Summary
Vi beskriver, hvordan du udfører retroviral eller lentiviral infektioner af overekspression eller shRNA-holdige konstruerer i den menneskelige Ramos B-celle linie og hvordan man kan måle somatiske hypermutation i disse celler.
Abstract
B-celler starter deres liv med lav affinitet antistoffer genereret af V (D) J rekombination. Men efter afsløring af et patogen, er den variable (V) del af et immunglobulin (Ig) genet muteret omkring 100.000 gange mere end resten af genomet ved hjælp af somatiske hypermutation (SHM), hvilket resulterer i høj affinitet antistoffer 1,2. Derudover producerer klasse skifte rekombination (CSR) antistoffer med forskellige effektor funktioner, afhængigt af, hvilken type immunrespons, der er nødvendig for en bestemt patogen. Både CSR og SHM er initieret af aktivering-induceret cytidindeaminase (AID), som deaminates cytosin rester i DNA til at producere uracils. Disse uracils behandles af fejlbehæftet former for reparation af veje, i sidste ende fører til mutationer og rekombination 1-3.
Vores nuværende forståelse for de molekylære detaljer om SHM og CSR kommer fra en kombination af studier i mus, primærelementer, cellelinjer, og celle-fREE eksperimenter. Musemodeller er fortsat guldstandarden med genetiske knockouts viser kritiske roller for mange reparationer faktorer (f.eks Ung, Msh2, Msh6, Exo1, og polymerase η) 4-10. Men ikke alle gener er modtagelig for knockout undersøgelser. For eksempel er knockouts af flere dobbelt-strenget pause reparation proteiner embryonically dødelige eller forringe B-celle udvikling 11-14. Hertil kommer, nogle gange den særlige funktion af et protein i SHM eller CSR kan maskeres ved mere global fejl forårsaget af knockout. Desuden kan da eksperimenter med mus være lang, ændre udtryk for enkelte gener i cellelinier er blevet en stadig mere populær første skridt til at identificere og karakterisere kandidatgener 15-18.
Ramos - en Burkitts lymfom cellelinie, der konstitutivt gennemgår SHM - har været et populært celle-line model til at studere SHM 18-24. En fordel ved Ramos celler er, at de har en indbygget i praktiske semi-Kvantitativ måling af SHM. Vildtype celler udtrykker IgM, og da de afhente mutationer, nogle af de mutationer knock out IgM udtryk. Derfor analysering IgM tab ved fluorescens-aktiveret celle scanning (FACS) giver en hurtig udlæsning for niveauet af SHM. En mere kvantitativ måling af SHM kan fås ved direkte sekventering antistoffet gener.
Siden Ramos celler er vanskelige at transfect, vi producerer stabile produkter, der har øget eller sænket udtryk for en individuel gen ved at inficere celler med retroviral eller lentiviral konstruktioner, der indeholder enten en overekspression af kassette eller en kort hårnål RNA (shRNA), hhv. Her beskriver vi, hvordan vi inficere Ramos celler og derefter bruge disse celler til at undersøge betydningen af specifikke gener på SHM (Figur 1).
Protocol
1. Forberedelse af prøver og celler
- Udfør en medium skala forberedelse af DNA (midiprep) af overekspression eller shRNA-holdige konstruerer og retroviral emballagen vektor pKat2 eller lentiviral emballagen vektorer pVSV-G, pMDLg / pRRE, og pRSV-Rev 25. Bruge 6 mikrogram DNA for hver konstruere og enten 4 mg af pKat2 (for retrovirale infektioner) eller 1,5 mg DNA for hver af de pVSV-g, pMDLg / pRRE, og pRSV-Rev emballage vektorer (for lentiviral infektioner).
- Forbered BOSC 23 medier. For transfektion, bruge både uændret Dulbecco ændrede Eagle er medium (DMEM) samt komplette DMEM. For at gøre fuldføre DMEM, tilsættes 1% HEPES buffer, 1% penicillin-streptomycin-glutamin (PGS), og 10% nyfødte kalveserum (NCS) til en flaske DMEM.
