Nós modificamos o fermento convencional de dois híbridos de rastreamento, uma ferramenta eficaz na identificação genética de interação de proteínas. Esta modificação marcadamente encurta o processo, reduz a carga de trabalho, eo mais importante, reduz o número de falsos positivos. Além disso, esta abordagem é reproduzível e confiável.
Progranulina (PGRN), também conhecido como precursor granulin epithelin (GEP), é um fator de crescimento 593-amino-ácido autócrina. PGRN é conhecida por desempenhar um papel crítico em uma variedade de processos fisiológicos e de doença, incluindo a embriogênese precoce, uma cicatrização de feridas, inflamação 2, 3 e 4 de defesa do hospedeiro. PGRN também funciona como um fator neurotrófico 5, e as mutações no gene PGRN resultando em perda parcial da demência frontotemporal causa proteína PGRN 6, 7. Nossos estudos recentes têm levado ao isolamento de PGRN como um importante regulador da cartilagem desenvolvimento e degradação 8-11. Embora PGRN, descoberto há quase duas décadas, desempenha um papel crucial em várias condições fisiológicas e patológicas, os esforços para explorar as ações de PGRN e entender os mecanismos envolvidos foram significativamente prejudicada pela nossa incapacidade de identificar a sua ligação ao receptor (s). Para resolver este problema, desenvolvemos um modicados levedura híbrida de dois (MY2H) abordagem baseada no mais comumente usados GAL4 sistema 2-híbrido baseado. Comparado com o convencional levedura tela dois híbridos, MY2H reduz drasticamente o processo de tela e reduz o número de falsos positivos clones. Além disso, esta abordagem é reproduzível e confiável, e temos empregada com sucesso este sistema para isolar as proteínas de ligação de iscas diversas, inclusive de canal iônico, 12 de proteínas da matriz extracelular 10, 13, e fator de crescimento 14. Neste artigo, descrevemos este procedimento MY2H experimental em detalhe usando PGRN como um exemplo que levou à identificação de TNFR2 conhecido como o primeiro receptor PGRN associada 14, 15.
Triagem levedura híbrida de dois provou ser uma ferramenta eficaz na identificação de interação proteína 16, 17. Em comparação com outras abordagens para a identificação de proteínas de ligação de parceiros, como a bioquímica co-purificação de proteínas e chips, levedura híbrida de dois sistemas é uma abordagem sensível genética que pode ser usado para screening um grande número de seqüências de codificação em um experimento relativamente simples, em Além disso, ele detecta a intera…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado por verbas de pesquisa NIH K01AR053210, R01AR061484 e uma bolsa da Fundação Nacional de Psoríase.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
ProQuest two-hybrid system | Invitrogen | 10835 |
YPD Growth Medium | Clontech | 630409 |
YPD Agar Medium | Clontech | 630410 |
Minimal SD agar Base | Clontech | 630412 |
-Leu DO Supplement | Clontech | 630414 |
-Leu/-Trp DO Supplement | Clontech | 630417 |
-His/-Leu/-Trp/-Ura DO Supplement | Clontech | 630425 |
3-Amino-1,2,4-Triazole (3AT) | Sigma-Aldrich | A8056 |
Luria broth (LB) | Sigma-Aldrich | L3022 |
X-Gal | Invitrogen | 15520-034 |
Sonicated Salmon Sperm DNA | Stratagene | 201190 |
Ampicillin | AMRESCO | 0339 |
Kanamycin Sulfate | Invitrogen | 11815-024 |
Subcloning Efficiency™ DH5α™ Competent Cells | Invitrogen | 18265-017 |
Trizma® base | Sigma-Aldrich | T6066 |
Lithium acetate | Sigma-Aldrich | L4158 |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ED |
Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 162-0115 |
10-cm petri dish | ITI Scientific | CT-903 |
Incubator (30 °C) | ATR (Ecotron) |