Summary
Vi beskriver hur du utför retrovirala eller Lentiviral infektioner i överuttryck eller shRNA innehåller konstruktioner i människans Ramos B-cellinje och hur man mäter somatiska hypermutation i dessa celler.
Abstract
B-celler börja sitt liv med låg affinitet antikroppar genereras av V (D) J rekombination. Men efter att upptäcka en patogen är den rörliga (V) region i ett immunglobulin (IG) genen muterad ca 100 tusen gånger mer än resten av genomet genom somatisk hypermutation (SHM), vilket resulterar i hög affinitet antikroppar 1,2. Dessutom producerar klass växla rekombination (CSR) antikroppar med olika effektorfunktioner beroende på vilken typ av immunsvar som behövs för en viss patogen. Både CSR och SHM initieras av aktivering-inducerad cytidindeaminas (AID), som deaminates cytosin rester i DNA för att producera uracils. Dessa uracils behandlas av felbenägen former av reparationer vägar, till slut leder till mutationer och rekombination 1-3.
Vår nuvarande förståelse av de molekylära detaljerna i SHM och CSR kommer från en kombination av studier på möss, galvaniska element, cellinjer, och cell-free experiment. Musmodeller kvar guldmyntfoten med genetiska knockouts visar kritiska roller för många reparation faktorer (t.ex. Ung, MSH2, Msh6, Exo1 och polymeras η) 4-10. Men inte alla gener kan bli föremål för knockout studier. Till exempel knockouts av flera dubbel-strand proteiner paus reparationer embryonically dödliga eller försämra B-cells utveckling 11-14. Dessutom ibland särskilda funktion av ett protein i SHM, eller CSR kan maskeras av mer globala fel orsakade av knockout. Dessutom kan eftersom experiment på möss vara långa, ändra uttrycket av enskilda gener i cellinjer har blivit ett allt populärare första steget att identifiera och karakterisera gener 15-18.
Ramos - en Burkitt lymfom cellinje som konstitutivt genomgår SHM - har varit ett populärt cell-line modell för att studera SHM 18-24. En fördel med Ramos celler är att de har en inbyggd bekväm semi-Kvantitativa mått på SHM. Vildtyp celler uttrycka IgM och, som de plockar upp mutationer, några av de mutationer som slår ut IgM uttryck. Därför testmetoder IgM förlust av fluorescens-aktiverade celler skanning (FACS) ger en snabb läs-out för nivån på SHM. En mer kvantitativ mätning av SHM kan erhållas genom att direkt sekvensering antikroppen gener.
Eftersom Ramos celler är svåra att transfektera, vi producerar stabila derivat som har ökat eller sänkt uttryck av en enskild gen genom att infektera celler med retrovirus eller Lentiviral konstruktioner som innehåller antingen ett överuttryck kassett eller en kort hårnål RNA (shRNA), respektive. Här beskriver vi hur vi infektera Ramos celler och sedan använda dessa celler för att undersöka betydelsen av specifika gener på SHM (Figur 1).
Protocol
1. Förbereda prover och celler
- Utför en medelstor skala preparation av DNA (midiprep) av överuttryck eller shRNA innehåller konstruerar och retrovirus förpackningen vektor pKat2 eller Lentiviral vektorer förpackningen pVSV-G, pMDLg / pRRE och pRSV-Rev 25. Använd 6 mikrogram DNA för varje konstruera och antingen 4 mikrogram pKat2 (för retrovirus infektioner) eller 1,5 mikrogram DNA för varje pVSV-g, pMDLg / pRRE och pRSV-Rev vektorer förpackningar (för Lentiviral infektioner).
- Förbered Bosc 23 medier. För transfektion, använda båda utan ändringar Dulbecco ändrade Eagles medium (DMEM) samt kompletta DMEM. För att göra kompletta DMEM, tillsätt 1% HEPES buffert, 1% penicillin-streptomycin-glutamin (PGS), och 10% nyfödda kalvserum (NCS) till en flaska DMEM.