- Forbered Ramos medier. For infektionen trin, gør fuldstændig RPMI-1640 medium (RPMI) ved at tilsætte 1% HEPES, 1% PGS, og 10% føtalt bovint serum (FBS) til en flaske RPMI. For enkelt celle såning skridt, mAKE "betinget" medier ved at dyrke Ramos celler i fuldstændig RPMI i 2 dage, spinning ned celler nedad ved 400 x g i 4 minutter og filtrering supernatanten med et 0,2 μm filter i en steril flaske. Ligesom andre fuldstændige medium, er betinget medier opbevares ved 4 ° C indtil de skal bruges.
- Split 3 x 10 6 BOSC 23 celler ind i et 100-mm plade i 10 mL fuldstændig DMEM dagen før transfektion, således at cellerne vil være på 50-60% confluency dagen for transfektion. Foretag en plade af celler for hver vektor du har planer om transfecting. Det er vigtigt, at cellerne ikke er blevet holdt i kultur alt for længe; bruger lave passage antal celler eller for nylig optøet celler for både transfektion og infektion skridt til at sikre en god infektion.
- Medtag styringer til dine eksperimenter. For transfections og infektioner, skaber en negativ kontrol (untransfected eller inficerede celler) og en positiv kontrol (virus, der udtrykker GFP og puromycin-resistens genet). For shRNA knock-down experiments, inficere en brønd med en kodet eller irrelevante shRNA kontrol.
2. Transfecting BOSC 23 celler
- Varm flasker uændret DMEM og komplet DMEM ved 37 ° C.
- Fjern medie fra BOSC 23 celler og erstatte med 5 ml komplet DMEM. Retur cellerne til et 37 ° C inkubator indtil brug i trin 2.6.
- Varm flasken med FuGENE 6 ved stuetemperatur i 5 minutter derefter kortvarigt vortex (<1 sekund).
- Alikvot 600 μL uændret DMEM ind i en 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Fortynd 30 μL FuGENE 6 i de 600 μL uændret DMEM, vortex kortvarigt (<1 sekund), og derefter inkubér ved stuetemperatur i fem minutter. Vær omhyggelig med at pipette direkte i medierne. Lad ikke FuGENE 6 røre siderne af glasset.
- Tilsæt 6 mikrogram konstruere og enten 4 mg pKat2 (retrovirale infektioner) eller 1,5 mikrogram hver af pVSV-G, pMDLg / pRRE, og pRSV-Rev (lentiviral infektioner) til DMEM / FuGENE 6 mix, vortex BRI efly (<1 sekund), og derefter inkubér ved stuetemperatur i 25 minutter.
- Tilsæt DNA / DMEM / FuGENE 6 mix til BOSC 23 celler og vende tilbage til et 37 ° C inkubator i 24 timer.
- Efter 24 timer, tilsættes 5 ml komplet DMEM til transfekterede celler og vende tilbage til et 37 ° C inkubator i endnu 24 timer.
3. Høst viruspartikler
- Harvest de 10 mL af medier fra transficeret BOSC 23 celler med en 10 ml sprøjte.
- Vedhæft et 0,45 μm filter på enden af sprøjten og filteret medierne til et rent 15 mL polypropylen rør.
- Brug den virale medier straks eller fryses som 1 ml aliquoter i 2 ml kryogene glassene ved -80 ° C.
- Efter høst af virale medier, bekræfter, at effektiv transfektion er sket i den positive kontrol celler ved FACS. Dette kan også gøres for alle prøver, hvis konstruktionen indeholder enten et lysstofrør (f.eks GFP) eller en celle-overflade markør (f.eks Thy1).
- Seed 2 ml 2 x 10 5 celler / ml Ramos celler i komplet RPMI til et 6-brønds plade 24 timer før infektion. Igen, sørg for at bruge lav passage antal celler eller nyligt optøede celler for at sikre gode infektion.
