Summary
نحن تصف كيفية تنفيذ فيروسات أو التهابات lentiviral من overexpression shRNA أو المحتوية. يبني الإنسان راموس في الخلية B الخط وكيفية قياس جسدية hypermutation في هذه الخلايا
Abstract
خلايا B تبدأ حياتها مع الأجسام المضادة الناتجة عن انخفاض تقارب تأشب الخامس J (D). ومع ذلك ، بناء على الكشف عن العوامل المسببة للأمراض ، وتحور المتغير (V) المنطقة من الجين (IG) الغلوبولين المناعي ما يقرب من 100،000 مرات أكثر من بقية الجينوم خلال hypermutation جسدية (SHM) ، مما أدى إلى ارتفاع تقارب 1،2 الأضداد. بالإضافة إلى ذلك ، فئة التوحد التبديل (CSR) وتنتج الأجسام المضادة مع وظائف المستجيب مختلفة تبعا لنوع من رد الفعل المناعي ان هناك حاجة لعامل ممرض معين. وبدأ كل من المسؤولية الاجتماعية للشركات والتي SHM نازعة أمين سيتيدين التنشيط التي يسببها (AID) ، والتي deaminates مخلفات السيتوزين في الحمض النووي لانتاج uracils. تتم معالجة هذه uracils بأشكال عرضة للخطأ من مسارات الإصلاح ، مما يؤدي في النهاية إلى حدوث طفرات وإعادة التركيب 1-3.
فهمنا الحالي للتفاصيل الجزيئي للSHM والمسؤولية الاجتماعية للشركات تأتي من مجموعة من الدراسات التي أجريت في الفئران وخلايا الأولية ، وخطوط الخلية ، والخلية F -ري التجارب. نماذج الماوس تبقى المعيار الذهبي مع بالضربة القاضية الجينية تظهر أدوارا حاسمة لعوامل كثيرة إصلاح (على سبيل المثال اونغ ، MSH2 ، Msh6 ، Exo1 وبوليميريز η) 40-10. ومع ذلك ، ليس كل الجينات قابلة للدراسات خروج المغلوب. على سبيل المثال ، بالضربة القاضية من عدة مزدوج الجديلة البروتينات إصلاح كسر مميتة بشكل أولي أو يضعف B - الخلية التنمية 11-14. وعلاوة على ذلك ، قد تكون في بعض الأحيان ملثمين وظيفة معينة من البروتين في SHM أو المسؤولية الاجتماعية للشركات عن عيوب أكثر عالمية بسبب خروج المغلوب. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن منذ التجارب على الفئران أن تكون طويلة ، وتغيير تعبير الجينات الفردية في خطوط الخلايا قد تصبح خطوة شعبية متزايدة الأولى لتحديد وتوصيف الجينات مرشح 15-18.
وقد تم شعبية الخلية سطر نموذج لدراسة SHM 18-24 -- راموس -- خلية سرطان الغدد الليمفاوية بيركيت الخط الذي يمر constitutively SHM. ميزة واحدة من الخلايا راموس هو أن لديهم المدمج في شبه مريحةقياس كمي للSHM. خلايا التعبير عن نوع IgM و البرية ، لأنها تلتقط الطفرات ، وبعض من الطفرات ضرب التعبير الغلوبولين المناعي. لذلك ، يعاير خسارة الغلوبولين المناعي عن طريق المسح الضوئي مضان تنشيط الخلايا (FACS) يوفر قراءة سريعة التدريجي لمستوى SHM. ويمكن الحصول على مزيد من القياس الكمي للSHM بواسطة تسلسل الجينات مباشرة الأضداد.
منذ الخلايا راموس يصعب transfect ، ونحن ننتج المشتقات المستقرة التي زادت أو خفضت التعبير عن الجينات الفردية التي تصيب الخلايا مع فيروسات أو يبني lentiviral التي تحتوي إما على كاسيت أو overexpression قصيرة الحمض النووي الريبي القاسي (shRNA) ، على التوالي. هنا ، نحن تصف كيف تصيب الخلايا راموس ومن ثم استخدام هذه الخلايا لبحث دور للجينات محددة بشأن SHM (الشكل 1).
Protocol
1. إعداد العينات والخلايا
- تنفيذ إعداد المتوسطة الحجم من الحمض النووي (midiprep) من overexpression shRNA أو المحتوية. يبني وناقلات التعبئة pKat2 فيروسات أو ناقلات التعبئة lentiviral pVSV - G ، pMDLg / pRRE ، والقس pRSV - 25 6 استخدام الحمض النووي ميكروغرام لكل بناء وإما 4 ميكروغرام من pKat2 (للعدوى فيروسات) أو 1.5 ميكروغرام الحمض النووي لكل من pMDLg ، pVSV - ز / pRRE وناقلات التعبئة pRSV - REV (للعدوى lentiviral).
