Summary
हम वर्णन कैसे प्रदर्शन करने के लिए overexpression या shRNA मानव रामोस बी कोशिका लाइन में और कैसे इन कोशिकाओं में दैहिक hypermutation उपाय constructs युक्त. रेट्रोवायरल या lentiviral संक्रमण
Protocol
1. तैयारी के नमूने और कोशिकाओं
- Overexpression या shRNA constructs और रेट्रोवायरल पैकेजिंग वेक्टर pKat2 या lentiviral पैकेजिंग pVSV जी pMDLg / pRRE, और 25 pRSV - रेव वैक्टर युक्त. डीएनए (midiprep) के एक मध्यम पैमाने पर तैयारी करें 6 μg डीएनए प्रत्येक का निर्माण के लिए और या तो pKat2 के 4 μg (रेट्रोवायरल संक्रमण के लिए) या pVSV - जी, / pMDLg pRRE प्रत्येक के लिए 1.5 μg डीएनए, और pRSV रेव पैकेजिंग वैक्टर (lentiviral संक्रमण के लिए) का उपयोग करें.
- BOSC 23 मीडिया तैयार करें. अभिकर्मक के लिए, दोनों unamended Dulbecco संशोधित ईगल (DMEM) के माध्यम के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पूरा DMEM का उपयोग करें. पूरा DMEM बनाने के लिए, DMEM की एक बोतल के लिए 1% HEPES बफर, 1% पेनिसिलिन - स्ट्रेप्टोमाइसिन-glutamine (PGS), और 10% नवजात बछड़ा सीरम (NCS) जोड़ें.
- रामोस मीडिया तैयार है. संक्रमण कदम के लिए, RPMI की एक बोतल के लिए HEPES 1%, 1% PGS, और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) जोड़कर RPMI - १,६४० मध्यम (RPMI) पूर्ण बनाते हैं. एकल कक्ष बोने कदम मीटर के लिएake "कंडीशन" पूरा RPMI रामोस कोशिकाओं में 2 दिनों के लिए बढ़ नीचे कताई कोशिकाओं नीचे 4 मिनट के लिए 400 एक्स जी पर और एक 0.2 सुक्ष्ममापी एक बाँझ बोतल में फिल्टर के साथ सतह पर तैरनेवाला फ़िल्टरिंग मीडिया. अन्य पूरा मीडिया की तरह वातानुकूलित मीडिया 4 में संग्रहीत डिग्री सेल्सियस जब तक की जरूरत है.
- 3 भाजित x 10 10 एमएल पूरा DMEM में 100 मिमी की थाली में 6 BOSC 23 अभिकर्मक पहले दिन इतना कोशिकाओं कि कोशिकाओं को 50-60% में अभिकर्मक के confluency दिन किया जाएगा. प्रत्येक सदिश तुम transfecting पर योजना के लिए कक्षों की एक थाली करें. यह महत्वपूर्ण है कि संस्कृति में कोशिकाओं भी लंबे समय के लिए नहीं रखा किया गया है, दोनों अभिकर्मक और संक्रमण चरणों के लिए एक अच्छा संक्रमण बीमा के लिए कम बीतने संख्या कोशिकाओं या हाल ही में thawed कोशिकाओं का उपयोग.
- अपने प्रयोगों के लिए नियंत्रण शामिल हैं. Transfections और संक्रमण के लिए एक नकारात्मक (untransfected या असंक्रमित कोशिकाओं) नियंत्रण और एक सकारात्मक नियंत्रण (वायरस है कि GFP और puromycin प्रतिरोध जीन व्यक्त) बनाने के लिए. ShRNA exper दस्तक नीचे के लिएiments, तले हुए या अप्रासंगिक shRNA नियंत्रण के साथ एक अच्छी तरह से संक्रमित है.
2. Transfecting BOSC 23 कोशिकाओं
- 37 पर unamended DMEM और पूरा DMEM की बोतलें गर्म डिग्री सेल्सियस
- BOSC 23 कोशिकाओं से मीडिया निकालें और पूरा DMEM के 5 एमएल के साथ की जगह. 2.6 चरण में उपयोग करें जब तक एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कोशिकाओं लौटें.
- तो संक्षेप में भंवर (<1 सेकंड) 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 6 FuGENE की बोतल गर्म.
- एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में 600 μL unamended DMEM अशेष भाजक.
- 600 μL unamended DMEM, भंवर संक्षिप्त (<1 सेकंड) में 30 μL 6 FuGENE पतला, और फिर पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते. मीडिया में सीधे विंदुक सावधान रहें. FuGENE 6 ट्यूब के पक्षों को छूने मत करो.
- 6 μg का निर्माण और 4 या तो pKat2 μg (रेट्रोवायरल संक्रमण) या 1.5 μg pVSV जी pMDLg / pRRE के प्रत्येक, और pRSV Rev (lentiviral संक्रमण) / DMEM FuGENE 6 मिश्रण, भंवर bri में जोड़ें efly (<1 सेकंड), और फिर 25 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
- BOSC 23 कोशिकाओं के लिए डीएनए / / DMEM FuGENE 6 मिश्रण जोड़ें और 24 घंटे के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर पर लौटने.
- 24 घंटे के बाद, ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को 5 एमएल पूरा DMEM जोड़ सकते हैं और एक और 24 घंटे के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर पर लौटने.
3. वायरल कणों फसल काटने वाले
- एक 10 एमएल सिरिंज के साथ ट्रांसफ़ेक्ट BOSC 23 कोशिकाओं से मीडिया के 10 एमएल हार्वेस्ट.
- एक 0.45 सुक्ष्ममापी सिरिंज के अंत करने के लिए फिल्टर संलग्न है और एक साफ 15 एमएल polypropylene ट्यूब में मीडिया फिल्टर.
- तुरंत वायरल मीडिया का प्रयोग करें या -80 पर 1 2 एमएल क्रायोजेनिक शीशियों में एमएल aliquots के रूप में स्थिर डिग्री सेल्सियस
- वायरल मीडिया की कटाई के बाद की पुष्टि, कि कुशल अभिकर्मक FACS द्वारा सकारात्मक नियंत्रण कक्षों में हुई है. यह भी सभी नमूनों के लिए किया जा सकता है यदि का निर्माण या तो एक फ्लोरोसेंट (जैसे GFP) या एक सेल सतह मार्कर (Thy1 उदाहरण के लिए) शामिल हैं.
- बीज 2 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल रामोस कोशिकाओं को संक्रमण से पहले 24 घंटे 6 अच्छी तरह से एक थाली में पूरा RPMI में की 2 एमएल . फिर, कम बीतने संख्या कोशिकाओं या हाल ही में thawed कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए अच्छा संक्रमण बीमा करने के लिए सुनिश्चित हो.
- यदि वायरस की जमी aliquots का उपयोग कर, वायरल मीडिया 37 पर जल्दी गल डिग्री सेल्सियस
- 1 एमएल वायरल मीडिया 10 मिलीग्राम / एमएल polybrene 3 μL के साथ मिक्स. polybrene के अंतिम एकाग्रता 10 μg / एमएल 3 एमएल की कुल मात्रा में किया जाना चाहिए.
- कोशिकाओं को वायरस / polybrene मिश्रण जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से pipetting द्वारा. अच्छी तरह से बजाय 1 एमएल वायरस 1 एमएल पूरा RPMI और 3 μL polybrene जोड़ने, पहले, एक अच्छी तरह से एक असंक्रमित नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए उल्लेख किया है. एक मिलान नकारात्मक नियंत्रण के साथ एक अच्छी तरह से संक्रमित करने के लिए सुनिश्चित करें. हम भी एक अच्छी तरह से एक वेक्टर GFP युक्त के साथ, संक्रमित FACS द्वारा संक्रमण दक्षता का निर्धारण.
- कमरे के तापमान पर 90 मिनट के लिए 3000 एक्स जी पर 6 अच्छी तरह से थाली अपकेंद्रित्र.
- थाली लौटें48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर.
- 48 घंटे के बाद, कमरे के तापमान पर 4 मिनट के लिए नीचे एक 15 एमएल polypropylene ट्यूब में संक्रमित कोशिकाओं 400 एक्स जी पर स्पिन. आकांक्षा से मीडिया निकालें, सेल गोली परेशान नहीं करने के लिए सुनिश्चित किया जा रहा है. ताजा RPMI में कोशिकाओं Resuspend.