- Hvis du bruger frosne portioner af virus, tø den virale medier hurtigt ved 37 ° C.
- Bland 1 ml viral medier med 3 μL på 10 mg / ml polybrene. Den endelige koncentration af polybrene bør være 10 mg / ml i en samlet volumen på 3 ml.
- Tilføj virus / polybrene mix til cellerne og bland godt ved pipettering. Som tidligere nævnt, en vel bør anvendes som en ikke-inficerede kontrol; tilsættes 1 mL komplet RPMI og 3 μL polybrene at dette godt i stedet for 1 mL virus. Vær sikker på at inficere en brønd med en matchende negativ kontrol. Vi har også inficere en brønd med en GFP-holdige vektor at afgøre, infektion effektivitet ved FACS.
- Centrifuger 6-brønds plade ved 3000 x g i 90 minutter ved stuetemperatur.
- Retur pladenen 37 ° C inkubator i 48 timer.
- Efter 48 timer, spin ned de inficerede celler i et 15 ml polypropylen rør på 400 x g i 4 minutter ved stuetemperatur. Fjern mediet ved aspiration, og sørg for ikke at forstyrre cellepelleten. Cellerne i frisk RPMI.
- Bekræft effektiviteten af infektion i den positive kontrolprøve af FACS. Som før, kan du gøre dette for alle dine prøver, hvis konstruktionen indeholder enten et lysstofrør (f.eks GFP) eller en celle-overflade markør (f.eks Thy1).
- Start markering af celler (hvis relevant). Vores shRNA-holdige konstruerer indeholder alle en puromycin modstand kassette. Vi udvælger shRNA-inficeret Ramos celler med 0,25 mg / ml puromycin. Vi finder, at derivater af Ramos celler til tider vise ændret modtagelighed over for puromycin, og derfor udfører vi dræber kurver for at optimere koncentrationen af puromycin for hver afledte. Også behandle inficerede kontrol celler med puromycin at bekræfte, at valget er effektiv.
Single såning kan udføres på en af to måder: ved at FACS sortering eller manuelt.
- FACS: Brug en FACS sorteringsanlæg med en plade adapter til frø 1 celle / brønd i en 96-brønds plade fyldt med 100 μL på 40% RPMI/40% conditioned media/20% FBS. Denne metode giver en meget mere enkelt celle kloner per plade.
- Manuelt: Tæl celler. Fortynd en portion af celler til 10 celler / ml i 40% RPMI/40% conditioned media/20% FBS. Brug 10 mL fortyndet celler for hvert seeded plade. Forskellige kloner vil vise variabel opsving på dette tidspunkt derfor er det nyttigt at oprette flere plader i forskellige koncentrationer (fra 3 til 20 celler / ml). Brug den, der frembringer færre udvækster at undgå kloner som følge af flere celler). Brug en multikanalpipette til frø 96-brønds plader med 100 μL af fortyndet celler.
- Pladen anbringes i et 37 ° C inkubator i 2 uger.
- Check enkelte brønde under mikroskopet for at bekræfte tilstedeværelsen af cellerne en dag efter såning. Enkelt celler kan være en vanskelig opgave at finde på grund af behovet for at fokusere på den korrekte dybde. Fokus på såvel numre trykt i bunden af den 96-brønds plade skulle hjælpe. Celler er nemmere at finde, når seedet af FACS sorteringsanlæg, da de fleste brønde har en celle.
- Efter 2 uger, kan voksende kolonier næsten ikke ses af blotte øje ved at se på pladerne nedefra. De er meget nemmere at se under lup. Kolonier tendens til at vokse langs kanterne af godt og typisk mest kolonier på en plade vokser langs den samme kant i forskellige brønde. Mark brønde med robust cellevækst og overføre cellerne til 24-godt plader i 1 mL RPMI og vende tilbage til et 37 ° C inkubator.
- Bevar cellerne ved 1 x 10 5 til 1 x 10 6 celler / ml. Skift medierne ved at dreje cellerne ved 400 x g i 4 minutter ved stuetemperatur og fjerne medier efter behov. Erstat med 1 mL frisk RPMI.
