Summary
우리는 기존의 누룩 두 하이브리드 심사, 단백질 상호 작용을 식별하는 효과적인 유전자 도구를 수정했습니다. 이 수정은 현저하게, 과정을 단축 부하를 감소하고, 가장 중요한, 잘못된 반응의 수를 줄일 수 있습니다. 또한,이 방법은 재현성과 신뢰성이다.
Abstract
또한 granulin epithelin 전구체 (GEP)로 알려진 Progranulin (PGRN)는, 593 - 아미노 산 autocrine 성장 요소입니다. PGRN 일찍 embryogenesis, 치유 1, 염증 2, 3 상처, 그리고 호스트 방위 사를 포함하여, physiologic 및 질병 프로세스의 다양한 중요한 역할을하는 것으로 알려져 있습니다. neurotrophic 요인 5, PGRN 단백질 원인 frontotemporal 치매 6, 7의 일부 손실 발생 PGRN 유전자의 돌연변이로 PGRN는 기능을 수행합니다. 최근 연구 연골 개발 및 열화 8-11의 중요한 조절기로 PGRN의 고립에 LED가있다. PGRN가 근 20 년 전에 발견하지만, 여러 생리 및 병리 학적 조건에 PGRN의 동작을 이용하여 관련된 메커니즘을 이해하기 위해 노력을 현저하게 그 구속력 수용체 (들)을 식별하기 위해 무능력에 의해 방해되었을에 중요한 역할을 담당합니다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 modi을 개발얘기 들이었다 효모 두 하이브리드 (MY2H)은 가장 일반적으로 사용되는 GAL4 기반 2 - 하이브리드 시스템을 기반으로 접근. 종래의 효모 두 하이브리드 화면과 비교 MY2H 크게 화면 프로세스를 단축하고 거짓 긍정적인 클론의 수를 줄일 수 있습니다. 또한,이 방법은 재현성과 신뢰성이 있으며, 우리는 성공적으로 이온 채널 12, 세포외 기질 단백질 10, 13, 및 성장 인자 14 등 각종 baits의 바인딩 단백질을 분리하는이 시스템을 고용했습니다. 본 논문에서는, 우리는 최초로 알려진 PGRN - 관련 수용체 14, 15 TNFR2의 신분에 LED 예를 들어 PGRN를 사용하여 세부 사항이 MY2H 실험 절차를 설명합니다.
Protocol
1. 참고 자료
효모 두 하이브리드 시스템은 단백질 - 단백질 상호 작용 16, 17 발견하는 데 사용하는 강력한 유전자 기법입니다. 이러한 lexA 기반 시스템, SOS 채용 시스템, 박테리아 또는 포유류의 세포 기반의 2 - 하이브리드 등 2 하이브리드 시스템의 여러 가지 사용 가능한 상업 있으며, 본 논문은 특히 가장 일반적으로 사용되는 GAL4 기반의 수정에 초점을 맞춘 효모 2 - 하이브리드 시스템입니다. 간단히, 방법은 DNA - 바인딩과 transcriptional 활성화에 대한 책임 분리 도메인으로 구성되어 효모 GAL4 단백질의 속성에 따라 달라집니다. 먹이의 단백질은 GAL4 활성 도메인 (AD)에 fusions로 표현하는 동안 미끼 단백질은 GAL4 DNA 결합 도메인 (DNA - BD)에 융합으로 표시됩니다. 미끼와 먹이의 융합 단백질 간의 상호 작용은 효모 g에 통합된 기자의 유전자를 포함하는 GAL4 결합 사이트 transcriptional 정품 인증으로 연결enome. Y2H의 원리는 그림 그림이다. 1과 실험 절차는 그림에 요약됩니다. 2.
2. 필요한 자료 및 솔루션
- YPD 성장 매체 (대부분의 Saccharomyces cerevisiae의 변종의 성장을위한 최적의 비율로 펩톤의 조화, 효모 추출물, 그리고 덱스 트로 오스).
- 최소 SD베이스는 (최소 합성 정의 (SD)베이스 효모 질소 기지, 암모늄 황산, 그리고 탄소 소스, 덱스 트로 오스를 포함합니다. 중퇴 (DO) 보충이 지정된 부족한 합성, 정의된 미디어를 만들기 위해 최소 SD베이스에 추가할 수 있습니다 영양분).