- FACS द्वारा सकारात्मक नियंत्रण नमूने में संक्रमण की दक्षता की पुष्टि करें. पहले के रूप में, आप अपने सभी नमूनों के लिए यह करने के यदि का निर्माण या तो एक फ्लोरोसेंट (जैसे GFP) या एक सेल सतह मार्कर (Thy1 उदाहरण के लिए) शामिल कर सकते हैं.
- कक्षों के चयन के प्रारंभ (यदि उपयुक्त हो). हमारे shRNA युक्त constructs सभी puromycin प्रतिरोध कैसेट होते हैं. हम 0.25 μg / एमएल puromycin के साथ shRNA संक्रमित रामोस कक्षों का चयन करें. हम पाते हैं कि रामोस कोशिकाओं के डेरिवेटिव कभी कभी संवेदनशीलता puromycin बदल दिखाने के और, इसलिए, हम को मारने के लिए घटता प्रत्येक व्युत्पन्न के लिए puromycin की एकाग्रता का अनुकूलन प्रदर्शन. इसके अलावा puromycin साथ असंक्रमित नियंत्रण कोशिकाओं का इलाज पुष्टि है कि चयन प्रभावी है.
एकल बोने दो तरीकों में से एक में किया जा सकता है: छँटाई या मैन्युअल FACS द्वारा.
- FACS: बीज एक सेल करने के लिए एक थाली अनुकूलक के साथ एक FACS सॉर्टर का प्रयोग करें / अच्छी तरह से एक 96 अच्छी तरह से थाली में 40% RPMI/40% वातानुकूलित media/20% FBS 100 μL के साथ पहले से भरे. इस पद्धति का एक बहुत अधिक एकल थाली प्रति सेल क्लोनों देता है.
- मैन्युअली: कोशिकाओं की गणना. 10 कोशिकाओं / एमएल कोशिकाओं के 40% RPMI/40% वातानुकूलित media/20% FBS में एक विभाज्य पतला. प्रत्येक वरीयता प्राप्त प्लेट के लिए पतला कोशिकाओं के 10 एमएल का प्रयोग करें. इस चरण में विभिन्न क्लोन चर वसूली दिखाने इसलिए इसे विभिन्न सांद्रता (3 से 20 कोशिकाओं / एमएल से लेकर) में कई प्लेटें सेट करने के लिए उपयोगी है. एक है कि उत्पादन कम करने के लिए एकाधिक कोशिकाओं से उत्पन्न होने वाली क्लोन से बचने outgrowths) का प्रयोग करें. पतला कोशिकाओं के 100 μL के साथ प्लेटें 96 अच्छी तरह से बीज के लिए एक multichannel विंदुक प्रयोग करें.
- 2 सप्ताह के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में थाली प्लेस.
- व्यक्तिगत कुओं unde की जाँच करेंआर बोने के बाद एक दिन कोशिकाओं की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए माइक्रोस्कोप. सिंगल कोशिकाओं सही गहराई पर ध्यान केंद्रित करने की आवश्यकता के कारण खोजने मुश्किल हो सकता है. अच्छी तरह से 96 अच्छी तरह से थाली के तल पर अंकित नंबर पर केंद्रित की मदद करनी चाहिए. कक्ष पाते हैं जब FACS सॉर्टर द्वारा वरीयता प्राप्त के बाद से ज्यादातर कुओं एक सेल आसान हैं.
- 2 सप्ताह के बाद, बढ़ रही कालोनियों बमुश्किल नीचे से प्लेटें देखकर किया जा सकता है नग्न आंखों से देखा. वे खुर्दबीन के नीचे देखना बहुत आसान हैं. कालोनियों अच्छी तरह से एक थाली में अलग कुओं में ही बढ़त के साथ बढ़ता है और आमतौर पर सबसे अधिक कालोनियों के किनारों के साथ बढ़ने करते हैं. मजबूत सेल के विकास के साथ मार्क कुओं और 1 एमएल RPMI में 24 अच्छी तरह प्लेटें कोशिकाओं को हस्तांतरण और एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर पर लौटने.
- 1 x 10 5 1 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल कोशिकाओं को बनाए रखें . कमरे के तापमान पर 4 मिनट के लिए 400 एक्स छ कोशिकाओं कताई और मीडिया को हटाने के रूप में की जरूरत के द्वारा मीडिया को बदलें. 1 एमएल ताजा RPMI के साथ बदलें.