- Efter flere dlav e af vækst, overføre cellerne til en 6-brønds plade og fortsætte væksten i et 37 ° C inkubator.
- Efter 3 uger, analysere kloner for IgM tab (som beskrevet nedenfor).
- Fortsæt med at dyrke cellerne for yderligere 2 uger og derefter analysere kloner igen på det 5 uger tidspunkt.
6. Analyse: IgM tab (3 uger og 5 uger)
- Alikvot 5 x 10 5 celler fra hver brønd i en 1,5 ml mikrocentrifugerør og spin cellerne ned ved 400 x g i 4 minutter ved stuetemperatur. Brug celler fra hver af de kontrol-og shRNA-knock-down brønde, samt en prøve for en uplettet kontrol.
- Vask cellerne i 1 mL PBS og derefter spinde igen ved 400 x g i 4 minutter ved stuetemperatur.
- Resuspender i 50 μL af PBS (uplettet kontrol) eller PBS + fortyndet 1:20 PE-mærket α-human IgM antistof. Inkuber på is i 1 time.
- Spin cellerne ned ved 400 x g i 4 minutter ved stuetemperatur.
- Vask CAlen to gange med 1 mL PBS og spin for 400 X g for 4 minutter hver gang ved stuetemperatur.
- Fjern supernatanten og resuspender i 100 μL af PBS. Overfør resuspenderet farvede celler til en FACS rør.
- Analysér cellerne ved hjælp af en FACS maskine.
- Sammenlign procenten af IgM - celler fra den kontrol vs shRNA bankede-down celler. Som nævnt før, IgM tab målt ved FACS er en pålidelig semi-kvantitativ måling af SHM i Ramos celler.
7. Analyse: Bekræft knock-down af kvantitativ RT-PCR (5 uger)
- Alikvot 3 x 10 6 celler fra hver brønd og spin ned på 400 x g i 4 minutter ved stuetemperatur.
- Forbered RNA fra den alikvote af celler. Vi bruger TRIzol henhold til producentens anbefalinger.
- Forbered cDNA fra RNA prep. Vi bruger 2 mg RNA og Hævet II i henhold til producentens anbefalinger.
- Udfør en kvantitativ PCR ved hjælp af cDNA til bekræftelsem knock-down. Vi bruger GAPDH som en normalisering kontrol, og SYBR FAST qPCR kit i en 10 μL samlet reaktion volumen.
8. Analyse: Genomisk sekventering (5 uger)
- Alikvot 5 x 10 6 celler fra hver brønd og spin ned på 400 x g i 4 minutter ved stuetemperatur.
- Isoler genomisk DNA fra disse celler. Vi bruger guiden SV genomisk DNA oprensning kit i henhold til producentens anbefalinger.
- PCR forstærke det genomiske DNA for Ig V gener 19 (tabel 1) og andre gener af interesse ved hjælp af KAPA HiFi DNA-polymerase. Vi bruger denne polymerase på grund af dens lave fejl-rate, men enhver hi-fi-PCR polymerase bør være acceptable.
- Gel rense PCR-produkter på en 1% agarosegel ved hjælp af QIAquick gel udvinding kit.
- Nogle polymeraser tilføje et enkelt deoxyadenosin (A) rest til 3 'ender af PCR-produkter, mens andre ikke gør. Disse 3 'En hale er nødvendige for TOPO TAkloning trin. Den KAPA HiFi polymerase ikke efterlader 3 'A haler. A-hale PCR-produkterne ved at inkubere 25 μL gel-oprensede PCR-produkt med 3 μL 10x Taq reaktion buffer, 1 ml 10 mM dNTP'er, og 1 enhed Taq polymerase ved 72 ° C i 30 minutter.