- Förbered Ramos medier. För infektionen steget, göra kompletta RPMI-1640 medium (RPMI) genom att tillsätta 1% HEPES, 1% PGS, och 10% fetalt bovint serum (FBS) till en flaska RPMI. För enstaka cell sådd steg, mÅke "betingad" media genom att växa Ramos celler i hela RPMI i 2 dagar, spinning ner celler nedåt på 400 x g 4 minuter och filtrera supernatanten med en 0,2 ìm filter till en steril flaska. Liksom andra kompletta medier, betingas media lagras vid 4 ° C tills det behövs.
- Split 3 x 10 6 Bosc 23 celler till en 100-mm plåt i 10 ml klar DMEM dagen innan transfektion, så att cellerna kommer att vara 50-60% confluency dagen för transfektion. Gör en tallrik av celler för varje vektor du tänker transfecting. Det är viktigt att cellerna inte har hållits i kultur för länge, använda låga celler passage nummer eller nyligen upptinade celler för både transfektion och steg infektion för att försäkra en god infektion.
- Inkludera kontroller för dina experiment. För transfections och infektioner, skapa en negativ kontroll (untransfected eller oinfekterade celler) och en positiv kontroll (virus som uttrycker GFP och puromycin-resistens-genen). För shRNA knock-down kompetensiments, infektera en brunn med en kodad eller irrelevanta shRNA kontroll.
2. Transfecting Bosc 23 celler
- Värma flaskor utan ändringar DMEM och kompletta DMEM vid 37 ° C.
- Ta bort materialet från Bosc 23 celler och ersätta med 5 ml kompletta DMEM. Återgå cellerna att ett 37 ° C inkubator tills den ska användas i steg 2,6.
- Värm flaskan med FuGENE 6 i rumstemperatur i 5 minuter sedan snabbt virvel (<1 sekund).
- Fördela 600 mikroliter utan ändringar DMEM i en 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Späd 30 mikroliter FuGENE 6 till 600 mikroliter utan ändringar DMEM, vortex kort (<1 sekund) och sedan inkubera vid rumstemperatur i fem minuter. Var noga med att pipett direkt i media. Låt inte FuGENE 6 vidrör sidorna av röret.
- Tillsätt 6 mikrogram konstruera och antingen 4 mikrogram pKat2 (retrovirus infektioner) eller 1,5 mikrogram varje pVSV-G, pMDLg / pRRE och pRSV-Rev (Lentiviral infektioner) till DMEM / FuGENE 6 mix, virvel BRI efly (<1 sekund) och sedan inkubera vid rumstemperatur i 25 minuter.
- Lägg till DNA / DMEM / FuGENE 6 mix till Bosc 23 celler och återgå till ett 37 ° C inkubator i 24 timmar.
- Efter 24 timmar, tillsätt 5 ml klar DMEM till transfekterade cellerna och återgå till ett 37 ° C inkubator i ytterligare 24 timmar.
3. Skörd viruspartiklar
- Skörda 10 mL av media från transfekterade Bosc 23 celler med en 10 ml spruta.
- Bifoga en 0,45 ìm filter till slutet av sprutan och filtrera materialet i en ren 15 ml polypropylen rör.
- Använd viral media omedelbart eller frysa som 1 ml-portioner i 2 ml kryogena rören vid -80 ° C.
- Efter skörden viral media, bekräftar att effektiv transfektion har inträffat i den positiva kontrollen celler genom FACS. Detta kan också göras för alla prover om konstruera innehåller antingen en fluorescerande (t.ex. GFP) eller en cellytan markör (t.ex. Thy1).
- Seed 2 ml 2 x 10 5 celler / ml Ramos celler i fullständig RPMI till en 6-brunnar 24 timmar innan infektion. Återigen, se till att använda låga celler passage nummer eller nyligen tinats celler för att försäkra en god infektion.
- Om du använder frysta portioner av virus, tina den virala media snabbt vid 37 ° C.
