نحن تصف كيفية تنفيذ فيروسات أو التهابات lentiviral من overexpression shRNA أو المحتوية. يبني الإنسان راموس في الخلية B الخط وكيفية قياس جسدية hypermutation في هذه الخلايا
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تقييم Hypermutation الجسدية في خلايا B راموس بعد Overexpression أو ضربة قاضية لجينات معينة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
خلايا B تبدأ حياتها مع الأجسام المضادة الناتجة عن انخفاض تقارب تأشب الخامس J (D). ومع ذلك ، بناء على الكشف عن العوامل المسببة للأمراض ، وتحور المتغير (V) المنطقة من الجين (IG) الغلوبولين المناعي ما يقرب من 100،000 مرات أكثر من بقية الجينوم خلال hypermutation جسدية (SHM) ، مما أدى إلى ارتفاع تقارب 1،2 الأضداد. بالإضافة إلى ذلك ، فئة التوحد التبديل (CSR) وتنتج الأجسام المضادة مع وظائف المستجيب مختلفة تبعا لنوع من رد الفعل المناعي ان هناك حاجة لعامل ممرض معين. وبدأ كل من المسؤولية الاجتماعية للشركات والتي SHM نازعة أمين سيتيدين التنشيط التي يسببها (AID) ، والتي deaminates مخلفات السيتوزين في الحمض النووي لانتاج uracils. تتم معالجة هذه uracils بأشكال عرضة للخطأ من مسارات الإصلاح ، مما يؤدي في النهاية إلى حدوث طفرات وإعادة التركيب 1-3.
فهمنا الحالي للتفاصيل الجزيئي للSHM والمسؤولية الاجتماعية للشركات تأتي من مجموعة من الدراسات التي أجريت في الفئران وخلايا الأولية ، وخطوط الخلية ، والخلية F -ري التجارب. نماذج الماوس تبقى المعيار الذهبي مع بالضربة القاضية الجينية تظهر أدوارا حاسمة لعوامل كثيرة إصلاح (على سبيل المثال اونغ ، MSH2 ، Msh6 ، Exo1 وبوليميريز η) 40-10. ومع ذلك ، ليس كل الجينات قابلة للدراسات خروج المغلوب. على سبيل المثال ، بالضربة القاضية من عدة مزدوج الجديلة البروتينات إصلاح كسر مميتة بشكل أولي أو يضعف B - الخلية التنمية 11-14. وعلاوة على ذلك ، قد تكون في بعض الأحيان ملثمين وظيفة معينة من البروتين في SHM أو المسؤولية الاجتماعية للشركات عن عيوب أكثر عالمية بسبب خروج المغلوب. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن منذ التجارب على الفئران أن تكون طويلة ، وتغيير تعبير الجينات الفردية في خطوط الخلايا قد تصبح خطوة شعبية متزايدة الأولى لتحديد وتوصيف الجينات مرشح 15-18.
وقد تم شعبية الخلية سطر نموذج لدراسة SHM 18-24 -- راموس -- خلية سرطان الغدد الليمفاوية بيركيت الخط الذي يمر constitutively SHM. ميزة واحدة من الخلايا راموس هو أن لديهم المدمج في شبه مريحةقياس كمي للSHM. خلايا التعبير عن نوع IgM و البرية ، لأنها تلتقط الطفرات ، وبعض من الطفرات ضرب التعبير الغلوبولين المناعي. لذلك ، يعاير خسارة الغلوبولين المناعي عن طريق المسح الضوئي مضان تنشيط الخلايا (FACS) يوفر قراءة سريعة التدريجي لمستوى SHM. ويمكن الحصول على مزيد من القياس الكمي للSHM بواسطة تسلسل الجينات مباشرة الأضداد.
منذ الخلايا راموس يصعب transfect ، ونحن ننتج المشتقات المستقرة التي زادت أو خفضت التعبير عن الجينات الفردية التي تصيب الخلايا مع فيروسات أو يبني lentiviral التي تحتوي إما على كاسيت أو overexpression قصيرة الحمض النووي الريبي القاسي (shRNA) ، على التوالي. هنا ، نحن تصف كيف تصيب الخلايا راموس ومن ثم استخدام هذه الخلايا لبحث دور للجينات محددة بشأن SHM (الشكل 1).
البروتوكول
1. إعداد العينات والخلايا
- تنفيذ إعداد المتوسطة الحجم من الحمض النووي (midiprep) من overexpression shRNA أو المحتوية. يبني وناقلات التعبئة pKat2 فيروسات أو ناقلات التعبئة lentiviral pVSV - G ، pMDLg / pRRE ، والقس pRSV - 25 6 استخدام الحمض النووي ميكروغرام لكل بناء وإما 4 ميكروغرام من pKat2 (للعدوى فيروسات) أو 1.5 ميكروغرام الحمض النووي لكل من pMDLg ، pVSV - ز / pRRE وناقلات التعبئة pRSV - REV (للعدوى lentiviral).
