Мы модифицировали обычные дрожжи двугибридная скрининга, эффективный генетический средством выявления белковых взаимодействий. Эта модификация значительно сокращает процесс, снижает рабочую нагрузку, и, самое главное, снижает количество ложных срабатываний. Кроме того, этот подход является воспроизводимым и надежно.
Progranulin (PGRN), также известный как granulin epithelin предшественника (ПВС), является 593-амино-кислоты аутокринной фактора роста. PGRN как известно, играет важную роль в различных физиологических и болезненных процессов, в том числе раннего эмбриогенеза, заживление ран 1, воспаления 2, 3 и 4 иммунной защиты. PGRN также функционирует как нейротрофический фактор 5, а мутации в гене PGRN приводит к частичной потере причиной PGRN белка лобно-височной деменции 6, 7. Наши недавние исследования привели к изоляции PGRN как важный регулятор хряща развития и деградации 8-11. Хотя PGRN, обнаружили почти два десятилетия назад, играет решающую роль во многих физиологических и патологических состояний, усилия, направленные на использование действия PGRN и понять механизмы, участвующие были значительно препятствует нашей неспособности определить его связывание рецепторов (ы). Чтобы решить эту проблему, мы разработали модификациюFied дрожжей двух гибридных (MY2H) подход, основанный на наиболее часто используемые GAL4 основан 2-гибридной системы. По сравнению с обычными дрожжами двугибридная экран, MY2H резко сокращает экране процесс и снижает количество ложных положительных клонов. Кроме того, этот подход является воспроизводимым и надежно, и мы успешно используют эту систему в изоляции связывающих белков различных приманок, в том числе ионный канал 12, внеклеточный белок матрицы 10, 13, и фактор роста 14. В этой статье мы описываем эту MY2H экспериментальная процедура подробно использованием PGRN в качестве примера, который привел к идентификации TNFR2 как первый известный PGRN связанных рецепторов 14, 15.
Дрожжи двугибридная скрининга оказалась эффективным инструментом в определении взаимодействия белка 16, 17. По сравнению с другими подходами для идентификации белков-связывающих партнеров, таких как биохимические совместной очистки и белковых чипов, дрожжи две гибридные систем?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа финансировалась исследовательских грантов NIH K01AR053210, R01AR061484 и грант от Национального фонда псориаза.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
ProQuest two-hybrid system | Invitrogen | 10835 |
YPD Growth Medium | Clontech | 630409 |
YPD Agar Medium | Clontech | 630410 |
Minimal SD agar Base | Clontech | 630412 |
-Leu DO Supplement | Clontech | 630414 |
-Leu/-Trp DO Supplement | Clontech | 630417 |
-His/-Leu/-Trp/-Ura DO Supplement | Clontech | 630425 |
3-Amino-1,2,4-Triazole (3AT) | Sigma-Aldrich | A8056 |
Luria broth (LB) | Sigma-Aldrich | L3022 |
X-Gal | Invitrogen | 15520-034 |
Sonicated Salmon Sperm DNA | Stratagene | 201190 |
Ampicillin | AMRESCO | 0339 |
Kanamycin Sulfate | Invitrogen | 11815-024 |
Subcloning Efficiency™ DH5α™ Competent Cells | Invitrogen | 18265-017 |
Trizma® base | Sigma-Aldrich | T6066 |
Lithium acetate | Sigma-Aldrich | L4158 |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ED |
Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 162-0115 |
10-cm petri dish | ITI Scientific | CT-903 |
Incubator (30 °C) | ATR (Ecotron) |