- Klon gel-oprensede PCR-produkter ved hjælp af TOPO TA Kloning kit. Transformer produkterne fra TOPO reaktion i den medfølgende E. coli DH5α-T1 R kompetente celler og plade på LB / agarplader indeholdende 100 mikrogram / mL ampicillin og suppleres med 1,6 mg X-gal i henhold til producentens anbefalinger.
- Send enkelte kolonier til sekvensering.
- Udføre sekvens analyse for at fastslå typer og placeringer af mutationer.
9. Repræsentative resultater:
Som nævnt før, bruger vi en positiv kontrol viral vektor der udtrykker både GFP samt en puromycin-resistens genet. Vi typisk ser 50-75% GFP + celler to dageefter transfektion. I vores infektioner, vi typisk ser 50-70% celler er GFP + to dage efter infektion, men før valget. Efter udvælgelsen er færdig,> 95% af cellerne er GFP +.
Som repræsentant eksperimenter viser vi virkningerne af overekspression AID eller vælte en reparation faktor i Ramos celler. Konkret har vi transficeret en retroviral overekspression vektor for støtte knyttet via et IRES sted til Thy1.1 sammen med retroviral emballage vektor pKat2 ind BOSC 23 celler. Virus-holdige medier blev filtreret og derefter brugt til at inficere Ramos celler. Begge vildtype (WT) og støtte overekspression (AID hi) celler var enkelt celle seedet og dyrkes i 3 uger, hvorefter de blev analyseret for genekspression ved QRT-PCR (figur 2) og for IgM tab ved FACS (Figur 3 ). For FACS farvning, blev cellerne inkuberet med både 1:20 fortyndet PE-mærket α-human IgM antistof samt 1:400 fortyndet FITC-mærkede α-rotte CD90/mouseCD90.1 (Thy1.1) antistof. I en separat eksperiment blev lentiviruses indeholder enten en irrelevant shRNA (kontrol) eller en shRNA mod en high-fidelity DNA-reparation faktor forventes at beskytte mod SHM i BOSC 23 celler, og derefter smittede i en AID hi klon af Ramos celler. Igen var genekspression (Figur 4) og IgM tab (Figur 5) er analyseret i en enkelt celle kloner efter 3 uger. Siden reparationen faktor menes at yde beskyttelse mod mutationer under SHM, kan vi se en stigning i IgM tab og SHM i mangel af faktoren. Hvis vi havde slået-ned en faktor, der er involveret i at generere SHM-associerede mutationer, ville vi have set et fald i IgM tab i stedet.
Som forventet, vores QRT-PCR resultater viser en markant forøgelse af støtten umiddelbart efter infektion af celler med et støtteelement overekspression vektor (figur 2), mens niveauet af DNA-reparation faktor fald i overværelse af en målrettet shRNA mod denne faktor (Figur 4 ). Fordi enkelte Clones kan variere, kan du se en vis variation i genekspression niveauer. Fordi genekspression kan variere, er det nødvendigt at bekræfte udtryk i hvert enkelt klon du har planer om at analysere yderligere. Forskellige shRNAs mod det samme gen kan have forskellige virkninger på genekspression så godt, så du bør skærmen flere shRNAs at afgøre, hvilken har den største virkning. Knockdown kan også bekræftet på det protein niveau ved immunblotting. Ligeledes kan de enkelte kloner varierer meget i niveauet af IgM tab. Nogle kloner kunne demonstrere en "jackpot" effekt, hvor en IgM mutation fandt sted i en af de tidligste celledelinger - for eksempel, vil du se> 50% IgM tab simpelthen fordi en af cellerne blev IgM - på de to-celle stadium. Indflydelsen af disse kloner er minimeret ved at beregne medianen for flere enkelt celle kloner.
Figur 1. Skematisk for det transeuropæiskeinfektion, infektion og analyse af IgM tab. Se tekst for detaljer.
Figur 2. STØTTE overekspression i Ramos celler. WT og AID hi Ramos celler var enkelt celle klonede og dyrkes i 3 uger, på hvilket tidspunkt AID udtryk i de enkelte kloner blev målt ved QRT-PCR. GAPDH udtryk blev brugt til normalisering. WT blev sat til 1. Den gennemsnitlige værdi er angivet. * Angiver AP værdi <0,01, beregnet som et one-tailed Students t-test.