- Blanda 1 ml viral media med 3 mikroliter av 10 mg / ml polybrene. Den slutliga koncentrationen av polybrene bör vara 10 mikrogram / ml i en total volym på 3 ml.
- Lägg till virus / polybrene mix till cellerna och blanda väl genom att pipettera. Som tidigare nämnts, också en bör användas som ett icke-infekterade kontroll, tillsätt 1 ml komplett RPMI och 3 mikroliter polybrene detta väl i stället för 1 mL virus. Var noga med att infektera en brunn med en matchad negativ kontroll. Vi infektera även ett väl med en GFP-innehållande vektor, för att fastställa infektion effektiviteten med FACS.
- Centrifugera 6-brunnar vid 3000 X g under 90 minuter vid rumstemperatur.
- Återgå plattanett 37 ° C inkubator i 48 timmar.
- Efter 48 timmar, spinn ner de infekterade cellerna i ett 15 ml polypropylen röret vid 400 x g 4 minuter i rumstemperatur. Ta bort materialet genom aspiration, att vara noga med att inte störa cellpelleten. Resuspendera cellerna i färska RPMI.
- Bekräfta effektivitet infektion i den positiva kontrollen provet genom FACS. Liksom tidigare kan du göra detta för alla dina exemplar, om konstruera innehåller antingen en fluorescerande (t.ex. GFP) eller en cellytan markör (t.ex. Thy1).
- Start urval av celler (i förekommande fall). Vår shRNA innehåller konstruerar innehåller alla en kassett puromycin motstånd. Vi väljer shRNA-infekterade Ramos celler med 0,25 mikrogram / ml puromycin. Vi finner att derivat av Ramos celler ibland visar ändrad känslighet för puromycin och därför utför vi dödar kurvor för att optimera koncentrationen av puromycin för varje derivat. Också behandla infekterade kontroll celler med puromycin att bekräfta att valet är effektivt.
Enstaka sådd kan utföras på två sätt: genom FACS sortering eller manuellt.
- FACS: Använd en FACS sorterare med en platta adapter till utsäde 1 cell / bra i en 96-brunnars platta förfylld med 100 mikroliter på 40% RPMI/40% betingad media/20% FBS. Denna metod ger mycket mer enda cell kloner per platta.
- Manuellt: Räkna celler. Späd en alikvot av celler till 10 celler / ml i 40% RPMI/40% betingad media/20% FBS. Använd 10 ml utspädd celler för varje seedade plåt. Olika kloner kommer att visa rörliga återhämtningen i detta skede därför är det bra att ange flera tallrikar med olika koncentrationer (mellan 3 och 20 celler / ml). Använd den som producerar mindre utväxter att undvika kloner som härrör från flera celler). Använd en flerkanalspipett till utsäde 96-brunnar med 100 mikroliter av utspädd celler.
- Placera plattan i ett 37 ° C inkubator i 2 veckor.
- Kontrollera enskilda brunnar under mikroskop för att bekräfta förekomsten av celler en dag efter sådd. Enstaka celler kan vara knepigt att hitta på grund av behovet av att fokusera på rätt djup. Fokusera på bra siffror tryckt i botten av 96-brunnar bör hjälpa. Celler är lättare att hitta när seedad av FACS sorterare eftersom de flesta brunnar har en cell.
- Efter 2 veckor kan växa kolonier kan knappast ses av blotta ögat genom att titta på plåtarna underifrån. De är mycket lättare att se i mikroskop. Kolonier tenderar att växa längs kanterna på brunnen och typiskt flesta kolonier i en tallrik växer längs samma kant i olika brunnar. Markera brunnar med robust celltillväxt och överföra cellerna till 24-brunnars plattor i 1 ml RPMI och återgå till ett 37 ° C inkubator.
- Behåll celler vid 1 x 10 5 till 1 x 10 6 celler / ml. Ändra media genom att snurra på cellerna på 400 x g 4 minuter vid rumstemperatur och ta bort media som behövs. Ersätt med 1 ml färsk RPMI.