- إعداد BOSC 23 وسائل الإعلام. لترنسفكأيشن ، استخدام كل Dulbecco غير المعدلة والمعدلة النسر المتوسط (DMEM) فضلا عن DMEM كاملة. لجعل DMEM كاملة ، إضافة 1 العازلة HEPES ٪ ، 1 ٪ البنسلين ، الستربتومايسين ، الجلوتامين (PGS) ، و 10 ٪ العجل الوليد المصل (NCS) لزجاجة من DMEM.
- إعداد راموس وسائل الإعلام. للخطوة العدوى ، وجعل كامل RPMI - 1640 متوسطة (RPMI) بإضافة HEPES 1 ٪ ، 1 ٪ PGS ، و 10 ٪ مصل بقري جنيني (FBS) لزجاجة من RPMI. خطوة واحدة لخلية البذر ، مأك "مشروطة" وسائل الاعلام من خلال زراعة خلايا راموس في RPMI كاملة لمدة 2 يوم ، الغزل أسفل الخلايا في أسفل ز X 400 لمدة 4 دقائق وتصفية طاف مع 0.2 ميكرون مرشح في زجاجة معقمة. مثل غيرها من وسائل الإعلام كاملة ، يتم تخزين وسائل الإعلام مشروطة عند 4 درجة مئوية لحين الحاجة إليها.
- تقسيم 3 × 10 6 23 BOSC الخلايا في لوحة 100 ملم في 10 مل DMEM الكامل قبل يوم واحد بحيث ترنسفكأيشن الخلايا ستكون في 50-60 ٪ confluency يوم ترنسفكأيشن. جعل واحدة من الخلايا لوحة لكل ناقلات كنت تخطط لtransfecting. فمن المهم أنه لم يتم الاحتفاظ بها في الخلايا الثقافة لفترة طويلة جدا ، واستخدام الخلايا منخفضة أو مرور عدد الخلايا في الآونة الأخيرة لإذابة ترنسفكأيشن على حد سواء واتخاذ خطوات لضمان العدوى عدوى جيدة.
- وتشمل الضوابط لتجاربك. لtransfections والالتهابات ، وإنشاء سيطرة سلبية (خلايا untransfected أو غير مصاب) والسيطرة الايجابية (الفيروس الذي يعبر عن وGFP بوروميسين الجينات المقاومة). لخبط لأسفل exper shRNAiments ، تصيب بشكل جيد مع مشوشة أو غير ذات صلة shRNA السيطرة.
2. Transfecting BOSC 23 الخلايا
- تسخين زجاجات DMEM غير المعدلة وDMEM كاملة عند 37 درجة مئوية.
- إزالة وسائل الاعلام من الخلايا 23 BOSC واستبدالها مع 5 مل من DMEM كاملة. عودة إلى الخلايا الحاضنة 37 درجة مئوية حتى استخدامها في الخطوة 2.6.
- تدفئة زجاجة FuGENE 6 في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق ثم الدوامة لفترة وجيزة (<1 ثانية).
- قسامة 600 ميكرولتر DMEM غير المعدلة في أنبوب مل microcentrifuge 1.5.
- تمييع 30 ميكرولتر FuGENE 6 في DMEM 600 ميكرولتر غير المعدلة ، لفترة وجيزة دوامة (<1 ثانية) ، ثم يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. كن حذرا لماصة مباشرة في وسائل الإعلام. لا تدع 6 FuGENE تلمس جانبي الأنبوب.
- إضافة 6 ميكروغرام ، وإما بناء 4 ميكروغرام pKat2 (عدوى فيروس) أو 1.5 ميكروغرام لكل من pMDLg ، pVSV - G / pRRE ، والقس pRSV - (lentiviral العدوى) إلى مزيج DMEM 6 / FuGENE ، دوامة BRI efly (<1 ثانية) ، ثم يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 25 دقيقة.
- إضافة DNA / DMEM / 6 FuGENE المزيج إلى الخلايا BOSC 23 والعودة إلى الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
- بعد 24 ساعة ، إضافة 5 مل DMEM الكامل إلى الخلايا transfected والعودة إلى الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
3. حصاد الجسيمات الفيروسية
- حصاد 10 مل من وسائل الإعلام من الخلايا transfected 23 BOSC مع محقنة 10 مل.
- إرفاق 0.45 ميكرون تصفية لنهاية الحقنة وتصفية وسائل الاعلام الى تنظيف الانبوب البولي بروبلين 15 مل.
- استخدام وسائل الإعلام على الفور الفيروسية أو تجميد ك 1 مل aliquots في قارورة 2 مل المبردة في -80 درجة مئوية.
