo reale.
L'analisi dei dati consente l'immediato riconoscimento di parametri quali la durata fase di lento e veloce, ciclo di frequenze in movimento, lenta fase di guadagno, l'acuità visiva e la sensibilità al contrasto.
Risultati tipici permettono ad esempio la rapida identificazione di mutanti sistema visivo che non mostrano alcuna alterazione evidente nella morfologia di tipo selvatico, o la determinazione di effetti quantitativi delle farmacologica o tossici e mutageniagenti sulle prestazioni del sistema visivo.
Protocol
1. Allevamento di pesci
Gli embrioni sono stati tenuti e allevati in condizioni standard (Marca 2002) e messo in scena in base allo sviluppo in post fecondazione giorni (dpf). Adulti e larve al 5 dpf sono stati utilizzati per le misurazioni.
2. Procedura sperimentale
- Preparazione dello strumento
Larve: le larve di pesci sono stati incorporati nel 3% pre-riscaldato (28 ° C) metilcellulosa per impedire i movimenti del corpo. Gli embrioni sono stati collocati nella parte dorsale del VisioTracker, di fronte allo schermo di proiezione. Pesci adulti: pesce erano anestetizzati brevemente in 300 mg / l MS-222, inserito nel dispositivo di immobilizzazione e posto nel VisioTracker. Prima che le misurazioni sono state avviate, sono stati lasciati a riposo per 1-2 min.
- Generazione di pattern di stimolo
Modelli di stimolo costituiti da verticali e nero-bianco sinusoidali griglie rotanti intorno al pesce sono stati creatiutilizzando il pacchetto software proprietario. Potrebbero essere modulata attraverso il pacchetto software in base alla forma d'onda, contrasto, intensità, velocità angolare e la frequenza spaziale. Patterns sono state proiettate sullo schermo con un proiettore digitale di luce contenuta all'interno del VisioTracker. La distanza approssimativa tra l'occhio del pesce e lo schermo è stato di 4,5 cm, e la dimensione di proiezione su schermo era 360 gradi in orizzontale e 55 gradi in verticale. Per larve, direzione di stimolazione è stato modificato con una frequenza di 0,33 Hz per ridurre la frequenza saccade. I pesci adulti sono stati stimolati unidirezionalmente e solo l'occhio stimolata temporale-to-nasale direzione è stato considerato, dal naso-a-temporale della velocità degli occhi in generale è notevolmente inferiore e meno costante (vedi Mueller e Neuhauß, 2010).
- La registrazione dei movimenti oculari
Un campo chiaro immagine della testa del pesce è stato alimentato ad una telecamera a infrarossi. Illuminazione a infrarossi di pesce è stata effettuata from seguito. La fotocamera registra le immagini a una velocità di 5 fotogrammi / secondo (larve) o 12,5 fotogrammi / secondo (adulti), rispettivamente. Le immagini vengono automaticamente elaborati, corretti e lisciato per la forma degli occhi. Orientamento dell'occhio rispetto all'asse orizzontale è stata quindi determinata automaticamente e velocità occhio è stato calcolato dal pacchetto software proprietario. Piccoli movimenti del pesce venivano corretti automaticamente dal software. Tutto registrazione e analisi è stato ottenuto in tempo reale.
3. Post-elaborazione dei dati sperimentali
- Prime misurazioni di velocità oculari sono stati filtrati per saccadi per estrarre lenta velocità di fase.
- Saccade-filtrati curve di velocità degli occhi sono state levigate da una media di esecuzione con una finestra scorrevole di 7 fotogrammi.
- La velocità degli occhi è stato in media su telai con identiche condizioni di stimolo.
- Per le larve dei pesci, la velocità occhio era una media di oltre entrambi gli occhi.
