Это детали протокола метод количественной мерой пептид транслокации в крупные однослойные везикулы липидов. Этот метод также дает информацию о скорости перемещения мембраны и может быть использована для идентификации пептидов, которые эффективно и спонтанно крест липидного бислоя.
Существует активный интерес к пептидов, которые легко через клеточные мембраны без помощи рецепторами клеточной мембраны 1. Многие из них называют клеточной проникающих пептидов, которые часто отмечены за их потенциал в качестве вектора доставки лекарств 1-3. Более того, существует растущий интерес к антимикробных пептидов, которые работают не через мембраны литические механизмы 4,5, в особенности тех, которые пересекают мембран бактерий, не причиняя лизиса клеток и убивают клетки, влияя на внутриклеточные процессы 6,7. На самом деле, авторы все чаще указывали на связь между сотовыми-проникающей и антимикробных пептидов 1,8. Четкое представление о процессе перемещения мембраны и отношения между пептидной структуры и ее способность к транслокации требует эффективных, воспроизводимых анализов для транслокации. Несколько групп предложенных методов для измерения перемещения на большие unilamelЛар липидных везикул (БУВ) 9-13. БУВ послужить полезными моделями для бактериальных и эукариотических клеточных мембран и часто используются в пептидных флуоресцентных исследований 14,15. Здесь мы описываем наш применения метода впервые разработана Мацузаки и коллег рассмотреть антимикробные пептиды, такие как magainin и buforin II 16,17. В дополнение к предоставлению наш протокол для этого метода, мы также представляем прямой подход к анализу данных, которая количественно транслокации возможность использования этого теста. Преимущества этой транслокации анализа по сравнению с другими является то, что она имеет потенциал для предоставления информации о скорости перемещения мембраны и не требует добавления флуоресцентной метки, которые могут изменить свойства пептида 18, триптофан-содержащих пептидов. Короче говоря, способность транслокации в липидные пузырьки измеряется как функция энергии Фостер резонансной передачи (FRET) между родной остатков триптофана и гansyl фосфатидилэтаноламина, когда белки, связанные с внешними LUV мембраны (рис. 1). Cell-проникающих пептидов расщепляются, как они сталкиваются с раскованный трипсина инкапсулированные с БУВ, что приводит к отмежевание от LUV мембраны и падение FRET сигнала. Падение FRET сигнала наблюдается translocating пептида значительно больше, чем это наблюдалось за тот же пептид, когда БУВ содержать как трипсина и ингибитора трипсина, или когда пептид, который не спонтанно крест липидные мембраны подвергается трипсина содержащих БУВ. Это изменение флуоресценции обеспечивает прямое количественное пептидных транслокации с течением времени.
Протокол, представленные здесь может быть использован для оценки относительного изменения концентрации пептидов внутри и снаружи липидные пузырьки. Эти изменения связаны с перемещением способности. Этот протокол может быть использован для определения клеточного проникающих пептид…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить Элеонора Флеминг и Джессика Чен за полезные обсуждения. Финансирование было предоставлено Национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний (НИЗ-NIAID) Награда R15AI079685 и Research Corporation Коттрелл колледжа науки Award. Дополнительная поддержка студентов была предоставлена Медицинского института Говарда Хьюза и фонда Стейли.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
16:0-18:1 PG | Avanti Polar Lipids | 840457C |
1:18 Dansyl PE | Avanti Polar Lipids | 810330C |
16:0-18:1 PC | Avanti Polar Lipids | 850457C |
Porcine trypsin | Sigma | T-0303 |
Bowman-Birk trypsin/chymotrypsin inhibitor | Sigma | T-9777 |
Mini-extruder | Avanti Polar Lipids | 610000 |
Ammonium molybdate (para) | Alfa Aesar | 10811 |
L-ascorbic acid | Sigma | A1417 |
Hydrogen Peroxide, 30% solution | Mallinckrodt chemicals | 5240-05 |
HEPES | Sigma | H-3375 |
NaCl | Sigma | S-9625 |
EDTA | Sigma | E5134 |
NaH2PO4 | Sigma | S-0751 |