- कई घ के बादविकास के ays, 6 अच्छी तरह से एक थाली कोशिकाओं को हस्तांतरण और एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में बढ़ती जारी है.
- 3 सप्ताह के बाद, आईजीएम हानि (नीचे के रूप में वर्णित है) के लिए क्लोन का विश्लेषण.
- अधिक 2 सप्ताह के लिए कोशिकाओं के विकास को जारी रखें और फिर क्लोन 5 सप्ताह समय बिंदु पर फिर से विश्लेषण.
6. विश्लेषण: आईजीएम हानि (3 सप्ताह और 5 सप्ताह)
- 5 अशेष भाजक एक्स 10 एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में 5 प्रत्येक में अच्छी तरह से कोशिकाओं और कोशिकाओं स्पिन नीचे कमरे के तापमान पर 4 मिनट के लिए 400 एक्स जी पर . एक अस्थिर नियंत्रण के लिए नियंत्रण और shRNA दस्तक नीचे कुओं में से प्रत्येक से कोशिकाओं, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक नमूना का उपयोग करें.
- पीबीएस के 1 एमएल में कोशिकाओं को धो और तो 400 एक्स जी पर फिर से कमरे के तापमान पर 4 मिनट के लिए स्पिन.
- पीबीएस (बेदाग नियंत्रण) या पीबीएस के 50 μL में Resuspend + पीई लेबल α मानव आईजीएम एंटीबॉडी के कमजोर पड़ने 1:20. 1 घंटे के लिए बर्फ पर सेते हैं.
- कोशिकाओं स्पिन नीचे कमरे के तापमान पर 4 मिनट के लिए 400 एक्स जी पर.
- ग धो400 एक्स जी के लिए 1 पीबीएस और स्पिन के 4 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एमएल हर बार के साथ दो बार ells.
- सतह पर तैरनेवाला और पीबीएस के 100 μL में resuspend निकालें. एक FACS ट्यूब resuspended दाग कोशिकाओं स्थानांतरण.
- एक FACS मशीन का उपयोग कोशिकाओं का विश्लेषण.
- खटखटाया नीचे कोशिकाओं shRNA बनाम नियंत्रण से कोशिकाओं - आईजीएम के प्रतिशत की तुलना करें. जैसा कि पहले उल्लेख किया, आईजीएम हानि के रूप में FACS द्वारा मापा रामोस कोशिकाओं में एक विश्वसनीय अर्द्ध मात्रात्मक SHM के उपाय है.
7. विश्लेषण: मात्रात्मक RT-पीसीआर (5 सप्ताह) द्वारा तोड़े नीचे की पुष्टि करें
- 3 अशेष भाजक x 10 प्रत्येक में अच्छी तरह से 6 कोशिकाओं और कमरे के तापमान पर 4 मिनट के लिए 400 एक्स जी पर नीचे स्पिन .
- शाही सेना कोशिकाओं की अशेष भाजक से तैयार करें. हम निर्माता की सिफारिशों के अनुसार TRIzol उपयोग.
- शाही सेना प्रस्तुत करने से सीडीएनए तैयार करें. हम निर्माता की सिफारिशों के अनुसार 2 μg शाही सेना और सुपरस्क्रिप्ट द्वितीय का उपयोग करें.
- एक मात्रात्मक पीसीआर सीडीएनए का उपयोग करने के लिए confir प्रदर्शनमीटर नीचे दस्तक. हम एक सामान्य नियंत्रण, और एक 10 μL कुल प्रतिक्रिया मात्रा में SYBR फास्ट qPCR किट के रूप में GAPDH का उपयोग करें.
8. विश्लेषण: जीनोमिक अनुक्रमण (5 सप्ताह)
- अशेष भाजक 5 x 10 प्रत्येक में अच्छी तरह से 6 कोशिकाओं और कमरे के तापमान पर 4 मिनट के लिए 400 एक्स जी पर नीचे स्पिन .
- इन कोशिकाओं से जीनोमिक डीएनए अलग. हम निर्माता की सिफारिशों के अनुसार विज़ार्ड एसवी जीनोमिक डीएनए शुद्धि किट का उपयोग करें.