- Efter flera days av tillväxten, överföra celler till en 6-brunnar och fortsätta växa i en 37 ° C inkubator.
- Efter 3 veckor, analysera kloner för IgM-förlust (se nedan).
- Fortsätter att växa cellerna i 2 veckor och sedan analysera kloner igen vid 5 veckor tidpunkt.
6. Analys: IgM förlust (3 veckor och 5 veckor)
- Fördela 5 x 10 5 celler från varje brunn i en 1,5 ml mikrocentrifugrör och snurra celler nedåt på 400 x g 4 minuter i rumstemperatur. Använd celler från varje kontrollpunkt och shRNA-knock-down brunnar, samt ett prov för en ofärgade kontroll.
- Tvätta cellerna i 1 mL PBS och sedan snurra igen i 400 x g 4 minuter i rumstemperatur.
- Resuspendera i 50 mikroliter av PBS (ofärgade kontroll) eller PBS + 1:20 utspädning av PE-märkta α-human IgM-antikroppar. Inkubera på is i 1 timme.
- Snurra celler nedåt på 400 x g 4 minuter i rumstemperatur.
- Tvätta calnar två gånger med 1 mL PBS och centrifugera i 400 x g 4 minuter varje gång vid rumstemperatur.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera i 100 mikroliter PBS. Överför den återsuspenderade färgade celler till en FACS rör.
- Analysera cellerna med hjälp av en FACS maskin.
- Jämför andelen av IgM - celler från kontrollerna vs shRNA slog ner celler. Som nämnts tidigare är IgM-förlust mätt med FACS en pålitlig semi-kvantitativt mått på SHM i Ramos celler.
7. Analys: Bekräfta knock-down genom kvantitativ RT-PCR (5 veckor)
- Alikvotera 3 x 10 6 celler från varje brunn och spinn ner till 400 x g 4 minuter i rumstemperatur.
- Förbered RNA från delmängd av celler. Vi använder TRIzol enligt tillverkarens rekommendationer.
- Förbered cDNA från RNA-prep. Vi använder 2 mikrogram RNA och upphöjd II enligt tillverkarens rekommendationer.
- Utför en kvantitativ PCR med cDNA som bekräftelsem knock-down. Vi använder GAPDH som en normalisering kontroll och SYBR FAST qPCR kit i en 10 mikroliter totalt reaktion volym.
8. Analys: Genomic sekvensering (5 veckor)
- Fördela 5 x 10 6 celler från varje brunn och spinn ner till 400 x g 4 minuter i rumstemperatur.
- Isolera genomisk DNA från dessa celler. Vi använder guiden SV genomiska kit DNA rening enligt tillverkarens rekommendationer.
- PCR-amplifiera arvsmassans DNA för IG V-generna 19 (tabell 1) och alla andra gener av intresse att använda KAPA HiFi DNA-polymeras. Vi använder denna polymeras grund av sin låga fel-priser, men alla hifi-PCR-polymeras ska vara acceptabelt.
- Gel rena PCR-produkter på en 1% agarosgel med QIAquick kit gelen extraktion.
- Vissa polymeraser lägga till en enda deoxyadenosin (A) återstoden till 3 'ändarna av PCR-produkter, medan andra inte gör. Dessa 3 "En svansar är nödvändiga för TOPO TAkloning steg. Den KAPA HiFi-polymeras lämnar inte 3 "A svansar. A-svans PCR-produkter genom inkubering 25 mikroliter gel-renade PCR-produkten med 3 mikroliter 10x Taq reaktion buffert, 1 mikroliter 10 dNTPs mm och 1 enhet Taq-polymeras vid 72 ° C i 30 minuter.
- Klona gel-renade PCR-produkter med hjälp av TOPO TA Kloning kit. Förvandla produkterna från TOPO reaktionen i den medföljande E. coli DH5α-T1 R behöriga celler och platta på LB / agarplattor som innehåller 100 mikrogram / ml ampicillin och kompletteras med 1,6 mg X-gal enligt tillverkarens rekommendationer.