Figur 3. Øget IgM tab i AID hi celler i forhold til WT celler. Overflade IgM blev målt ved FACS på 3 uger tidspunkt, og procentdelen af IgM tab var beregnet for WT og AID hi celler. (A) Repræsentative FACS handlingen i en WT klon og en AID hi klon. AID overekspression vEctor har støtte knyttet til Thy1.1 via et IRES site, så Thy1.1 Udtrykket anvendes som et surrogat for AID udtryk. (B) kvantificering af IgM tab i flere WT og AID hi kloner. Den gennemsnitlige værdi er angivet. * Angiver AP værdi <0,01, beregnet som et one-tailed Students t-test.
Figur 4. Knockdown af en reparation faktor i AID hi celler. Cellerne var smittet med enten en irrelevant shRNA kontrol (kontrol) eller vores shRNA af interesse (shRNA), og enkelt celle seedet. Efter 3 uger var genekspression i de enkelte kloner målt ved QRT-PCR. GAPDH udtryk blev brugt til normalisering. WT blev sat til 1. Den gennemsnitlige værdi er angivet. * Angiver AP værdi <0,01, beregnet som et one-tailed Students t-test.
Figur 5. Øget IgM tabi AID hi celler med bankede-down niveauer af en reparation faktor. Overflade IgM i flere kloner blev målt ved FACS på 3 uger tidspunkt, og procentdelen af IgM tabet blev beregnet i cellerne stadig overekspression AID. Den gennemsnitlige værdi er angivet. * Angiver AP værdi <0,01, beregnet som et one-tailed Students t-test.
. Tabel 1 Primer sekvenser for Ig gener 19: den konstante region Cμ, den tunge kæde V-regionen (V H), og den lette kæde V-regionen (V L).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som nævnt tidligere, har cellelinje modeller for antistof diversificering blevet et populært udgangspunkt for at identificere nye proteiner, der påvirker forskellige trin i antistof diversificering. Vi præsenterer her en metode til at bruge viral infektion til enten knock-down eller overekspression proteiner i Ramos B-celle linje og derefter undersøge indvirkningen på SHM.
Til disse undersøgelser anvender vi både WT Ramos og AID hi Ramos celler. WT celler kan bruges til at studere faktorer involveret i at målrette eller udtryk for støtte, samt reparation af AID-genereret læsioner, mens AID hi celler udelukke faktorer, der påvirker AID udtryk.
Det skal også bemærkes, at SHM måles her ved analysering for tab af IgM fra en population af celler, der er i første omgang IgM +. Alternativt er det muligt at starte med IgM -. Celler og kigge efter en gevinst på IgM + celler i en tilbagevenden assay 23 </ P>
Ved at bruge forskellige valg af markører (f.eks puromycin, hygromycin, GFP, eller Thy1.1), kan vi også udføre flere infektioner på samme tid med samme protokol. Vi har dog konstateret, at når du bruger to forskellige antibiotika vælgemærkerne, om sensitiviteten af cellerne forandring. Det vil være nødvendigt at foretage yderligere dræbe kurver for at optimere betingelserne for valg med to antibiotika på én gang. Vi kan let generere dobbelt knock-downs af to forskellige faktorer eller en knock-down af én faktor, plus en overekspression af anden osv.