- पीसीआर पुलिस महानिरीक्षक वी 19 जीन (1 टेबल) और KAPA HiFi डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग ब्याज की किसी भी अन्य जीनों के लिए जीनोमिक डीएनए बढ़ाना. हम अपनी कम त्रुटि दर की वजह से इस पोलीमरेज़ उपयोग करते हैं, लेकिन किसी भी उच्च विश्वस्तता पीसीआर पोलीमरेज़ स्वीकार्य होना चाहिए.
- एक 1% agarose जेल जेल पीसीआर उत्पादों QIAquick जेल निकासी किट का उपयोग कर शुद्ध.
- कुछ पीसीआर पीसीआर उत्पादों की '3 छोर तक एक एकल deoxyadenosine अवशेषों (ए) जोड़ने के लिए, जबकि दूसरों को नहीं. ये 3 'एक पूंछ Topo प्रादेशिक सेना के लिए आवश्यक हैंक्लोनिंग कदम है. KAPA HiFi पोलीमरेज़ 3 'एक पूंछ नहीं छोड़ता. एक पूंछ 3 μL 10x Taq प्रतिक्रिया बफर, 1 μL 10 मिमी dNTPs, और 30 मिनट के लिए एक इकाई Taq पोलीमरेज़ 72 ° C के साथ 25 μL जेल शुद्ध पीसीआर उत्पाद incubating द्वारा पीसीआर उत्पादों.
- जेल शुद्ध पीसीआर Topo टीए क्लोनिंग किट उत्पादों का उपयोग कर क्लोन. Topo प्रतिक्रिया से प्रदान ई. में उत्पादों का रूपांतरण कोलाई DH5α-T1 आर सक्षम कोशिकाओं और लेग अगर / 100 μg / एमएल एम्पीसिलीन और निर्माता की सिफारिशों के अनुसार एक्स - लड़की के 1.6 मिलीग्राम के साथ पूरक युक्त प्लेटों पर थाली .
- अनुक्रमण के लिए अलग - अलग कालोनियों भेजें.
- अनुक्रम विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए परिवर्तन के प्रकार और स्थानों का निर्धारण.
9. प्रतिनिधि परिणाम:
जैसा कि पहले उल्लेख किया है, हम एक सकारात्मक नियंत्रण वायरल सदिश है कि दोनों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक जीन puromycin प्रतिरोध व्यक्त GFP का उपयोग करें. हम आम तौर पर दो दिन में 50-75% GFP + कोशिकाओं को देखने केअभिकर्मक के बाद. हमारे संक्रमण में, हम आम तौर पर 50-70% की कोशिकाओं के संक्रमण के बाद + दो दिन लेकिन चयन से पहले GFP हैं. चयन के बाद पूरा हो गया है,> कोशिकाओं के 95% GFP + हैं .
प्रतिनिधि प्रयोगों के रूप में, हम overexpressing सहायता या नीचे रामोस कोशिकाओं में एक की मरम्मत कारक दस्तक के प्रभाव दिखाते हैं. विशेष रूप से, हम रेट्रोवायरल पैकेजिंग वेक्टर pKat2 के साथ एक IRES BOSC 23 कोशिकाओं में Thy1.1 करने के लिए साइट के माध्यम से जुड़ा हुआ सहायता के लिए एक रेट्रोवायरल overexpression वेक्टर ट्रांसफ़ेक्ट. वायरस युक्त मीडिया फ़िल्टर्ड किया गया था और तब रामोस कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल किया. दोनों जंगली प्रकार (WT) और सहायता overexpressing कोशिकाओं (सहायता हाय) थे एकल कक्ष वरीयता प्राप्त और 3 सप्ताह के लिए हो, पर जो बात वे जीन की अभिव्यक्ति के लिए QRT पीसीआर (चित्रा 2) और FACS द्वारा आईजीएम घटाने के लिए विश्लेषण किया गया (चित्रा 3 ). FACS धुंधला के लिए, कोशिकाओं दोनों पीई लेबल α मानव आईजीएम एंटीबॉडी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से 1:400 पतला FITC लेबल α चूहे CD90/mouse पतला 1:20 के साथ incubated रहे थेCD90.1 (Thy1.1) एंटीबॉडी. एक अलग प्रयोग में या तो एक अप्रासंगिक shRNA (नियंत्रण) या एक उच्च विश्वस्तता डीएनए की मरम्मत SHM के खिलाफ की रक्षा की उम्मीद कारक के खिलाफ एक shRNA युक्त lentiviruses BOSC 23 कक्षों में किए गए थे, और फिर रामोस कोशिकाओं के एक सहायता हाय क्लोन में संक्रमित. फिर, (चित्रा 4) जीन अभिव्यक्ति और आईजीएम हानि (चित्रा 5) एकल कक्ष क्लोनों में 3 सप्ताह के बाद विश्लेषण किया गया. मरम्मत के बाद से कारक SHM दौरान म्यूटेशनों के खिलाफ संरक्षण प्रदान करने के लिए सोचा है, हम कारक के अभाव में आईजीएम हानि और SHM में वृद्धि देखने. यदि हम एक SHM-जुड़े म्यूटेशन पैदा करने में शामिल कारक नीचे खटखटाया था, हम आईजीएम नुकसान में कमी बजाय देखा होगा.