- 레우 / - TRP 중퇴 (DO) 보충 (류신과 트립토판을 제외한 모든 필수 아미노산을 포함)
- -His/-Leu/-Trp/-Ura 중퇴 (DO) 보충 (류신, 트립토판, 히스티딘, 그리고 유라실를 제외한 모든 필수 아미노산을 포함)
- Luria 국물 (LB) (Tryptone 10g / L, 효모 추출물 5g / L, NaCl 5g / L)
- 엑스- 걸 (5 - 브로모 -4 - 클로로 - 3 - 인돌릴 - β - D - galactopyranoside) 솔루션 : N에서 20 MG / ML 주식 솔루션, N - Dimethylformamide로 준비
- 10X TE (100 MM 트리스 - HCL (산도 7.5), 10 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), autoclaved)
- Sonicated 헤링이나 연어 정자 DNA, 삶은 (10 MG / ML)
- 10X LiAc (1 M의 리튬 아세테이트, autoclaved)
- 50% PEG - 3350 솔루션 필터 - 살균
- 3 - 아미노 1, 2, 4 - Triazole (3AT)
- Kanamycin
- 암피실린
- ELECTROMAX DH5α 세포
- Z 버퍼 : 16.1 g Na2HPO4 7H2O (또는 8.52 g 무수), 5.5 g NaH2PO4 H2O (또는 4.8 ganhydrous), 0.75 g KCl, 1 L autoclaved, 증류수에 용해하고 조정 0.246 g MgSO4 7H2O (0.12 g 무수), 산도 7.0.
3. 미끼 세대 (pDBLeu - PGRN)
신호 펩티드 (aa21 - 588)를 부족 cDNA 조각 인코딩 PGRN는 directionally, pDBLeu 벡터의 샐 I - 내가하는 사이트 (ProQuest 두 하이브리드 시스템, Invitrogen)에 복제되었습니다GAL4 DNA 바인딩 도메인과 같은 번역을 읽는 프레임 pDBLeu - PGRN를 생성하는 유지.
- 에서 프레임 융합을 허용하도록 제한 사이트 (3'end에서 샐 5'end에서 내가 아닌 나)를 포함하기위한 oligonucleotide primers를 사용하여 PCR하여 위에서 설명한 PGRN의 cDNA 조각을 증폭.
- 젤 PCR 제품을 정화, 제한과 소화가 샐 내가 아니라 나도 endonucleases
동일한 제한 endonucleases 더블 제한 소화하여 DB 벡터 pDBLeu를 준비합니다. - 선형 pDBLeu 벡터에 제한 PGRN 조각을 Ligate 및 LB에 대한 선택과 DH5α로 변환 + kanamycin을 25 μg / ML에.
- DNA 시퀀싱에 의해 구조의 수정을 확인합니다.
4. 플라스미드 미끼의 소규모 변환
- 30 하룻밤 흔들, Mav203 (Invitrogen)의 식민지로 YPD 5 ML의 예방 ° C.
- YPD 50 ML의 야간 문화를 희석. 추가 성장itional 2~4시간.
- RT에서 5 분 3,000 rpm으로 펠렛은 세포. autoclaved, 증류수 40 ML의 펠렛을 Resuspend.
- 다시 펠렛 세포. 내가 RT 10 분에 품어 솔루션 2 ML에서 Resuspend.
솔루션 I : 0.5 ML 10xLiAc, 0.5 ML 10xTE 4 ML H 2 O - pDBLeu - PGRN로부터 2-3 μl (0.25μg/μl) 및 변성, 가지각색 연어 정자 DNA (10μg/μl) 10 μl : 튜브에 DNA를 분배. 100μl 효모 세포를 추가, 잘 섞는다.
- 700μl 솔루션 II를 추가, 잘 섞는다. 30 ° C 30 분 알을 품다. 솔루션 II : 0.2 ML 10xLiAc, 0.2 ML 10xTE, 1.6 ML 50% PEG3350.
- 42 열충격 ° 15 분 C.
