Summary
在的VisioTracker是一个自动化的系统记录眼球运动的基础上，幼虫和小型成鱼的视觉性能的定量分析。它具有视觉刺激的属性和实时分析的完全控制权，使在视觉系统发育和功能，药理学，神经回路的研究和感觉运动整合等领域的高通量研究。
Abstract
视觉系统的发育和功能的调查必须量化行为模型的视觉效果，容易引起强大的，简单的操作。视动性反应（OKR），反身的行为，由于其高的选择价值存在于所有脊椎动物中已发现一个合适的模型。的的OKR涉及的与快速重扫视的眼睛交替缓慢的刺激变动如下。这种行为是很容易的测量在斑马鱼幼虫，由于其发病早期和稳定的（完全受精后96小时后（HPF）），以及受益于斑马鱼基因彻底的知识，几十年来的青睐模型在此输入的生物体。同时，在成鱼类似的机制分析得到了重视，尤其是对药理和毒理的应用程序。
这里我们描述VisioTracker的，完全自动化，高吞吐量T系统进行定量分析的视觉表现。该系统的基础上进行的研究组中的教授斯蒂芬Neuhauss的TSE系统被重新设计。它由一个固定装置配备一个高分辨率的变焦透镜由高品质的视频相机监视的小鱼。包围的鱼容器由一个鼓屏幕，计算机生成的刺激模式可以被投影。眼球运动的VisioTracker软件包，实时记录，并自动分析。
数据分析能够立即识别的参数，如慢速和快速阶段的持续时间，运动周期的频率，慢相增益，视力和对比敏感度。
典型的结果让例如药物或毒性和致突变的快速识别视觉系统的突变体，没有明显的改变，野生型形态，或确定的定量影响剂对视觉系统性能。
Protocol
1。鱼的选育
的胚胎被保留，并提出在标准条件下（品牌2002年）和天受精后（DPF）上演根据发展。成虫和幼虫在5 DPF用于测量。
2。实验过程
- 制备仪器
幼虫仔稚鱼被嵌入在3％预温（28°C），甲基纤维素，以防止身体动作。胚胎放在背侧在VisioTracker，面临的投影屏幕。成人鱼：鱼简要地在300毫克/升的MS-222麻醉，装入固定装置和对在VisioTracker下的。在开始测量之前，他们离开，恢复1-2分钟。
- 产生的刺激模式
创建刺激模式由垂直的黑色和白色的正弦波光栅旋转周围的鱼使用专有的软件套件。它们可以是通过软件包调制根据波形，对比度，强度，角速度和空间频率。预计到使用数字光投影机在VisioTracker的，屏幕的模式。鱼的眼睛和屏幕之间的大致距离为4.5厘米，和投影尺寸屏幕上的水平方向360度和55度垂直。仔鱼，刺激方向与0.33赫兹的频率被改变，以减少扫视频率。成人鱼刺激，单向只眼睛的刺激颞鼻方向考虑，因为一般是鼻，颞眼速度显着降低和恒定的参考，以穆勒和Neuhauss的2010年。
- 记录眼球运动
一个明场像鱼的头被送入红外线摄像机。红外照明鱼类的影响fROM如下。相机记录的影像在5帧/秒（幼虫）或12.5帧/秒（成人）的速度。图像自动处理，纠正眼睛的形状和平滑。眼睛有关的水平轴线上的方向，然后自动确定眼速度计算由专有软件套件。小运动的鱼被自动校正的软件。所有的记录和分析，实时完成。
3。实验后的数据处理
- 眼睛的速度的信息的测量，过滤扫视，以便提取相缓慢的速度。
- 扫视过滤眼速度曲线平滑的平均7帧的滑动窗口。
- 眼睛的速度是相同的刺激条件下平均帧。
- 仔鱼，双眼眼速度的平均值。
4。代表性的成果：
对于仔鱼斑马鱼， 保险杠突变的选择。在此突变，晶状体上皮细胞hyperproliferate，导致减少的透镜尺寸和异位的镜头位置。这些形态学改变反映由对比敏感度的显着减少和视力（Schonthaler 等人，2010）。图1显示了差异对比敏感度的保险杠突变体与野生型的兄弟姐妹。 保险杠的突变越来越无法调整眼睛的刺激对比度下降的速度为。通过类推，当刺激空间频率的增加，即降低的刺激条纹宽度， 保险杠的突变体同样演示视力降低（图2）
成年斑马鱼visua的依赖升性能对环境条件的影响通过鱼经受不同的浓度的酒精，在他们的坦克水30分钟，并随后根据不同刺激条件下测量的视动响应。成人斑马鱼显示对比敏感度显着减少时，保持在体内酒精浓度增加（图3）。随着酒精浓度（图4）处理的鱼时，可观察到在很宽的范围内的空间频率类似的剂量依赖性降低眼睛的整体速度。此外，酒精治疗剂量依赖性地减少眼球运动性能更苛刻的任务，例如刺激的速度增加（图5）。
图1。眼睛斑马鱼幼虫的速度是依赖于刺激的对比。 10 保险杠突变体和野生型同胞10分析了在不同s 5的dpf timulus条纹对比度的条件下。图表显示平均眼速度±1 SEM。
图2。斑马鱼幼体眼速度依赖于空间频率。进行10 保险杠突变体和野生型同胞10单丝旦数在5至不同的刺激条纹宽度，并分析所描述。图表显示平均眼速度±1 SEM。
图3。成人斑马鱼显示酒精浓度依赖性降低对比敏感度。成人斑马鱼保持在不同的酒精浓度为30分钟，并表示在不同的刺激条纹对比度条件分析。图表显示的平均时间鼻眼速度±1 SEM组（对照组除外：N = 11）9鱼。