जैसी उम्मीद थी, हमारे QRT-पीसीआर परिणाम सहायता सहायता overexpression वेक्टर (चित्रा 2) के साथ कोशिकाओं के संक्रमण के बाद की अभिव्यक्ति में एक उल्लेखनीय वृद्धि दिखाने के लिए, जबकि कि कारक के खिलाफ एक लक्षित shRNA की उपस्थिति में डीएनए की मरम्मत कारक बूंद के स्तर (चित्रा 4 ). क्योंकि व्यक्ति clonतों भिन्न हो सकते हैं, आप जीन की अभिव्यक्ति के स्तर में कुछ बदलाव देख सकते हैं. क्योंकि जीन अभिव्यक्ति भिन्न हो सकते हैं, यह आवश्यक है प्रत्येक क्लोन में आप योजना पर आगे विश्लेषण अभिव्यक्ति की पुष्टि. वही जीन के खिलाफ विभिन्न shRNAs जीन अभिव्यक्ति पर अलग अलग प्रभाव के रूप में अच्छी तरह से है, तो आप कई shRNAs स्क्रीन चाहिए निर्धारित करने के लिए जो सबसे बड़ा प्रभाव है हो सकता है. पछाड़ना प्रोटीन के स्तर पर भी immunoblotting द्वारा की पुष्टि की जा सकता है. इसी तरह, व्यक्तिगत क्लोन आईजीएम हानि के स्तर में काफी भिन्न हो सकता है. कुछ क्लोनों "खजाना" प्रभाव है, जहां एक आईजीएम उत्परिवर्तन एक जल्द से जल्द कोशिका विभाजन में हुई प्रदर्शित हो सकता है - दो सेल मंच पर - उदाहरण के लिए, आप> 50% आईजीएम हानि देखेंगे सिर्फ इसलिए कि एक कक्षों की आईजीएम बन गया. इन क्लोन के प्रभाव कई एकल कक्ष क्लोनों के लिए मंझला की गणना के द्वारा कम से कम है.
चित्रा 1 ट्रांस के लिए योजनाबद्ध.fection और आईजीएम के झड़ने के संक्रमण और विश्लेषण. विवरण के लिए पाठ देखें.
चित्रा 2. रामोस कोशिकाओं में सहायता overexpression. WT और सहायता हाय रामोस कोशिकाओं एकल कक्ष क्लोन और 3 सप्ताह के लिए हो, पर जो बात व्यक्तिगत क्लोनों में सहायता अभिव्यक्ति QRT-पीसीआर द्वारा मापा गया था रहे थे. GAPDH अभिव्यक्ति सामान्यीकरण के लिए इस्तेमाल किया गया था. WT 1 करने के लिए स्थापित किया गया था. औसत मूल्य संकेत दिया है. * 0.01 <एपी मान, एक - पुच्छ विद्यार्थी का t-परीक्षण के रूप में गणना इंगित करता है.