Vi har også tilpasset denne protokol for andre B-celle-line modeller så godt. For eksempel, med CH12F3-2 celler (en mus B-cellelinie bruges til at studere CSR) 26,27 kan det samme infektion trin bruges til at inficere 1 x 10 6 CH12F3-2 celler seedede på dagen for infektion (variation af trin 4.1). Disse celler er markeret med 1 mg / ml puromycin. Tilsvarende, den samme protokol kan ogsåskal bruges til kylling DT40 celler - en cellelinie model for støtte-indledt genet konvertering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Den pMSCV-AID-I-Thy1.1 og pKat2 vektorer var en slags gave fra GD Schatz og pVSV-G, pRSV-Rev, og pMDLg / pRRE vektorer var en slags gave fra BR Cullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Suggested reagents - most of these may be substituted with similar products from other vendors. | |||
| 6-well clear TC-treated plates | Corning | 3516 | |
| 10 mL BD Luer-Loksyringes | BD Biosciences | 309604 | |
| 24-well clear TC-treated plates | Corning | 3526 | |
| 96-well clear flat bottom polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3596 | |
| 100 mm TC-treated culture dishes | Corning | 430167 | |
| Acrodisc syringe filters, 0.45 μm | Pall Corporation | 4604 | |
| Agar | TEKnova, Inc. | A7777 | |
| Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A0166 | 100 mg/mL in water |
| BD FACSCanto II flow cytometer | BD Biosciences | or similar | |
| BD Falcon round bottom polystyrene tubes | BD Biosciences | 352054 | for FACS |
| BOSC 23 cells | ATCC | CRL-11270 | |
| CO2 incubator capable of 37°C | |||
| DMEM (Dulbecco′s modified Eagle′s medium) | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| FBS (fetal bovine serum) | Gemini Bio Products | 100-106 | |
| FITC α-rat CD90/mouse CD90.1 antibody | BioLegend | 202503 | FITC α-Thy1.1 |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Roche Group | 11814443001 | |
| HEPES buffer solution | Invitrogen | 15630-080 | |
| KAPA HiFi DNA polymerase | KAPA Biosystems | KK2101 | |
| LB Broth (lysogeny broth - Luria) Powder | Difco Laboratories | 240230 | |
| MISSION TRC shRNA bacterial glycerol stock | Sigma-Aldrich | shRNA vectors | |
| NCS (newborn calf serum) | Gemini Bio Products | 100-504 | |
| PBS (phosphate buffered solution) | Invitrogen | 70011 | diluted to 1x in water |
| PE α-human IgM antibody | BioLegend | 314508 | |
| PGS (penicillin-streptomycin-glutamine solution) | Gemini Bio Products | 400-110 | |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 107689 | 10 mg/mL in water |
| PureYield Plasmid Midiprep System | Promega Corp. | A2495 | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | 250 μg/mL in water |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28706 | |
| Ramos (RA 1) cells | ATCC | CRL-1596 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| SuperScript II | Invitrogen | 18064-022 | |
| SYBR FAST qPCR kit | KAPA Biosystems | KK4601 | |
| Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 18038-042 | |
| TOPO TA Cloning kit | Invitrogen | K4520-01 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596-026 | |
| Wizard SV Genomic DNA purification system | Promega Corp. | A2361 | |
| X-Gal [5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galatopyranoside] | Growcells | C-5687 | 40 mg/mL in DMSO |
References
- Di Noia, J. M., Neuberger, M. S. Molecular mechanisms of antibody somatic hypermutation. Annu. Rev. Biochem. 76, 1-22 (2007).
- Peled, J. U.
- Longerich, S., Basu, U., Alt, F., Storb, U. AID in somatic hypermutation and class switch recombination. Curr. Opin. Immunol. 18, 164-174 (2006).
- Bardwell, P. D. Altered somatic hypermutation and reduced class-switch recombination in exonuclease 1-mutant mice. Nat. Immunol. 5, 224-229 (2004).
- Martomo, S. A., Yang, W. W., Gearhart, P. J. A role for Msh6 but not Msh3 in somatic hypermutation and class switch recombination. J. Exp. Med. 200, 61-68 (2004).
- Phung, Q. H. Increased hypermutation at G and C nucleotides in immunoglobulin variable genes from mice deficient in the MSH2 mismatch repair protein. J. Exp. Med. 187, 1745-1751 (1998).