- بعد الحصاد وسائل الإعلام الفيروسية ، والتأكد من أن كفاءة ترنسفكأيشن حدث في الخلايا السيطرة الإيجابية التي FACS. ويمكن أيضا أن يتم ذلك بالنسبة لجميع العينات إذا كان يحتوي على إما بناء الفلورسنت (GFP مثلا) أو علامة سطح الخلية (مثل Thy1).
- البذور 2 مل من الخلايا 2 × 5 10 / مل الخلايا راموس في RPMI الكامل في لوحة 6 - جيدا قبل 24 ساعة من العدوى. مرة أخرى ، تأكد من استخدام الخلايا انخفاض عدد خلايا مرور أو إذابة مؤخرا لضمان حسن العدوى.
- إذا باستخدام aliquots المجمدة للفيروس ، تحسن وسائل الإعلام بسرعة الفيروسية في 37 درجة مئوية.
- مزيج سائل الإعلام مل 1 الفيروسية مع 3 ميكروليتر من polybrene ملغ / 10 مل. وينبغي تركيز النهائي من polybrene يكون 10 ميكروغرام / مل في الحجم الإجمالي من 3 مل.
- إضافة مزيج فيروس / polybrene إلى الخلايا ومزيج جيد من قبل pipetting. كما ذكر في وقت سابق ، واحد جيد وينبغي أن تستخدم كعنصر تحكم المعافين ؛ إضافة 1 مل RPMI كاملة و 3 polybrene ميكرولتر لذلك جيدا بدلا من الفيروس مل 1. لا شك أن تصيب بئر مع السيطرة على مطابقة سلبية. ونحن أيضا واحدة تصيب بشكل جيد مع ناقلات GFP المحتوية على ، لتحديد كفاءة العدوى عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية.
- الطرد المركزي لوحة 6 - X جيدا في 3000 ز لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- عودة إلى لوحةبنسبة 37 درجة مئوية الحاضنة لمدة 48 ساعة.
- بعد 48 ساعة ، وتدور باستمرار على الخلايا المصابة في أنبوب 15 مل من البولي بروبلين في ز X 400 لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة وسائل الاعلام الطموح ، ويجري التأكد من عدم تعكير صفو بيليه الخلية. Resuspend الخلايا في RPMI الطازجة.
- تأكيد الكفاءة من حالات العدوى في العينة الإيجابية التي تحكم نظام مراقبة الأصول الميدانية. كما كان من قبل ، يمكنك أن تفعل هذا لجميع العينات الخاصة بك إذا كان يحتوي على إما بناء الفلورسنت (GFP مثلا) أو علامة سطح الخلية (مثل Thy1).
- بدء اختيار الخلايا (عند الاقتضاء). لدينا shRNA المحتوية على بنيات تحتوي على كل شريط بوروميسين المقاومة. نختار shRNA الخلايا المصابة راموس مع 0.25 ميكروغرام / مل بوروميسين. نجد أن مشتقات الخلايا راموس أحيانا تظهر القابلية للتغيير بوروميسين ، وبالتالي نقوم بقتل المنحنيات لتحسين تركيز بوروميسين لكل المشتقة. علاج الخلايا أيضا السيطرة المعافين مع بوروميسين لتأكيد هذا الاختيار فعال.
لا يمكن أن يؤديها البذر واحدة في واحدة من طريقتين : من خلال نظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز أو يدويا.
- FACS : استخدام فارز FACS مع محول لوحة الخلية 1 البذور / بشكل جيد في لوحة 96 - جيدا قبل ملء مع 100 ميكرولتر من 40 ٪ RPMI/40 ٪ FBS media/20 ٪ مكيفة. هذا الأسلوب يعطي الكثير من الحيوانات المستنسخة خلية واحدة لكل لوحة.
- يدويا : عد الخلايا. تمييع an قسامة من الخلايا إلى 10 خلية / مل في 40 ٪ RPMI/40 ٪ مكيفة media/20 ٪ FBS. 10 مل من استخدام الخلايا المخفف لكل صفيحة المصنفة. وسوف يستنسخ مختلفة تظهر انتعاش المتغير في هذه المرحلة ولذلك فمن المفيد لاقامة لوحات عدة بتركيزات مختلفة (تتراوح من 3 إلى 20 زنزانة / مل). استخدام واحد التي تنتج أقل الامتداد لتفادي استنساخ ناشئة عن خلايا متعددة). استخدام ماصة الأقنية على البذور 96 - جيدا مع 100 لوحات من الخلايا ميكرولتر المخفف.
- وضع لوحة في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 2 اسابيع.
- الاختيار الفردي الآبار undeص المجهر للتأكد من وجود خلايا يوم واحد بعد البذر. يمكن أن تكون خادعة خلايا مفردة لإيجاد بسبب الحاجة إلى التركيز على العمق الصحيح. وينبغي التركيز على الأرقام جيدا مطبوع في الجزء السفلي من لوحة 96 - جيدا مساعدة. الخلايا هي الأسهل العثور على المصنفة من قبل عندما فارز FACS لأن معظم الآبار وخلية.