- إعداد BOSC 23 وسائل الإعلام. لترنسفكأيشن ، استخدام كل Dulbecco غير....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
كما نوقش سابقا ، وأصبحت نماذج خط الخلية لتنويع الضد نقطة انطلاق لتحديد شعبية رواية البروتينات التي تؤثر على خطوات مختلفة خلال تنويع الأضداد. نقدم هنا طريقة لاستخدام عدوى فيروسية للبروتينات إما إلى أسفل ، أو تدق overexpress في خط B - الخلية راموس ومن ثم دراسة تأثير ذلك على SHM.
لهذه الدراسات ، ونحن نستخدم كل من راموس وWT AID الخلايا مرحبا راموس. ويمكن استخدام خلايا وزن لدراسة العوامل التي تدخل في استهدا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
وpMSCV - AID - I - Thy1.1 pKat2 وناقلات وهدية عينية من المديرية العامة للكاتس وpVSV - G ، pRSV رؤيا ، وpMDLg / pRRE ناقلات كانت هدية من نوع كولين BR.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
ويمكن استبدال معظم هذه مع المنتجات المماثلة من الشركات الأخرى -- الكواشف المقترحة.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم الكاشف | شركة | فهرس العدد | تعليقات |
| 6 - TC جيدا واضحة لمعاملة لوحات | كورنينج | 3516 | |
| 10 مل BD - Luer Loksyringes | دينار بحريني الطبية | 309604 | |
| 24 - TC جيدا واضحة لمعاملة لوحات | كورنينج | 3526 | |
| 96 - جيدا واضحة البوليسترين مسطحة القاع TC المعاملة microplates | كورنينج | 3596 | |
| 100 ملم الأطباق الثقافة TC المعالجة | كورنينج | 430167 | |
| مرشحات حقنة Acrodisc ، 0.45 ميكرون | بظلالها العلوم الحياتية | 4604 | |
| آغار | Teknova | A7777 | |
| Agarose | GeneMate | E - 3120 - 500 | |
| أمبيسيلين | سيغما | A0166 | 100 ملغ / مل في الماء |
| دينار بحريني تدفق الثاني FACSCanto عداد الكريات | العلوم البيولوجية دينار بحريني | أو ما شابه ذلك | |
| دينار بحريني أسفل أنابيب الجولة فالكون البوليسترين | العلوم البيولوجية دينار بحريني | 352054 | لFACS |
| 23 BOSC الخلايا | ATCC | CRL - 11270 | |
| CO 2 حاضنة قادرة على 37 درجة مئوية | |||
| DMEM (وسط Dulbecco لتعديل النسر) | سيغما | D6429 | |
| FBS (مصل بقري جنيني) | الجوزاء المنتجات الحيوية | 100-106 | |
| FITC α - الفئران CD90/mouse CD90.1 الأضداد | BioLegend | 202503 | FITCα - Thy1.1 |
| FuGENE الكاشف ترنسفكأيشن 6 | روش | 11814443001 | |
| HEPES العازلة الحل | Invitrogen | 15630-080 | |
| فاي كابا بوليميريز الحامض النووي | كابا النظم البيولوجية | KK2101 | |
| LB الحساء (المرق lysogeny -- لوريا) مسحوق | Difco | 240230 | |
| بعثة TRC shRNA الأسهم الجلسرين البكتيرية | سيغما | ناقلات shRNA | |
| NCS (العجل الوليد المصل) | الجوزاء المنتجات الحيوية | 100-504 | |
| PBS (الفوسفات حل مخزنة) | Invitrogen | 70011 | المخفف في الماء ل1X |
| PE الضد α الغلوبولين المناعي البشري | BioLegend | 314508 | |
| PGS (البنسلين ، الستربتومايسين ، الجلوتامين الحل) | الجوزاء بيو - PRODUCTS | 400-110 | |
| Polybrene (hexadimethrine الميثيل) | سيغما | 107689 | 10 ملغ / مل في الماء |
| PureYield نظام Midiprep البلازميد | Promega | A2495 | |
| بوروميسين | سيغما | P8833 | 250 ميكروغرام / مل في الماء |
| QIAquick هلام استخراج طقم | QIAGEN | 28706 | |
| راموس (RA 1) الخلايا | ATCC | CRL - 1596 | |
| RPMI المتوسطة - 1640 | سيغما | R8758 | |
| مرتفع الثاني | Invitrogen | 18064-022 | |
| SYBR FAST qPCR طقم | كابا النظم البيولوجية | KK4601 | |
| طق بوليميراز الدنا | Invitrogen | 18038-042 | |
| TOPO TA استنساخ عدة | Invitroالجنرال | K4520 - 01 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596-026 | |
| المعالج الحمض النووي الجينوم SV تنقية النظام | Promega | A2361 | |
| X - غال [5 - 4 - برومو كلورو - 3 - β - indoyl - D - galatopyranoside] | Growcells | C - 5687 | 40 ملغ / مل في DMSO |
المراجع
- Di Noia, J. M., Neuberger, M. S. Molecular mechanisms of antibody somatic hypermutation. Annu. Rev. Biochem. 76, 1-22 (2007).
- Peled, J. U. The biochemistry of somatic hypermutation. Annu. Rev. Immunol. 26, 481-511 (2008).
- Longerich, S., Basu, U., Alt, F., Storb, U.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