- 2 분을위한 펠릿. 뜨는 폐기하십시오. 200 μl autoclaved, 증류수의 펠렛을 Resuspend.
- 시리얼 dilutions와 SD - 레우 플레이트에 현탁액 플레이트. 2-3 일동안은 30 ° C에서 접시를 품어.
5. 미끼 검증
음침한를 수행하기 전에일 두 하이브리드 자동 활성화를위한 스크린 테스트 pDBLeu - PGRN 및 HIS3 리포터 유전자의 기초 표현 수준을 결정합니다. 이 테스트는 baits이 전사를 활성화 여부와 자기 정품 인증이 억제제에 의해 무력화 될 수 있는지 여부를 결정합니다. 3 - 아미노 1, 2, 4 - triazole (3 - AT)는 HIS3 - 유전자 제품의 경쟁력 저해제이며 히스티딘 - 결함 미디어에 성장에 필요한 HIS3 표현의 최소 수준을 적정하다하는 데 사용할 수 있습니다.
- 효모 Mav203 변형, 플레이트 SD - 레우 플레이트에 변화에 pDBLeu - PGRN를 변환, 그리고 30 48-72 H에 대한 품어 ° C.
- 에 autoclaved 이쑤시개를 사용하여 각 변환의 패치 식민지 SD - 레우 - 그의 10 mm의 농도 3 - AT를 포함하는 접시, 25 MM, 50 MM, 75 MM, 100 MM. - AT 3 3 - AT의 존재에 성장할 수있을 것입니다 HIS3 효소와 자기 활성화를 전시에만 baits의 경쟁력 억제제이다.
- 접시 containi의 성장을 미끼 종자3 - AT NG 100 MM은 두 하이브리드 화면에서 사용하기에 적합하지 않습니다. 사용할 수 baits 들어, 세포 성장을 억제 농도 - 3 최저을 사용합니다. 대부분의 경우 3 - AT의 25 MM은 심사에 사용됩니다.
6. cDNA 라이브러리 심사
플라스미드 pDBLeu - PGRN는 위에서 설명한대로 소규모의 변환을 사용하여 MaV203에 소개됩니다. MaV203 (pDBLeu - PGRN)에 pPC86 라이브러리 (Invitrogen)를 소개하려면 절차는 일반적으로 플라스미드 도서관의 DNA 0.5 μg과 함께 ~ 4 X 10 4 식민지에게 제공 아래에서 설명. 따라서, 2.5 X 10 6 효모 transformants는 ~ 30.0 μg pPC86 - cDNA 라이브러리 플라스미드 DNA, 25 변환, 청명 10 cm 접시 (AT SD - 레우 - TRP, 그 우라 3)를 필요합니다.
- 접시 (아래의 절차 50)에 10 cm SD - 레우 - TRP, 그 우라의 3의 해당 번호를 준비합니다. 또한 transformants의 개수를 계산하는 데 최소 4 10 cm SD - 레우 - TRP 번호판을 준비합니다.
- 로 라이브러리를 변환절차에 따라 pDBLeu - PGRN를 포함 MaV203은 아래 설명했다.
- ~ 100μl autoclaved, 증류수에 MaV203 여러 격리 식민지 (pDBLeu - PGRN)을 일시 중지하고 10 cm SD - 레우 플레이트에 그들을 확산. 두 번째 SD - 레우 플레이트에 대해 절차를 반복합니다. 30 18-24 H에 대한 두 번호판을 품어 ° C.
- 긁어 완전히 10 ML autoclaved, 증류수에있는 세포를 일시 중지합니다. ~ 0.1의 OD 600을주기 위해 플라스크에 액체 YPD 매체의 500 ML에 세포 현탁액의 충분한 볼륨을 추가합니다.
- OD가 접종 후 ~ 0.1 있는지 확인합니다.
- OD 600 ~ 0.4 ° C에 도달하기 전까지는 30 흔들어.
- 신선한 준비 :
- 11 ML 10X TE, 11 ML 10X LiAc, 그리고 88 ML autoclaved 물을 결합하여 110 ML 1X TE / LiAc.