- 2 بعد أسابيع ، ويمكن تنامي المستعمرات المشاهدة بالعين المجردة بصعوبة من خلال النظر الى لوحات من أسفل. فهي أسهل بكثير لرؤية تحت المجهر. المستعمرات تميل إلى النمو على طول حواف المستعمرات بشكل جيد وعادة أكثر في لوحة تنمو على طول حافة نفسه في الآبار المختلفة. علامة الآبار مع نمو الخلايا قوية ، ونقل الخلايا إلى جانب 24 لوحات في RPMI مل (1) والعودة إلى الحاضنة 37 درجة مئوية.
- الحفاظ على الخلايا في 1 × 05-01 أكتوبر الخلايا 6 × 10 / مل. تغيير وسائل الإعلام من خلال الدوران في الخلايا ز X 400 لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وإزالة وسائل الاعلام حسب الحاجة. استبدال RPMI مل 1 الطازجة.
- بعد عدة دAYS النمو ، ونقل الخلايا إلى صفيحة 6 جيدا وتواصل نموها في الحاضنة 37 درجة مئوية.
- بعد 3 أسابيع ، وتحليل الحيوانات المستنسخة عن خسارة الغلوبولين المناعي (كما هو موضح أدناه).
- يستمر نمو الخلايا لمدة 2 اسابيع وتحليلها ثم استنساخ مرة أخرى في نقطة في الأسبوع الوقت 5.
6. تحليل : خسارة الغلوبولين المناعي (3 اسابيع واسابيع 5)
- قسامة 5 × 10 5 خلايا من كل بئر في أنبوب 1.5 مل microcentrifuge وتدور في خلايا أسفل ز X 400 لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة. استخدام خلايا من كل من آبار المراقبة وshRNA للخبط لأسفل ، فضلا عن عينة واحدة لعنصر تحكم غير ملوثين.
- غسل الخلايا في 1 مل من برنامج تلفزيوني وتدور ثم مرة أخرى في ز X 400 لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- Resuspend في 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني (مراقبة غير ملوثين) أو برنامج تلفزيوني + 01:20 تخفيف PE المسمى الضد α الغلوبولين المناعي البشري. احتضان على الجليد لمدة 1 ساعة.
- تدور الخلايا في أسفل ز X 400 لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- غسل جells مرتين مع 1 مل من برنامج تلفزيوني وتدور لز X 400 لمدة 4 دقائق في كل مرة في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة وطاف resuspend في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. نقل الخلايا معلق الملون لأنبوب FACS.
- تحليل الخلايا باستخدام جهاز مراقبة الأصول الميدانية.
- مقارنة النسبة المئوية للالغلوبولين المناعي -- الخلايا من الضوابط مقابل shRNA خلع الخلايا. كما لوحظ من قبل ، وخسارة الغلوبولين المناعي مقاسا FACS هو موثوق شبه قياس الكمي SHM في الخلايا راموس.
7. تحليل : تأكيد المغلوب بنسبة الكمية RT - PCR (5 أسابيع)
- قسامة 3 × 10 6 خلايا من كل بئر وتدور في أسفل ز X 400 لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- إعداد RNA من قسامة من الخلايا. نستخدم TRIzol وفقا لتوصيات الشركة الصانعة.
- يعد [كدنا] من الإعدادية الحمض النووي الريبي. نستخدم 2 ميكروغرام RNA والثاني مرتفع وفقا لتوصيات الشركة الصانعة.
- إجراء PCR الكمي باستخدام [كدنا] لconfirم تدق إلى أسفل. نستخدم GAPDH كعنصر تحكم التطبيع ، وعدة SYBR qPCR FAST في 10 ميكرولتر حجم رد الفعل الكلي.
8. تحليل : تسلسل الجينوم (5 أسابيع)
- قسامة 5 × 10 6 خلايا من كل بئر وتدور في أسفل ز X 400 لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- عزل الحمض النووي الجيني من هذه الخلايا. نستخدم الجينومية SV معالج الحمض النووي عدة لتنقية وفقا لتوصيات الشركة الصانعة.
- PCR تضخيم الحمض النووي الجيني للمورثات V الإيج 19 (الجدول 1) وأي الجينات الأخرى ذات الاهتمام باستخدام الحمض النووي كابا فاي بوليميريز. نستخدم هذه بوليميريز لما له من انخفاض معدلات الخطأ ، ولكن أي البلمرة PCR عالية الدقة يجب أن يكون مقبولا.
- هلام تنقية المنتجات PCR على هلام 1 ٪ agarose باستخدام هلام QIAquick استخراج الطقم.