- Skicka enskilda kolonier för sekvensering.
- Genomför sekvensen analys för att fastställa typer och platser av mutationer.
9. Representativa resultat:
Som nämnts tidigare använder vi en positiv kontroll viral vektor som uttrycker både GFP samt en puromycin-motstånd genen. Vi ser vanligtvis 50-75% GFP + celler två dagarefter transfektion. I vår infektioner, ser vi vanligen 50-70% celler GFP + två dagar efter infektion men före valet. Efter valet är klart,> 95% av cellerna är GFP +.
Som representant experiment visar vi effekterna av överuttryck av AID eller knacka ner en reparation faktor i Ramos celler. Specifikt transfekterade vi ett retrovirus överuttryck vektor för stöd kopplat via en IRES webbplats till Thy1.1 tillsammans med retrovirus förpackningen vektor pKat2 i Bosc 23 celler. Virus som innehåller media var filtrerad och sedan används för att infektera Ramos celler. Både vild typ (WT) och stöd överuttryck (AID HI) celler var enda cell seedade och som odlas för 3 veckor, vid vilken tidpunkt de analyserades för genuttrycket QRT-PCR (figur 2) och för IgM förlust av FACS (Figur 3 ). För FACS färgning, var cellerna inkuberas med både 1:20 utspätt PE-märkta α-human IgM-antikroppar samt 1:400 utspädd FITC-märkt α-råtta CD90/mouseCD90.1 (Thy1.1) antikroppar. I ett separat experiment var lentiviruses som innehåller antingen en irrelevant shRNA (kontroll) eller en shRNA mot en high-fidelity DNA-reparation faktor förväntas skydda mot SHM gjorts i Bosc 23 celler, och sedan smittade till en HJÄLPEN hej klon av Ramos celler. Återigen var genuttryck (Figur 4) och IgM-förlust (Figur 5) analyseras i en enda cell kloner efter 3 veckor. Eftersom reparationen faktorn är tänkt att ge skydd mot mutationer under SHM, ser vi en ökning av IgM-förlust och SHM i avsaknad av den faktor. Om vi hade slagit ner en faktor involverad i att skapa SHM-associerade mutationer, skulle vi ha sett en minskning av IgM-förlust i stället.
Som väntat, vår QRT-PCR-resultat visar en markant ökning av stödet uttryck efter infektion av celler med ett hjälpmedel överuttryck vektor (Figur 2), medan nivåerna av DNA-reparation faktorn droppe i närvaro av en riktad shRNA mot denna faktor (Figur 4 ). Eftersom enskilda clones kan variera, kan du se en viss variation i nivåer genuttryck. Eftersom genuttryck kan variera, är det nödvändigt att bekräfta uttrycket i varje klon du planerar på att analysera ytterligare. Olika shRNAs mot samma gen kan ha olika effekter på genuttryck också, så du bör skärmen flera shRNAs att avgöra vilka har störst påverkan. ÖVERVÄLDIGANDE kan även bekräftas på proteinnivå av immunoblotting. På samma sätt kan enskilda kloner varierar kraftigt i nivåer av IgM förlust. Vissa kloner kan påvisa en "jackpot" effekt, där en IgM mutation inträffade i en av de tidigaste celldelningar - till exempel, ser du> 50% IgM förlust bara för att en av cellerna blev IgM - i två-cell stadium. Inverkan av dessa kloner minimeras genom att beräkna medianvärdet för flera enskild cell kloner.
Figur 1. Schematisk för det transeuropeiska transportnätetcering, infektion och analys av IgM-förlust. Se text för detaljer.
Figur 2. Stöd överuttryck i Ramos celler. WT och Aid hej Ramos celler var enda cell klonade och odlas för 3 veckor, då HJÄLPEN uttryck i enskilda kloner mättes med QRT-PCR. GAPDH uttryck användes för normalisering. WT var satt till 1. Medianvärdet är indicerad. * Anger AP värde <0,01, beräknat som ett ensidigt Students t-test.