- 1.6 ML 10X TE, 1.6 ML 10X LiAc, 그리고 12.8 ML 50% PEG - 3350를 결합하여 16 ML PEG / LiAc.
- 상온에서 5 분 3,000g에서 펠렛은 세포.
- T를 삭제그는 supernatants 부드럽게 실내 온도 100 ML autoclaved, 증류수에 아래 pipetting 및하여 펠렛을 resuspend.
- 상온에서 5 분 3천그램에서 원심 분리기.
- centrifuged 세포의 표면에 뜨는을 취소하고 50 ML 1X TE / LiAc 솔루션 세포 펠렛을 resuspend.
- 상온에서 5 분 3천그램에서 원심 분리기.
- supernatants를 제거하고 2.5 ML 1X TE / LiAc 솔루션의 최종 볼륨의 펠렛을 resuspend.
- 25 변환을 수행합니다. 2.5 ML 세포 변성 125 μl (10μg/μl), 가지각색 연어 정자 DNA, 30 μg cDNA 라이브러리를 결합합니다. 최대 pipetting 아래로 부드럽게 섞는다. 15 ML PEG / LiAc 솔루션을 추가하고 부드럽게 섞는다. 25로 나누어지는 각 700 μl의 1.5 ML microcentrifuge 튜브를 autoclaved.
- 30 ° C의 물을 욕조에 30 분 알을 품다.
- 42 ° C의 물을 욕조에서 15 분 열충격.
- 상온에서 1 분 6천g에서 원심 분리기. 조심스럽게 슈퍼를 제거natant. 부드럽게하고 위아래로 pipetting하여 400 μl autoclaved, 증류수 각 펠렛을 resuspend.
- 플레이트 단일 10 - cm SD - 레우 - TRP, 그 우라 세 AT (3AT 농도 : 25 ㎜)에 각 변형에서 200 μl 변환 혼합 확산 막대를 사용하는 접시, 그럼 25 1.5 ML microcentrifuge 튜브 50 접시를 만들 수 autoclaved (SD - 레우 - TRP, 그 우라의 3 AT).
- 30 50~10일 ° C.에 대한 품어 접시
- SD - 레우 - TRP 플레이트에 도금되며, 반응의 변환 효율, 한 반응 (1:400과 1:4000 1시 40분)의 시리얼 dilutions을 측정합니다. 30 삼일 ° C, 콜로니의 수를 계산하고 계산 transformants의 총 번호 잠복기 후에.
7. X - 여자 분석
- YPD 판에 식민지를 전송, 30 품어 ° C 하룻밤.
- 장소는 YPD 접시에 Nitrocellulose 막을 반올림, 멤브레인 및 YPD 플레이트 사이에 거품이 없습니다 있는지 확인하십시오. 1-2 후에 분, mAKE 있는지 모든 식민지는 세포막 (nitrocellulose 종이)로 전송됩니다.
- 알루미늄 호일 종이로 만든 보트를 타고 막 식민지 측면을 넣으십시오.
- 액체 질소로 막을 올려, 몇 분 동안 액체 질소로 이십초, 그리고 잠수함을 기다립니다.
- 해동에 멤브레인을 꺼내.
- 한편 다음과 같은 시약을 혼합 :
1.5ml Z 버퍼
20μl X - 여자 (20 MG / ML) - Z 버퍼 / 배양 접시에 X - 여자, 그 위에 자리 워트 먼지 종이를 버려라.
- 워트 먼지 종이 위에 nitrocellulose 종이를 조심스럽게 넣습니다.
- 파란색 식민지가 나타날 때까지 37 °에서 품어.
8. Retransformation 분석
더 이상 잘못된 반응을 제거하고 추가를 용이하게 할 수 라이브러리 심사으로부터 격리 먹이 융합 단백질 (AD - Y)는 리포트 유전자를 유도하는 미끼 융합 단백질 (DB - X)와 상호 작용을 유지해야하며, 사냥감의 클론과 미끼의 retransformation는 누룩으로 구축itional 분석.
- 잠재적으로 상호 작용하는 단백질을 포함하는 효모 종자로부터 플라스미드 DNA를 분리.