- بعض polymerases إضافة deoxyadenosine واحد (A) لبقايا تاريخ 3 'من المنتجات PCR ، في حين أن البعض الآخر لا. هذه 3 'وذيول ضرورية لTA TOPOخطوة الاستنساخ. فاي كابا بوليميريز لا يترك 3 'وذيول. والذيل المنتجات التي يحتضنها PCR 25 ميكرولتر منتج PCR هلام المنقى مع 3 ميكروليتر 10X العازلة رد فعل طق ، 1 ميكرولتر dNTPs 10 مم ، و 1 في وحدة البلمرة طق 72 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- استنساخ هلام تنقية منتجات PCR باستخدام الاستنساخ TA TOPO عدة. تحويل المنتجات من ردود فعل TOPO في المقدمة E. القولونية DH5α R - T1 الخلايا المختصة وعلى لوحة LB / أجار لوحات تحتوي على 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين وتستكمل مع 1.6 ملغ من X - غال وفقا لتوصيات الشركة الصانعة.
- إرسال المستعمرات الفردية في التسلسل.
- إجراء تحليل لتحديد تسلسل الأنواع والمواقع من الطفرات.
9. ممثل النتائج :
كما لوحظ من قبل ، ونستخدم مكافحة ناقلات فيروسية الإيجابية التي تعبر عن كل من GFP فضلا عن الجينات بوروميسين مقاومة. نرى عادة 50-75 ٪ GFP + الخلايا يومينبعد ترنسفكأيشن. في العدوى لدينا ، ونحن نرى عادة 50-70 ٪ من الخلايا GFP + بعد يومين من الإصابة ، ولكن قبل الاختيار. بعد اكتمال التحديد ،> 95 ٪ من الخلايا + GFP.
والتجارب ممثل ، وتبين لنا من آثار AID overexpressing أو اسقاط عامل إصلاح في خلايا راموس. على وجه التحديد ، فإننا transfected متجه overexpression فيروسات لربط المساعدات عبر موقع IRES لThy1.1 مع pKat2 التعبئة ناقلات فيروسات في الخلايا BOSC 23. وكان الفيروس التي تحتوي على وسائل الاعلام التي تمت تصفيتها واستخدمت بعد ذلك لتصيب الخلايا راموس. كان كل نوع البرية (WT) والخلايا overexpressing AID (AID مرحبا) المصنفة خلية واحدة ونمت لمدة 3 أسابيع ، وعند هذه النقطة لأنها حللت التعبير الجيني التي qRT - PCR (الشكل 2) وخسارة الغلوبولين المناعي بواسطة FACS (الشكل 3 ). لتلطيخ FACS ، وحضنت مع كل من الخلايا 01:20 مخففة PE المسمى α الغلوبولين المناعي البشري الضد فضلا 1:400 المخفف FITC المسمى α - الفئران CD90/mouseCD90.1 (Thy1.1) الأجسام المضادة. في تجربة منفصلة ، أدلى lentiviruses تحتوي إما لا صلة لها بالموضوع shRNA (مراقبة) أو ضد shRNA عاملا عالية الدقة إصلاح الحمض النووي للحماية من المتوقع SHM 23 BOSC في الخلايا ، ومن ثم المصاب إلى معونة مرحبا استنساخ الخلايا راموس. مرة أخرى ، وقد تم تحليل التعبير الجيني (الشكل 4) وخسارة الغلوبولين المناعي (الشكل 5) في استنساخ خلية واحدة بعد 3 أسابيع. منذ يعتقد أن عامل التصليح لتوفير الحماية ضد الطفرات خلال SHM ، فإننا نرى زيادة في فقدان IgM و SHM في غياب عامل. إذا كنا قد خلع عامل يشارك في توليد SHM المرتبطة الطفرات ، وشهدنا انخفاضا في فقدان الغلوبولين المناعي بدلا من ذلك.
كما هو متوقع ، لدينا qRT - PCR أظهرت النتائج زيادة ملحوظة في التعبير AID بعد العدوى من الخلايا مع مساعدات متجه overexpression (الشكل 2) ، في حين أن مستويات انخفاض عامل إصلاح الحمض النووي في وجود shRNA موجهة ضد هذا العامل (الشكل 4 ). لأن الفرد نسيلةوفاق قد تختلف ، قد تشاهد بعض التباين في مستويات التعبير الجيني. لأن التعبير الجيني يمكن أن تختلف ، فمن الضروري للتأكد من التعبير في كل استنساخ كنت تخطط لمزيد من التحليل. قد shRNAs مختلفة ضد نفس الجين يكون لها تأثيرات مختلفة على التعبير الجيني أيضا ، لذا يجب عليك الشاشة shRNAs عديدة لتحديد الذي يحتوي على أكبر قدر من التأثير. ويمكن أيضا أن يكون ضربة قاضية وأكد على مستوى البروتين immunoblotting. وبالمثل ، قد استنساخ الفردية تختلف اختلافا كبيرا في مستويات الغلوبولين المناعي خسارة. بعض الحيوانات المستنسخة قد يبرهن على وجود "الجائزة الكبرى" تأثير ، التي يكون فيها طفرة الغلوبولين المناعي وقعت في واحدة من أقرب انقسامات الخلية -- على سبيل المثال ، سوف ترى> فقدان الغلوبولين المناعي 50 ٪ لمجرد واحدة من الخلايا أصبحت الغلوبولين المناعي -- في المرحلة الثانية الخلية. يتم التقليل من تأثير هذه الحيوانات المستنسخة عن طريق حساب متوسط لعدة استنساخ خلية واحدة.