चित्रा 3 सहायता हाय कोशिकाओं में आईजीएम हानि में वृद्धि के रूप में WT कोशिकाओं की तुलना में. भूतल आईजीएम FACS द्वारा 3 सप्ताह का समय बिंदु पर मापा था, और WT सहायता और हाय कोशिकाओं के लिए आईजीएम हानि के प्रतिशत की गणना की गई . (ए) एक WT क्लोन और एक सहायता हाय क्लोन के प्रतिनिधि FACS साजिश. सहायता overexpression vector से जुड़े एक IRES साइट के माध्यम से Thy1.1 सहायता है, तो Thy1.1 अभिव्यक्ति है सहायता अभिव्यक्ति के लिए एक किराए के रूप में इस्तेमाल किया. (बी) कई WT और सहायता हाय क्लोनों में आईजीएम हानि के quantitation. औसत मूल्य संकेत दिया है. * 0.01 <एपी मान, एक - पुच्छ विद्यार्थी का t-परीक्षण के रूप में गणना इंगित करता है.
चित्रा 4 सहायता हाय कोशिकाओं में एक की मरम्मत कारक के नॉकडाउन. कक्ष या तो एक shRNA अप्रासंगिक नियंत्रण (नियंत्रण) या ब्याज की हमारे shRNA (shRNA), और एकल कक्ष वरीय से संक्रमित थे. 3 सप्ताह के बाद, व्यक्तिगत क्लोनों में जीन की अभिव्यक्ति QRT-पीसीआर द्वारा मापा गया था. GAPDH अभिव्यक्ति सामान्यीकरण के लिए इस्तेमाल किया गया था. WT 1 करने के लिए स्थापित किया गया था. औसत मूल्य संकेत दिया है. * 0.01 <एपी मान, एक - पुच्छ विद्यार्थी का t-परीक्षण के रूप में गणना इंगित करता है.
चित्रा 5 आईजीएम हानि में वृद्धि .सहायता हाय कोशिकाओं में एक की मरम्मत कारक के स्तर के साथ - नीचे गिरा दिया. कई क्लोनों में भूतल आईजीएम FACS द्वारा 3 सप्ताह का समय बिंदु पर मापा गया था, और कोशिकाओं अभी भी overexpressing सहायता में आईजीएम हानि के प्रतिशत की गणना की गई. औसत मूल्य संकेत दिया है. * 0.01 <एपी मान, एक - पुच्छ विद्यार्थी का t-परीक्षण के रूप में गणना इंगित करता है.
टेबल 1 पुलिस महानिरीक्षक 19 जीनों के लिए प्राइमर दृश्यों: लगातार क्षेत्र Cμ, भारी चेन वी क्षेत्र (वी एच), और प्रकाश श्रृंखला वी क्षेत्र (वी एल).
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Discussion
जैसा कि पहले चर्चा की, सेल एंटीबॉडी विविधीकरण के लिए लाइन मॉडल एक लोकप्रिय प्रारंभिक बिंदु उपन्यास प्रोटीन है कि एंटीबॉडी विविधीकरण के दौरान विभिन्न चरणों के प्रभाव की पहचान बन गए हैं. हम यहाँ या तो दस्तक नीचे या overexpress प्रोटीन रामोस लाइन बी सेल में वायरल संक्रमण का उपयोग करने के लिए एक तरीका मौजूद है और फिर SHM पर प्रभाव की जांच.
इन अध्ययनों के लिए, हम दोनों WT रामोस और सहायता हाय रामोस कोशिकाओं का उपयोग . WT कोशिकाओं को लक्ष्यीकरण या सहायता की अभिव्यक्ति के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सहायता उत्पन्न घावों की मरम्मत में शामिल कारकों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जबकि सहायता हाय कोशिकाओं कारक है कि सहायता की अभिव्यक्ति को प्रभावित बाहर.