- Rada, C., Ehrenstein, M. R., Neuberger, M. S., Milstein, C. Hot spot focusing of somatic hypermutation in MSH2-deficient mice suggests two stages of mutational targeting. Immunity. 9, 135-141 (1998).
- Rada, C. Immunoglobulin isotype switching is inhibited and somatic hypermutation perturbed in UNG-deficient mice. Curr. Biol. 12, 1748-1755 (2002).
- Delbos, F., Aoufouchi, S., Faili, A., Weill, J. C., Reynaud, C. A. DNA polymerase eta is the sole contributor of A/T modifications during immunoglobulin gene hypermutation in the mouse. J. Exp. Med. 204, 17-23 (2007).
- Masuda, K. DNA polymerase eta is a limiting factor for A:T mutations in Ig genes and contributes to antibody affinity maturation. Eur. J. Immunol. 38, 2796-2805 (2008).
- Lim, D. S., Hasty, P. A mutation in mouse rad51 results in an early embryonic lethal that is suppressed by a mutation in p53. Mol. Cell. Biol. 16, 7133-7143 (1996).
- Xiao, Y., Weaver, D. T. Conditional gene targeted deletion by Cre recombinase demonstrates the requirement for the double-strand break repair Mre11 protein in murine embryonic stem cells. Nucleic. Acids. Res. 25, 2985-2991 (1997).
- Zhu, J., Petersen, S., Tessarollo, L., Nussenzweig, A. Targeted disruption of the Nijmegen breakage syndrome gene NBS1 leads to early embryonic lethality in mice. Curr. Biol. 11, 105-109 (2001).
- Luo, G. Disruption of mRad50 causes embryonic stem cell lethality, abnormal embryonic development, and sensitivity to ionizing radiation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7376-7381 (1999).
- Pavri, R. Activation-induced cytidine deaminase targets DNA at sites of RNA polymerase II stalling by interaction with Spt5. Cell. 143, 122-133 (2010).
- Lee-Theilen, M., Matthews, A. J., Kelly, D., Zheng, S., Chaudhuri, J. CtIP promotes microhomology-mediated alternative end joining during class-switch recombination. Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 75-79 (2011).
- Basu, U. The RNA exosome targets the AID cytidine deaminase to both strands of transcribed duplex DNA substrates. Cell. 144, 353-363 (2011).
- Yabuki, M., Fujii, M. M., Maizels, N. The MRE11-RAD50-NBS1 complex accelerates somatic hypermutation and gene conversion of immunoglobulin variable regions. Nat. Immunol. 6, 730-736 (2005).
- Sale, J. E., Neuberger, M. S. TdT-accessible breaks are scattered over the immunoglobulin V domain in a constitutively hypermutating B cell line. Immunity. 9, 859-869 (1998).
- Cumbers, S. J. Generation and iterative affinity maturation of antibodies in vitro using hypermutating B-cell lines. Nat. Biotechnol. 20, 1129-1134 (2002).
- Papavasiliou, F. N., Schatz, D. G. Cell-cycle-regulated DNA double-stranded breaks in somatic hypermutation of immunoglobulin genes. Nature. 408, 216-221 (2000).
- Parsa, J. Y. AID mutates a non-immunoglobulin transgene independent of chromosomal position. Mol. Immunol. 44, 567-575 (2007).
- Zhang, W. Clonal instability of V region hypermutation in the Ramos Burkitt's lymphoma cell line. Int. Immunol. 13, 1175-1184 (2001).
- Ukai, A. Induction of a:T mutations is dependent on cellular environment but independent of mutation frequency and target gene location. J. Immunol. 181, 7835-7842 (2008).
- Dull, T. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J. Virol. 72, 8463-8471 (1998).
- Nakamura, M. High frequency class switching of an IgM+ B lymphoma clone CH12F3 to IgA+ cells. Int. Immunol. 8, 193-201 (1996).
- Muramatsu, M. Specific expression of activation-induced cytidine deaminase (AID), a novel member of the RNA-editing deaminase family in germinal center B cells. J. Biol. Chem. 274, 18470-18476 (1999).