الشكل 1. تخطيطي للالعابرةfection والعدوى وتحليل الخسارة الغلوبولين المناعي. انظر النص لمزيد من التفاصيل.
overexpression AID الرقم 2. راموس في الخلايا. وكان وزن AID الخلايا مرحبا راموس خلية واحدة مستنسخة ، ونمت لمدة 3 أسابيع ، حيث تم قياس نقطة التعبير AID في استنساخ الفردية qRT - PCR. وقد استخدم GAPDH التعبير عن التطبيع. تم تعيين WT إلى 1. يشار إلى أن قيمة المتوسط. * يشير إلى أب قيمة <0.01 ، كما يحسب للتجارب طن على الطالب الواحد في الذيل.
الشكل 3. زيادة فقدان الغلوبولين المناعي في الخلايا مرحبا مساعدات بالمقارنة مع خلايا وزن. وقد تم قياس السطح FACS الغلوبولين المناعي عند نقطة الاسبوع 3 مرة ، وكان احتساب النسبة المئوية للخسارة الغلوبولين المناعي للخلايا وزن ومرحبا AID. (أ) مؤامرة FACS ممثل استنساخ WT واستنساخ مرحبا AID. المعونة overexpression الخامسوقد ector مساعدات مرتبطة Thy1.1 عبر موقع IRES ، بحيث يتم استخدام التعبير Thy1.1 كبديل للتعبير عن المعونة. (ب) الكميات من الغلوبولين المناعي في فقدان وزن ومساعدات استنساخ عدة مرحبا. يشار إلى أن قيمة المتوسط. * يشير إلى أب قيمة <0.01 ، كما يحسب للتجارب طن على الطالب الواحد في الذيل.
الشكل 4. ضربة قاضية لعامل التصليح في الخلايا مرحبا AID. أصيب الخلايا إما مع عنصر تحكم shRNA غير ذي صلة (مراقبة) أو shRNA لدينا اهتمام (shRNA) ، وحيدة الخلية المصنف. بعد 3 أسابيع ، وقد تم قياس التعبير الجيني في الحيوانات المستنسخة الفردية qRT - PCR. وقد استخدم GAPDH التعبير عن التطبيع. تم تعيين WT إلى 1. يشار إلى أن قيمة المتوسط. * يشير إلى أب قيمة <0.01 ، كما يحسب للتجارب طن على الطالب الواحد في الذيل.
الشكل 5. زيادة فقدان الغلوبولين المناعيمرحبا في الخلايا مع مستويات المعونة خلع عامل التصليح. وقد تم قياس سطح الغلوبولين المناعي في استنساخ عدة FACS عند نقطة الاسبوع 3 مرة ، وكان احتساب النسبة المئوية للخسارة في AID الغلوبولين المناعي خلايا overexpressing تزال قائمة. يشار إلى أن قيمة المتوسط. * يشير إلى أب قيمة <0.01 ، كما يحسب للتجارب طن على الطالب الواحد في الذيل.
تسلسل الجدول التمهيدي (1) لجينات الإيج 19 : Cμ في المنطقة المستمر ، والثقيلة المنطقة سلسلة V (V H) ، والمنطقة على ضوء سلسلة V (V L).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
كما نوقش سابقا ، وأصبحت نماذج خط الخلية لتنويع الضد نقطة انطلاق لتحديد شعبية رواية البروتينات التي تؤثر على خطوات مختلفة خلال تنويع الأضداد. نقدم هنا طريقة لاستخدام عدوى فيروسية للبروتينات إما إلى أسفل ، أو تدق overexpress في خط B - الخلية راموس ومن ثم دراسة تأثير ذلك على SHM.
لهذه الدراسات ، ونحن نستخدم كل من راموس وWT AID الخلايا مرحبا راموس. ويمكن استخدام خلايا وزن لدراسة العوامل التي تدخل في استهداف أو التعبير عن المعونة فضلا عن إصلاح المساعدات المولدة الآفات ، في حين أن الخلايا مرحبا AID استبعاد العوامل التي تؤثر في التعبير AID.