- E. 대장균에 유전자를 변형 DH5α 세포, LB 플레이트에 변형을 100 μg / ML 암피실린 플레이트 선택 pPC86 - cDNA 라이브러리를 분리하고, 37 하룻밤 부화 ° C.
- LB로 100 μg / ML 암피실린의 국물을 넣어 접시에서 여러 식민지를 선택하십시오.
- 나는 샐 아니라 I. 더블 제한 분석 DNA miniprep을 준비하고 검토
- MaV203에 플라스미드 먹이와 미끼는 플라스미드 공동 변환, 판 변형 SC - 레우 - TRP의 접시에 혼합하고, 30 2~3일 ° C.에 대한 부화
- SC - 레우 - TRP 플레이트의 세 가지 다른 식민지를 선택, X - 여자 분석을 수행합니다.
9. 시퀀싱 및 생물 정보학 분석
순서 가능성이 진정한 긍정적인 클론으로부터 격리되었다 플라스미드 DNA는 어쩌구를 사용하여 GenBank 사람들에게이 시퀀스를 비교ST 프로그램, 알려진 유전자에 해당하는 그 두 하이브리드 클론을 식별합니다. 시퀀싱 데이터는 위에서 얻은 12 반응의 두 세포 표면 TNFR2 (; 가입 # NM_130426 TNFRSF1B/CD120b)라고했다. 또한, PGRN와 TNFR 사이의 상호 작용은 고체 상 구속력을 분석, 공동 immunoprecipitation, 표면 plasmon 공명 분석 및 유동세포계측법 분석 14 체외에서 등 다양한 단백질 - 단백질 상호 작용 assays를 사용하여 확인되었다.
10. 대표 결과
심사의 플로우 차트는 그림에 설명되어있다. 3. 일반적으로 50-100 긍정적인 클론 후보는이 단계에서 얻은 것입니다. 우리는 처음 PGRN 미끼로 상영 2,500,000 transformants 중 54 긍정적인 클론 후보를 고립. 긍정적인 클론 후보는 다음 X - 여자 분석을 수행하여 검증되었다. 일반적으로, 약 50 % 거짓 긍정적인 클론은 X - 분은 분석을 통해 제거됩니다. 우리는 솔직한 23 긍정적인 클론을 획득 PGRN 미끼 (그림 4)에 대해이 단계에서 ates. 먹이의 클론과 효모에 미끼 구조의 Retransformation 추가 여전히 기자의 유전자 가능성이 진정한 반응을 나타내는 활성화 잘못된 반응과 클론을 제거합니다. 일반적으로, 약 50 % 긍정적인 클론 후보가 삭제됩니다. 우리는 마침내 효모에 PGRN와 상호 작용 12 긍정적인 클론을 분리.
그림 1. 효모 두 하이브리드 시스템에게의 원리
그림 2. 효모 두 하이브리드 시스템을 사용 단백질 바인딩 파트너를 식별 파이프라인
그림 3. 심사 효모의 플로우 차트 두 하이브리드 도서관.rge.jpg "대상 ="_blank ">이 이미지의 전체 크기 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
긍정적인 클론 후보자의 그림 4. 베타 - 갈락토 분석. 라이브러리 화면에서 얻은 긍정적인 클론은 YPD 플레이트로 전송하고 30 ° C 야간에 incubated 있었다, B는 YPD 접시에 모든 식민지는 nitrocellulose의 점막에 전송 및 베타 - 갈락토 분석이 수행되었다.