4. Rappresentante dei risultati:
Per Zebrafish larvale, il mutante paraurti è stato scelto. In questo mutante, le cellule epiteliali lente hyperproliferate, portando a dimensioni ridotte e lente posizione ectopica della lente. Queste alterazioni morfologiche sono riflessi da una significativa riduzione della sensibilità al contrasto e l'acuità visiva (Schönthaler et al., 2010). La Figura 1 mostra la differenza di sensibilità al contrasto di mutanti paraurti contro wild-type fratelli. Mutanti paraurti sempre più non riescono a regolare la velocità occhio al diminuire di contrasto dello stimolo. Per analogia, quando la frequenza spaziale è aumentato stimolo, cioè la larghezza di banda stimolo è diminuita, mutanti paraurti inoltre evidente riduzione dell'acuità visiva (Fig. 2)
La dipendenza degli adulti Zebrafish Visual prestazioni alle condizioni ambientali è stato studiato sottoponendo il pesce per diverse concentrazioni di alcol nel serbatoio di acqua per 30 minuti e successivamente la misurazione della risposta optokinetic in condizioni variabili di stimolo. Zebrafish adulti mostrano una marcata riduzione della sensibilità al contrasto quando mantenuti in concentrazioni crescenti di alcool (Fig. 3). Una simile riduzione dose-dipendente della velocità complessiva occhio in un ampio intervallo di frequenze spaziali potrebbe essere osservata quando il pesce sono state trattate con concentrazioni crescenti di alcool (Fig. 4). Trattamento di alcol, inoltre, dose-dipendente riduce le prestazioni oculomotore a compiti più impegnativi come esemplificato dalla velocità di stimoli maggiori (Fig. 5).
Figura 1. Velocità occhio Zebrafish larvale dipende dal contrasto stimolo. 10 mutanti paraurti e 10 fratelli wild-type sono stati analizzati a 5 dpf in varie s timulus striscia di contrasto condizioni. Il grafico mostra la velocità media occhio ± 1 SEM.
Figura 2. Velocità occhio Zebrafish larvale dipende dalla frequenza spaziale. 10 mutanti paraurti e 10 di tipo selvatico fratelli sono stati sottoposti a diverse larghezze banda stimolo a 5 dpf e analizzati come descritto. Il grafico mostra la velocità media occhio ± 1 SEM.
Figura 3. Zebrafish adulto mostra la concentrazione di alcol-dipendente riduzione della sensibilità al contrasto. Adulto Zebrafish sono stati mantenuti in concentrazioni variabili alcol come indicato per 30 minuti e analizzati in condizioni di banda variabili stimolo contrasto. Il grafico mostra la media temporale-to-nasale velocità occhio ± 1 SEM di 9 pesci per gruppo (eccetto gruppo di controllo: n = 11).
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Figura 4. Zebrafish adulto alcool mostrano concentrazione-dipendente riduzione complessiva movimento dell'occhio in un ampio intervallo di larghezza di banda stimolo. Adulto Zebrafish sono stati mantenuti in concentrazioni variabili alcol come indicato per 30 minuti e analizzati in condizioni di banda variabili stimolo larghezza. Il grafico mostra la media temporale-to-nasale velocità occhio ± 1 SEM di 9 pesci per gruppo (eccetto gruppo di controllo: n = 11).
Figura 5. Adult mostra Zebrafish alcol concentrazione-dipendente riduzione complessiva movimento dell'occhio in un ampio intervallo di velocità di stimolo. Adulto Zebrafish sono stati mantenuti in concentrazioni variabili alcol come indicato per 30 minuti ed analizzati in diverse condizioni di velocità di stimolo. Il grafico mostra la media temporale-to-nasale velocità occhio ± 1 SEM di 9 pesci per gruppo (gruppo di controllo ad eccezione di:n = 11).
Discussion
L'importanza della OKR per lo studio della funzione visiva è stata riconosciuta dalla comunità scientifica per un lungo periodo (Pasqua e Nicola 1996, 1997), e tenta di quantificare realmente il paradigma hanno iniziato oltre un decennio fa. Pasqua e Nicola (1996) ha sviluppato un sistema motorizzato tamburi rotanti a righe, in cui è stato analizzato il video del movimento degli occhi manualmente. Questo sistema ha sofferto la mancanza di immobilizzazione dell'embrione pesce, che ha richiesto l'uso frequente riposizionamento, e in grado di rilevare i movimenti di tracciamento degli occhi solo con grande difficoltà. Un passo in avanti è stato l'uso di un video-proiettata tamburo a strisce per consentire una maggiore variabile presentazione dello stimolo generato dal computer (Roeser & Baier, 2003. Rinner et al, 2005a).