Figur 3. Ökad IgM förlust i celler HJÄLPEN hej jämfört med WT celler. Surface IgM mättes genom FACS vid 3 veckors tid punkt, och andelen av IgM förlusten beräknades för WT och biståndseffektivitet celler hej. (A) representant FACS handlingen i en WT klon och ett stöd hi klon. AID överuttryck vEctor har stödet i samband med Thy1.1 via en IRES plats, så Thy1.1 uttrycket används som ett surrogat för AID uttryck. (B) Kvantifiering av IgM-förlust i flera WT och biståndseffektivitet hej kloner. Medianvärdet är indicerad. * Anger AP värde <0,01, beräknat som ett ensidigt Students t-test.
Figur 4. Knockdown av en reparation faktor i cellerna HJÄLPEN hi. Celler var infekterade med antingen en irrelevant shRNA (kontroll) eller vår shRNA av intresse (shRNA), och enda cell seedad. Efter 3 veckor var genuttryck i enskilda kloner mätt med QRT-PCR. GAPDH uttryck användes för normalisering. WT var satt till 1. Medianvärdet är indicerad. * Anger AP värde <0,01, beräknat som ett ensidigt Students t-test.
Figur 5. Ökad IgM-förlusti bistånd hej celler med slagit ner nivåerna av en reparation faktor. Yta IgM i flera kloner mättes genom FACS vid 3 veckors tid punkt, och andelen av IgM-förlust beräknas i cellerna fortfarande överuttrycker AID. Medianvärdet är indicerad. * Anger AP värde <0,01, beräknat som ett ensidigt Students t-test.
. Tabell 1 Primer sekvenser för Ig gener 19: de ständiga regionen Cμ, den tunga kedjan V regionen (V H), och den lätta kedjan V regionen (V L).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som diskuterats tidigare har cellinje modeller för antikropp diversifiering blivit en populär utgångspunkt för att identifiera nya proteiner som påverkar olika steg under antikropp diversifiering. Vi presenterar här en metod för att använda virusinfektion för att antingen slå ner eller överuttrycker proteiner i Ramos B-cell linje och sedan undersöka effekterna på SHM.
För dessa studier använder vi både WT Ramos och HJÄLPEN hej Ramos celler. WT celler kan användas för att studera faktorer som inriktning eller uttryck av stöd samt reparation av AID-genererade skador, medan stöd hi celler utesluta faktorer som påverkar HJÄLPEN uttryck.
Det bör också noteras att, SHM mäts här genom analys för förlust av IgM från en population av celler som är initialt IgM +. Alternativt är det möjligt att starta med IgM -. Celler och leta efter en vinst av IgM + celler i en återgång assay 23 </ P>
Genom att använda olika markörerna (t.ex. puromycin, hygromycin, GFP, eller Thy1.1), kan vi också utföra flera infektioner vid samma tidpunkt med samma protokoll. Vi har dock funnit att när man använder två olika antibiotika markörerna, känsligheten i cellerna förändras. Det kommer att bli nödvändigt att utföra ytterligare döda kurvor för att optimera förutsättningarna för val med två antibiotika på en gång. Vi kan enkelt generera dubbel knock-skrivningar av två olika faktorer eller en knock-down av en faktor plus ett överuttryck av en annan etc.