وينبغي أيضا أن يلاحظ أن يقاس SHM هنا يعاير عن خسارة الغلوبولين المناعي من السكان من الخلايا التي هي في البداية + الغلوبولين المناعي. بدلا من ذلك ، فمن الممكن أن تبدأ مع الغلوبولين المناعي -- الخلايا والبحث عن مكسب من الخلايا + الغلوبولين المناعي في مقايسة الارتداد 23 </ P>
باستخدام علامات الاختيار مختلفة (على سبيل المثال بوروميسين ، هيغروميسين ، GFP ، أو Thy1.1) ، ويمكننا أيضا تنفيذ التهابات متعددة في نفس الوقت مع نفس البروتوكول. ومع ذلك ، فقد وجدنا أنه عند استخدام علامات مختلفين اختيار المضادات الحيوية ، والحساسيات من تغيير الخلايا. وسوف يكون من الضروري لتنفيذ منحنيات قتل إضافية لتحسين الظروف لاختيار مع اثنين من المضادات الحيوية في آن واحد. يمكننا بسهولة توليد المزدوج تدق هبوطا اثنين من العوامل المختلفة ، أو تدق إلى أسفل من عامل واحد زائد overexpression من الآخر ، الخ.
وقد تكيفت نحن أيضا هذا البروتوكول لنماذج B - خلية الخط الآخر كذلك. على سبيل المثال ، مع CH12F3 - 2 الخلايا (ماوس B - خط خلوي تستخدم لدراسة CSR) 26،27 ، يمكن استخدام نفس الخطوات عدوى تصيب 1 × 10 6 CH12F3 - 2 الخلايا المصنفة في يوم من العدوى (تباين الخطوة 4.1). ويتم اختيار هذه الخلايا مع 1 ميكروغرام / مل من بوروميسين. وبالمثل ، يمكن لنفس البروتوكول أيضاتستعمل لخلايا DT40 الدجاج -- نموذج لخلية خط AID - بدأت تحويل الجينات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وpMSCV - AID - I - Thy1.1 pKat2 وناقلات وهدية عينية من المديرية العامة للكاتس وpVSV - G ، pRSV رؤيا ، وpMDLg / pRRE ناقلات كانت هدية من نوع كولين BR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Suggested reagents - most of these may be substituted with similar products from other vendors. | |||
| 6-well clear TC-treated plates | Corning | 3516 | |
| 10 mL BD Luer-Loksyringes | BD Biosciences | 309604 | |
| 24-well clear TC-treated plates | Corning | 3526 | |
| 96-well clear flat bottom polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3596 | |
| 100 mm TC-treated culture dishes | Corning | 430167 | |
| Acrodisc syringe filters, 0.45 μm | Pall Corporation | 4604 | |
| Agar | TEKnova, Inc. | A7777 | |
| Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A0166 | 100 mg/mL in water |
| BD FACSCanto II flow cytometer | BD Biosciences | or similar | |
| BD Falcon round bottom polystyrene tubes | BD Biosciences | 352054 | for FACS |
| BOSC 23 cells | ATCC | CRL-11270 | |
| CO2 incubator capable of 37°C | |||
| DMEM (Dulbecco′s modified Eagle′s medium) | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| FBS (fetal bovine serum) | Gemini Bio Products | 100-106 | |
| FITC α-rat CD90/mouse CD90.1 antibody | BioLegend | 202503 | FITC α-Thy1.1 |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Roche Group | 11814443001 | |
| HEPES buffer solution | Invitrogen | 15630-080 | |
| KAPA HiFi DNA polymerase | KAPA Biosystems | KK2101 | |
| LB Broth (lysogeny broth - Luria) Powder | Difco Laboratories | 240230 | |
| MISSION TRC shRNA bacterial glycerol stock | Sigma-Aldrich | shRNA vectors | |
| NCS (newborn calf serum) | Gemini Bio Products | 100-504 | |
| PBS (phosphate buffered solution) | Invitrogen | 70011 | diluted to 1x in water |
| PE α-human IgM antibody | BioLegend | 314508 | |
| PGS (penicillin-streptomycin-glutamine solution) | Gemini Bio Products | 400-110 | |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 107689 | 10 mg/mL in water |
| PureYield Plasmid Midiprep System | Promega Corp. | A2495 | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | 250 μg/mL in water |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28706 | |
| Ramos (RA 1) cells | ATCC | CRL-1596 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| SuperScript II | Invitrogen | 18064-022 | |
| SYBR FAST qPCR kit | KAPA Biosystems | KK4601 | |
| Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 18038-042 | |
| TOPO TA Cloning kit | Invitrogen | K4520-01 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596-026 | |
| Wizard SV Genomic DNA purification system | Promega Corp. | A2361 | |
| X-Gal [5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galatopyranoside] | Growcells | C-5687 | 40 mg/mL in DMSO |
References
- Di Noia, J. M., Neuberger, M. S. Molecular mechanisms of antibody somatic hypermutation. Annu. Rev. Biochem. 76, 1-22 (2007).
- Peled, J. U.