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Discussion
효모 두 하이브리드 심사는 단백질 상호 작용 16, 17 식별에 효과적인 도구로 증명되었습니다. 에, 같은 생화학 공동 정화 및 단백질 칩, 효모 두 하이브리드 시스템이 비교적 간단한 실험 순서를 코딩 매우 높은 숫자를 검사에 사용할 수있는 민감한 유전자 접근 방식이므로 단백질 바인딩 파트너를 식별하는 다른 접근과 비교 또한, 그것은 생체내 상호 작용의를 감지하고 복잡한 단백질 정화가 필요하지 않습니다. 물론 효모의 2 하이브리드 시스템은 한계를 가지고 예를 들어, 필요한 포스트 translational 수정, 융합 단백질의 부족 접는 및 / 또는 안정성 및 변경 subcellular 위치의 부재는 (단백질이 핵으로 이동됩니다 이것은 수 ) 실제 생리적 상태 수 없습니다. 또한, 기자의 유전자, 예를 들어 자기 activators의 가짜 활성화를 전시 단백질 직접 먹이 CD를 검사 baits으로 사용할 수 없습니다NA 라이브러리. 이 단점을 극복하기 위해서는 각 기능 도메인 대신에 그대로 단백질은 일반적으로 손상 단백질 다양한 접근법을 사용하여 상호 작용의 검증 다음 baits으로 사용됩니다. 예를 들어, 우리는 성공적으로 ADAMTS - 7 metalloproteinase와 미끼 10, 13 등 광고의 EGF와 같은 도메인을 사용하여 광고의 바인딩 파트너 progranulin 성장 인자를 분리했습니다.
효모 transformants 그 다음 두 번째 빼기 셋 접시 (SD로 전송 그의 이상의 클론을 선택을 가장 먼저 빼기 셋 접시 (SD - 레우 - TRP - 그의 세 AT)에 도금이기 때문에 종래의 심사 절차, 시간이 소요됩니다 우라 선택에 대한) AT - 레우 - TRP - 우라 3. 또한, 긍정적인 클론의 수천의 복제는 특별한 도구를 필요로하고,이 화면 프로세스는 종종 잘못된 반응 다수의 결과. 우리는 직접 마이너스 개 접시 (SD - 레우 - TRP, 그 우라의 3 AT)보다 두 minu의 효모 transformants을 도금의 - 셋 접시, 진정한 상호 작용 클론이 동시에 효모 게놈에 통합 기자 구성 요소 (예 : 생산 히스티딘, 그리고 유라실)를 모두 활성화하고 마이너스 개의 접시에 생존해야합니다 수 있어야하기 때문에 (SD - 레우 - TRP - 그 .. )에 우라 3. 이 수정은 현저하게, 프로세스 (수정된 화면 절차는 5~10일 필요한 반면, 예를 들어, 기존의 심사 절차는 일반적으로 약 10-20 일 정도가 소요)을 단축 부하를 감소, 그리고 가장 중요한, 잘못된 반응의 수를 줄일 수 있습니다. 또한,이 방법은 재현성과 신뢰성이 있으며, 우리는 성공적으로 나트륨 채널 12 세포외 기질 단백질 10, 13 등 다양한 baits의 바인딩 단백질을 분리이 수정된 시스템을 고용했습니다. 최근 우리는이 성장 인자에 관련된 미래의 발견에 대한 견고한 기초를 제공,이 접근법 14, 15을 사용하여 TNF 수용체의 리간드 소설로 PGRN 확인.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH 연구 기금 K01AR053210, R01AR061484 및 국립 건선 재단의 교부금에 의해 투자되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ProQuest two-hybrid system | Invitrogen | 10835 | |
| YPD Growth Medium | Clontech Laboratories | 630409 | |
| YPD Agar Medium | Clontech Laboratories | 630410 | |
| Minimal SD agar Base | Clontech Laboratories | 630412 | |
| -Leu DO Supplement | Clontech Laboratories | 630414 | |
| -Leu/-Trp DO Supplement | Clontech Laboratories | 630417 | |
| -His/-Leu/-Trp/-Ura DO Supplement | Clontech Laboratories | 630425 | |
| 3-Amino-1,2,4-Triazole (3AT) | Sigma-Aldrich | A8056 | |
| Luria broth (LB) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| X-Gal | Invitrogen | 15520-034 | |
| Sonicated Salmon Sperm DNA | Stratagene, Agilent Technologies | 201190 | |
| Ampicillin | AMRESCO | 0339 | |
| Kanamycin Sulfate | Invitrogen | 11815-024 | |
| Subcloning Efficiency™ DH5α™ Competent Cells | Invitrogen | 18265-017 | |
| Trizma® base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Lithium acetate | Sigma-Aldrich | L4158 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ED | |
| Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 162-0115 | |
| 10-cm petri dish | ITI Scientific | CT-903 | |
| Incubator (30 °C) | ATR (Ecotron) |
References
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