Vi har även anpassat detta protokoll för andra B-cells-line också. Till exempel med CH12F3-2-celler (en mus B-cellinje som används för att studera CSR) 26,27, kan samma smitta steg användas för att infektera 1 x 10 6 CH12F3-2-celler seedade på dagen för infektion (variation av steg 4,1). Dessa celler är markerade med 1 mikrogram / ml puromycin. Likaså samma protokoll kan ocksåanvändas för kyckling DT40 celler - en cellinje modell för HJÄLPEN initieras-gen konvertering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Den pMSCV-AID-I-Thy1.1 och pKat2 vektorer var en slags gåva från GD Schatz och pVSV-G, pRSV-Rev, och pMDLg / pRRE vektorer var en slags gåva från BR Cullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Suggested reagents - most of these may be substituted with similar products from other vendors. | |||
| 6-well clear TC-treated plates | Corning | 3516 | |
| 10 mL BD Luer-Loksyringes | BD Biosciences | 309604 | |
| 24-well clear TC-treated plates | Corning | 3526 | |
| 96-well clear flat bottom polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3596 | |
| 100 mm TC-treated culture dishes | Corning | 430167 | |
| Acrodisc syringe filters, 0.45 μm | Pall Corporation | 4604 | |
| Agar | TEKnova, Inc. | A7777 | |
| Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A0166 | 100 mg/mL in water |
| BD FACSCanto II flow cytometer | BD Biosciences | or similar | |
| BD Falcon round bottom polystyrene tubes | BD Biosciences | 352054 | for FACS |
| BOSC 23 cells | ATCC | CRL-11270 | |
| CO2 incubator capable of 37°C | |||
| DMEM (Dulbecco′s modified Eagle′s medium) | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| FBS (fetal bovine serum) | Gemini Bio Products | 100-106 | |
| FITC α-rat CD90/mouse CD90.1 antibody | BioLegend | 202503 | FITC α-Thy1.1 |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Roche Group | 11814443001 | |
| HEPES buffer solution | Invitrogen | 15630-080 | |
| KAPA HiFi DNA polymerase | KAPA Biosystems | KK2101 | |
| LB Broth (lysogeny broth - Luria) Powder | Difco Laboratories | 240230 | |
| MISSION TRC shRNA bacterial glycerol stock | Sigma-Aldrich | shRNA vectors | |
| NCS (newborn calf serum) | Gemini Bio Products | 100-504 | |
| PBS (phosphate buffered solution) | Invitrogen | 70011 | diluted to 1x in water |
| PE α-human IgM antibody | BioLegend | 314508 | |
| PGS (penicillin-streptomycin-glutamine solution) | Gemini Bio Products | 400-110 | |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 107689 | 10 mg/mL in water |
| PureYield Plasmid Midiprep System | Promega Corp. | A2495 | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | 250 μg/mL in water |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28706 | |
| Ramos (RA 1) cells | ATCC | CRL-1596 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| SuperScript II | Invitrogen | 18064-022 | |
| SYBR FAST qPCR kit | KAPA Biosystems | KK4601 | |
| Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 18038-042 | |
| TOPO TA Cloning kit | Invitrogen | K4520-01 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596-026 | |
| Wizard SV Genomic DNA purification system | Promega Corp. | A2361 | |
| X-Gal [5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galatopyranoside] | Growcells | C-5687 | 40 mg/mL in DMSO |
References
- Di Noia, J. M., Neuberger, M. S. Molecular mechanisms of antibody somatic hypermutation. Annu. Rev. Biochem. 76, 1-22 (2007).
- Peled, J. U.
- Longerich, S., Basu, U., Alt, F., Storb, U. AID in somatic hypermutation and class switch recombination. Curr. Opin. Immunol. 18, 164-174 (2006).
- Bardwell, P. D. Altered somatic hypermutation and reduced class-switch recombination in exonuclease 1-mutant mice. Nat. Immunol. 5, 224-229 (2004).
- Martomo, S. A., Yang, W. W., Gearhart, P. J. A role for Msh6 but not Msh3 in somatic hypermutation and class switch recombination. J. Exp. Med. 200, 61-68 (2004).
- Phung, Q. H. Increased hypermutation at G and C nucleotides in immunoglobulin variable genes from mice deficient in the MSH2 mismatch repair protein. J. Exp. Med. 187, 1745-1751 (1998).
- Rada, C., Ehrenstein, M. R., Neuberger, M. S., Milstein, C. Hot spot focusing of somatic hypermutation in MSH2-deficient mice suggests two stages of mutational targeting. Immunity. 9, 135-141 (1998).