- Longerich, S., Basu, U., Alt, F., Storb, U. AID in somatic hypermutation and class switch recombination. Curr. Opin. Immunol. 18, 164-174 (2006).
- Bardwell, P. D. Altered somatic hypermutation and reduced class-switch recombination in exonuclease 1-mutant mice. Nat. Immunol. 5, 224-229 (2004).
- Martomo, S. A., Yang, W. W., Gearhart, P. J. A role for Msh6 but not Msh3 in somatic hypermutation and class switch recombination. J. Exp. Med. 200, 61-68 (2004).
- Phung, Q. H. Increased hypermutation at G and C nucleotides in immunoglobulin variable genes from mice deficient in the MSH2 mismatch repair protein. J. Exp. Med. 187, 1745-1751 (1998).
- Rada, C., Ehrenstein, M. R., Neuberger, M. S., Milstein, C. Hot spot focusing of somatic hypermutation in MSH2-deficient mice suggests two stages of mutational targeting. Immunity. 9, 135-141 (1998).
- Rada, C. Immunoglobulin isotype switching is inhibited and somatic hypermutation perturbed in UNG-deficient mice. Curr. Biol. 12, 1748-1755 (2002).
- Delbos, F., Aoufouchi, S., Faili, A., Weill, J. C., Reynaud, C. A. DNA polymerase eta is the sole contributor of A/T modifications during immunoglobulin gene hypermutation in the mouse. J. Exp. Med. 204, 17-23 (2007).
- Masuda, K. DNA polymerase eta is a limiting factor for A:T mutations in Ig genes and contributes to antibody affinity maturation. Eur. J. Immunol. 38, 2796-2805 (2008).
- Lim, D. S., Hasty, P. A mutation in mouse rad51 results in an early embryonic lethal that is suppressed by a mutation in p53. Mol. Cell. Biol. 16, 7133-7143 (1996).
- Xiao, Y., Weaver, D. T. Conditional gene targeted deletion by Cre recombinase demonstrates the requirement for the double-strand break repair Mre11 protein in murine embryonic stem cells. Nucleic. Acids. Res. 25, 2985-2991 (1997).
- Zhu, J., Petersen, S., Tessarollo, L., Nussenzweig, A. Targeted disruption of the Nijmegen breakage syndrome gene NBS1 leads to early embryonic lethality in mice. Curr. Biol. 11, 105-109 (2001).
- Luo, G. Disruption of mRad50 causes embryonic stem cell lethality, abnormal embryonic development, and sensitivity to ionizing radiation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7376-7381 (1999).
- Pavri, R. Activation-induced cytidine deaminase targets DNA at sites of RNA polymerase II stalling by interaction with Spt5. Cell. 143, 122-133 (2010).
- Lee-Theilen, M., Matthews, A. J., Kelly, D., Zheng, S., Chaudhuri, J. CtIP promotes microhomology-mediated alternative end joining during class-switch recombination. Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 75-79 (2011).
- Basu, U. The RNA exosome targets the AID cytidine deaminase to both strands of transcribed duplex DNA substrates. Cell. 144, 353-363 (2011).
- Yabuki, M., Fujii, M. M., Maizels, N. The MRE11-RAD50-NBS1 complex accelerates somatic hypermutation and gene conversion of immunoglobulin variable regions. Nat. Immunol. 6, 730-736 (2005).
- Sale, J. E., Neuberger, M. S. TdT-accessible breaks are scattered over the immunoglobulin V domain in a constitutively hypermutating B cell line. Immunity. 9, 859-869 (1998).
- Cumbers, S. J. Generation and iterative affinity maturation of antibodies in vitro using hypermutating B-cell lines. Nat. Biotechnol. 20, 1129-1134 (2002).
- Papavasiliou, F. N., Schatz, D. G. Cell-cycle-regulated DNA double-stranded breaks in somatic hypermutation of immunoglobulin genes. Nature. 408, 216-221 (2000).
- Parsa, J. Y. AID mutates a non-immunoglobulin transgene independent of chromosomal position. Mol. Immunol. 44, 567-575 (2007).
- Zhang, W. Clonal instability of V region hypermutation in the Ramos Burkitt's lymphoma cell line. Int. Immunol. 13, 1175-1184 (2001).
- Ukai, A. Induction of a:T mutations is dependent on cellular environment but independent of mutation frequency and target gene location. J. Immunol. 181, 7835-7842 (2008).
- Dull, T. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J. Virol. 72, 8463-8471 (1998).
- Nakamura, M. High frequency class switching of an IgM+ B lymphoma clone CH12F3 to IgA+ cells. Int. Immunol. 8, 193-201 (1996).
- Muramatsu, M. Specific expression of activation-induced cytidine deaminase (AID), a novel member of the RNA-editing deaminase family in germinal center B cells. J. Biol. Chem. 274, 18470-18476 (1999).