Il prevalentemente manuale, fotogramma per fotogramma analisi delle registrazioni videoregistrate ha dimostrato di essere estremamente laborioso, e in una certa misura ostacolato da osservatore polarizzazione (Beck et al.,2004). Analisi automatizzata in tempo reale è stato suggerito di consentire l'utilizzo di meccanismi comportamentali di apprendimento di feedback (maggiore et al., 2004). L'uso di illuminazione ad infrarossi e stimoli rotanti frequenza controllati è stato sperimentato da Beck et al. (2004). Tuttavia, il sistema descritto non è stato utilizzato solo per le larve, e l'analisi è stata effettuata off-line. Inoltre, il VisioTracker permette il controllo completo stimoli, incluso cambiare lo stimolo durante l'esperimento, consentendo una maggiore flessibilità e spontanea influenza sul corso dell'esperimento. Inoltre, la creazione stimolo digitale utilizzato dal VisioTracker superato i problemi menzionati in precedenza con accelerazione della massa inerte di un tamburo stimolo strisce (Beck et al., 2004).
Le larve di ritenuta da metilcellulosa non interferisce in modo significativo con il movimento degli occhi e non ha effetti a lungo termine sugli zebrafish benessere. Larve di pesci sono stati con successomantenuto incorporato in metilcellulosa per diversi giorni, fino ossigeno attraverso la pelle diventa insufficiente per la domanda con l'aumentare dell'età (Qian et al., 2005).
I pesci adulti metodo di contenimento è altrettanto facile sull'animale. La breve durata dell'esperimento, accoppiata con la possibilità di scambiare rapidamente l'animale prova per una diversa, aumenta ulteriormente gli aspetti positivi benessere degli animali del sistema. Poiché le branchie sono continuamente lavata con acqua, è conveniente spike l'acqua con qualsiasi prodotto chimico di scelta per studiare l'effetto sui movimenti oculari e prestazioni visive. Analogamente un wash-out esperimento può essere aggiunto senza la necessità di gestire l'animale tra gli esperimenti.
Rumore pixel nell'immagine video è stato ridotto al minimo lisciando algoritmi del software VisioTracker proprietario, consentendo misurazioni estremamente precise di posizione degli occhi e la velocità angolare. Inoltre, per facilitare la statistical'analisi, il software filtra i movimenti saccadici che si verificano a velocità fissa e non contribuiscono alla comunicazione sperimentale. Una media di curve di velocità più di 7 fotogrammi video facilitato analisi successive.
Il VisioTracker apre una nuova dimensione per molte aree di ricerca diverse. Il sistema ei suoi predecessori sono già stati utilizzati con successo per quantificare la performance visiva in larve di zebrafish, utilizzando parametri come l'acuità visiva, sensibilità al contrasto e adattamento alla luce (Rinner et al., 2005a, Schönthaler et al., 2010), di analisi funzionale del fotorecettori cono dopo la manipolazione dei membri della cascata di trasduzione visivo (ad esempio, Rinner et al, 2005b, Renninger et al, 2011..), o l'analisi dei difetti visivi in larve di zebrafish mutanti (ad esempio Schönthaler et al, 2005, 2008;. Bahadori et al., 2006). L'interdipendenza di maturazione morfologica e funzionale del sistema visivoè stato studiato da misurazioni okr per dimostrare che l'acuità visiva è principalmente ma non completamente limitata dalla spaziatura fotorecettore stadi larvali (Haug et al., 2010).
Il VisioTracker è ugualmente adatto per analizzare la funzione visiva in zebrafish adulti e altre specie di pesci di dimensioni simili (Mueller e Neuhauß (2010), la presente relazione).
È anche concepibile utilizzare il sistema in aree di ricerca come tossicologia o farmacologia quale sostanze da esaminare possono essere aggiunti al flusso dell'acqua che circonda le branchie dei pesci adulti. Inoltre, la versatilità di VisioTracker consente analisi più approfondite, ad esempio di ontogenetics della funzione visiva, la funzione del circuito neurale e lo sviluppo, o sensomotoria di controllo (vedere recensione è in Huang & Neuhauß, 2008).
Disclosures
Oliver DR Schnaedelbach e Holger D. Russig sono dipendenti di TSE Systems GmbH che produce il sistema di monitoraggio del rendimento visivo utilizzato in questo articolo. La produzione di questo articolo è stato sponsorizzato da TSE Systems GmbH. Stephan CF Neuhuass è un dipendente dell'Università di Zurigo, che percepisce una retribuzione da Sistemi TSE per ogni sistema venduto.
Acknowledgments
KPM è stato supportato da EU FP7 (RETICIRC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0387 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 35 mm cell culture dish | Corning | 430165 | |
| Serum pipette | Greiner Bio-One | 612 361 | |
| VisioTracker | TSE Systems | 302060 |
References
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