- Rada, C. Immunoglobulin isotype switching is inhibited and somatic hypermutation perturbed in UNG-deficient mice. Curr. Biol. 12, 1748-1755 (2002).
- Delbos, F., Aoufouchi, S., Faili, A., Weill, J. C., Reynaud, C. A. DNA polymerase eta is the sole contributor of A/T modifications during immunoglobulin gene hypermutation in the mouse. J. Exp. Med. 204, 17-23 (2007).
- Masuda, K. DNA polymerase eta is a limiting factor for A:T mutations in Ig genes and contributes to antibody affinity maturation. Eur. J. Immunol. 38, 2796-2805 (2008).
- Lim, D. S., Hasty, P. A mutation in mouse rad51 results in an early embryonic lethal that is suppressed by a mutation in p53. Mol. Cell. Biol. 16, 7133-7143 (1996).
- Xiao, Y., Weaver, D. T. Conditional gene targeted deletion by Cre recombinase demonstrates the requirement for the double-strand break repair Mre11 protein in murine embryonic stem cells. Nucleic. Acids. Res. 25, 2985-2991 (1997).
- Zhu, J., Petersen, S., Tessarollo, L., Nussenzweig, A. Targeted disruption of the Nijmegen breakage syndrome gene NBS1 leads to early embryonic lethality in mice. Curr. Biol. 11, 105-109 (2001).
- Luo, G. Disruption of mRad50 causes embryonic stem cell lethality, abnormal embryonic development, and sensitivity to ionizing radiation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7376-7381 (1999).
- Pavri, R. Activation-induced cytidine deaminase targets DNA at sites of RNA polymerase II stalling by interaction with Spt5. Cell. 143, 122-133 (2010).
- Lee-Theilen, M., Matthews, A. J., Kelly, D., Zheng, S., Chaudhuri, J. CtIP promotes microhomology-mediated alternative end joining during class-switch recombination. Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 75-79 (2011).
- Basu, U. The RNA exosome targets the AID cytidine deaminase to both strands of transcribed duplex DNA substrates. Cell. 144, 353-363 (2011).
- Yabuki, M., Fujii, M. M., Maizels, N. The MRE11-RAD50-NBS1 complex accelerates somatic hypermutation and gene conversion of immunoglobulin variable regions. Nat. Immunol. 6, 730-736 (2005).
- Sale, J. E., Neuberger, M. S. TdT-accessible breaks are scattered over the immunoglobulin V domain in a constitutively hypermutating B cell line. Immunity. 9, 859-869 (1998).
- Cumbers, S. J. Generation and iterative affinity maturation of antibodies in vitro using hypermutating B-cell lines. Nat. Biotechnol. 20, 1129-1134 (2002).
- Papavasiliou, F. N., Schatz, D. G. Cell-cycle-regulated DNA double-stranded breaks in somatic hypermutation of immunoglobulin genes. Nature. 408, 216-221 (2000).
- Parsa, J. Y. AID mutates a non-immunoglobulin transgene independent of chromosomal position. Mol. Immunol. 44, 567-575 (2007).
- Zhang, W. Clonal instability of V region hypermutation in the Ramos Burkitt's lymphoma cell line. Int. Immunol. 13, 1175-1184 (2001).
- Ukai, A. Induction of a:T mutations is dependent on cellular environment but independent of mutation frequency and target gene location. J. Immunol. 181, 7835-7842 (2008).
- Dull, T. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J. Virol. 72, 8463-8471 (1998).
- Nakamura, M. High frequency class switching of an IgM+ B lymphoma clone CH12F3 to IgA+ cells. Int. Immunol. 8, 193-201 (1996).
- Muramatsu, M. Specific expression of activation-induced cytidine deaminase (AID), a novel member of the RNA-editing deaminase family in germinal center B cells. J. Biol. Chem. 274, 18470-18476 (1999).