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图4。成年斑马鱼秀酒精浓度依赖性降低整体的眼球运动的刺激条纹宽度在很宽的范围内。成人斑马鱼保持在不同的酒精浓度为30分钟，并表示在不同刺激的条的宽度条件分析。图表显示的平均时间鼻眼速度±1 SEM组（对照组除外：N = 11）9鱼。
图5。成人斑马鱼秀酒精的刺激速度的宽范围内的整体的眼球运动的浓度依赖性的降低。成人斑马鱼保持在不同的酒精浓度为30分钟，并表示根据不同刺激速度条件下进行分析。图表显示的平均时间鼻眼速度±1 SEM 9鱼组（对照组除外：N = 11）。
Discussion
OKR视觉功能的研究的重要性已在科学界公认的很长一段时间（复活节尼古拉·1996年，1997年），并在十年前已经开始尝试真正量化的典范。复活节和Nicola（1996）开发了一个系统，电动旋转条纹鼓，手动眼球运动的录像进行了分析。这个系统遭受从缺乏鱼胚胎，这需要频繁地手动重新定位的固定，并且可以只检测的眼睛跟踪运动以极大的困难。一个新的步骤是使用视频投影条纹鼓，让更多的变数计算机产生的刺激呈现（罗瑟和拜尔，2003年等Rinner。，2005年）。
大多是手动的，帧由帧录像录音的分析已被证明是非常费力的，并在一定程度上阻碍了观察者偏倚（Beck 等人。2004）。有人建议在实时的自动分析行为的反馈学习机制（Major 等，2004），以允许使用。使用红外照明和频率控制的旋转刺激已开创的Beck 等人 （2004）。然而，所描述的系统有只使用了幼虫，并进行了分析，脱机。此外，VisioTracker超过刺激，包括改变在实验过程中的刺激，从而允许更大的灵活性和自发的影响的实验过程中，允许完全控制。此外，用于创建数字激励由VisioTracker克服条纹刺激鼓（Beck 等人，2004年）的惰性质量的加速度与前面提到的问题。
幼虫的克制甲基不显着影响眼球运动，没有任何长期影响斑马鱼的福祉。仔稚鱼已成功保持在甲基纤维素嵌入了好几天，直到通过皮肤的氧气供应不足的需求随着年龄的增加（Qian 等，2005）。
成鱼的抑制方法是对动物也同样容易。的短持续时间的实验中，加上与迅速交换试验动物为一个不同的选项，还添加阳性动物福利方面的系统。由于鳃连续冲洗水，秒杀水和任何化学品的选择，以研究其对眼球运动和视觉表现很方便。同样，洗出实验可以被添加，而无需处理之间的实验动物。
的视频图像中的像素的噪声最小化通过平滑算法的专有VisioTracker软件，使眼睛的位置和角速度的高度精确的测量。此外，为方便统计分析，过滤软件扫视运动发生在固定的速度，不利于实验的说法。 7个视频帧的速度曲线的平均值为以后的分析提供了便利。
VisioTracker打开许多不同研究领域的一个新的维度。系统和它的前辈已经被成功地用于量化在斑马鱼幼虫的视觉效果，如视力，对比敏感度和光适应（Rinner 等人 ，2005年中，Schonthaler 等人，2010）使用参数，功能分析锥感光细胞处理视觉传导级联（例如Rinner 等，2005B，伦宁格等人 ，2011），或视觉缺陷的分析，突变的斑马鱼幼虫（例如Schonthaler 等，2005年，2008; Bahadori 等人，2006年）。成熟的视觉系统的形态和功能之间的相互依存关系已通过OKR测量研究，显示，视力为主，但不完全受限于感光间距在幼虫阶段（豪格等人，2010）。
VisioTracker是同样适用于分析在成年斑马鱼的视觉功能和其他类似的小型鱼类物种（穆勒和Neuhauss的（2010年），这份报告）。
还可以想到，从而以进行调查的物质可能被添加到周围的成年鱼鳃的水流的毒理学或药理学的研究领域中，如利用该系统。此外，通用性更彻底的分析的VisioTracker使例如，ontogenetics的视觉功能，神经回路的功能和发育，或感觉运动控制（见检讨黄Neuhauss，2008年）。
Disclosures
奥利弗，DR Schnaedelbach和Holger D. Russig是TSE系统有限公司，生产员工在这篇文章中使用的可视化性能追踪系统。这篇文章TSE Systems GmbH公司主办的生产。斯蒂芬CF Neuhuass是苏黎世大学的雇员的接收报酬的TSE系统为每个系统出售。
Acknowledgments
KPM支持欧盟FP7（RETICIRC）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0387 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 35 mm cell culture dish | Corning | 430165 | |
| Serum pipette | Greiner Bio-One | 612 361 | |
| VisioTracker | TSE Systems | 302060 |
References
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