यह भी कहा कि, SHM यहाँ आईजीएम की कोशिकाओं है कि शुरू में आईजीएम + की आबादी में से घटाने के लिए परख करने की क्रिया द्वारा मापा जाता है होना चाहिए. वैकल्पिक रूप से, यह संभव है आईजीएम के साथ शुरू - कोशिकाओं और एक प्रत्यावर्तन परख में आईजीएम + कोशिकाओं के लाभ के लिए 23 देखो <./ P>
विभिन्न चयन मार्कर (जैसे puromycin, hygromycin, GFP, या Thy1.1) का उपयोग करके, हम भी एक ही समय में एक ही प्रोटोकॉल के साथ एकाधिक संक्रमण प्रदर्शन कर सकते हैं. हालांकि, हमने पाया है कि जब दो अलग अलग एंटीबायोटिक चयन मार्करों, कोशिकाओं परिवर्तन की संवेदनशीलता का उपयोग कर. यह एक बार में दो एंटीबायोटिक दवाओं के साथ चुनने के लिए शर्तों का अनुकूलन करने के लिए अतिरिक्त को मारने के घटता प्रदर्शन के लिए आवश्यक हो जाएगा. हम आसानी से दो विभिन्न कारकों या एक पहलू के अलावा किसी अन्य के एक overexpression, आदि की दस्तक नीचे डबल - चढ़ाव दस्तक उत्पन्न कर सकते हैं
हम भी अन्य बी सेल लाइन मॉडल के लिए इस प्रोटोकॉल के रूप में अच्छी तरह से अनुकूलित. उदाहरण के लिए, CH12F3-2 (एक माउस बी सेल लाइन सीएसआर का अध्ययन किया) कोशिकाओं 26,27 के साथ, एक ही संक्रमण चरणों के लिए 1 एक्स 10 6 CH12F3-2 संक्रमण के दिन पर वरीयता प्राप्त कोशिकाओं (की भिन्नता को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है 4.1 कदम). 1 / puromycin के μg एमएल के साथ इन कोशिकाओं का चयन कर रहे हैं. इसी तरह, एक ही प्रोटोकॉल भी कर सकते हैंसहायता शुरू जीन रूपांतरण के लिए एक सेल लाइन मॉडल - चिकन DT40 कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
pMSCV सहायता मैं Thy1.1 और pKat2 वैक्टर महानिदेशक Schatz और pVSV जी, pRSV - रेव से एक तरह का उपहार थे, और pMDLg / pRRE वैक्टर बीआर कलन से एक तरह का उपहार थे.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Suggested reagents - most of these may be substituted with similar products from other vendors. | |||
| 6-well clear TC-treated plates | Corning | 3516 | |
| 10 mL BD Luer-Loksyringes | BD Biosciences | 309604 | |
| 24-well clear TC-treated plates | Corning | 3526 | |
| 96-well clear flat bottom polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3596 | |
| 100 mm TC-treated culture dishes | Corning | 430167 | |
| Acrodisc syringe filters, 0.45 μm | Pall Corporation | 4604 | |
| Agar | TEKnova, Inc. | A7777 | |
| Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A0166 | 100 mg/mL in water |
| BD FACSCanto II flow cytometer | BD Biosciences | or similar | |
| BD Falcon round bottom polystyrene tubes | BD Biosciences | 352054 | for FACS |
| BOSC 23 cells | ATCC | CRL-11270 | |
| CO2 incubator capable of 37°C | |||
| DMEM (Dulbecco′s modified Eagle′s medium) | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| FBS (fetal bovine serum) | Gemini Bio Products | 100-106 | |
| FITC α-rat CD90/mouse CD90.1 antibody | BioLegend | 202503 | FITC α-Thy1.1 |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Roche Group | 11814443001 | |
| HEPES buffer solution | Invitrogen | 15630-080 | |
| KAPA HiFi DNA polymerase | KAPA Biosystems | KK2101 | |
| LB Broth (lysogeny broth - Luria) Powder | Difco Laboratories | 240230 | |
| MISSION TRC shRNA bacterial glycerol stock | Sigma-Aldrich | shRNA vectors | |
| NCS (newborn calf serum) | Gemini Bio Products | 100-504 | |
| PBS (phosphate buffered solution) | Invitrogen | 70011 | diluted to 1x in water |
| PE α-human IgM antibody | BioLegend | 314508 | |
| PGS (penicillin-streptomycin-glutamine solution) | Gemini Bio Products | 400-110 | |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 107689 | 10 mg/mL in water |
| PureYield Plasmid Midiprep System | Promega Corp. | A2495 | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | 250 μg/mL in water |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28706 | |
| Ramos (RA 1) cells | ATCC | CRL-1596 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| SuperScript II | Invitrogen | 18064-022 | |
| SYBR FAST qPCR kit | KAPA Biosystems | KK4601 | |
| Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 18038-042 | |
| TOPO TA Cloning kit | Invitrogen | K4520-01 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596-026 | |
| Wizard SV Genomic DNA purification system | Promega Corp. | A2361 | |
| X-Gal [5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galatopyranoside] | Growcells | C-5687 | 40 mg/mL in DMSO |
References
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