Summary
Vi beskriver hvordan du utfører retrovirale eller lentiviral infeksjoner i overekspresjon eller shRNA inneholder konstruerer i den menneskelige Ramos B-celle linje og hvordan måle somatiske hypermutation i disse cellene.
Abstract
B-celler starter sitt liv med lav affinitet antistoffer genereres av V (D) J rekombinasjon. Men når det oppdages et patogen, er den variable (V) region av et immunoglobulin (Ig) genet mutert omtrent 100.000 ganger mer enn resten av genom gjennom somatiske hypermutation (SHM), som resulterer i høy affinitet antistoffer 1,2. I tillegg produserer klasse bytte rekombinasjon (CSR) antistoffer med forskjellige effektor funksjoner avhengig av typen av immunrespons som er nødvendig for en bestemt patogen. Både CSR og SHM er initiert av aktivisering-indusert cytidin deaminase (AID), som deaminates cytosin rester i DNA til å produsere uracils. Disse uracils behandles av feilutsatt former for reparasjon pathways, til slutt fører til mutasjoner og rekombinasjon 1-3.
Vår nåværende forståelse av molekylære detaljene i SHM og CSR kommer fra en kombinasjon av studier i mus, primære celler, cellelinjer, og celle-fRee eksperimenter. Musemodeller forblir gullstandarden med genetisk knockouts viser kritiske roller for mange reparasjon faktorer (f.eks Ung, Msh2, Msh6, Exo1, og polymerase η) 4-10. Men ikke alle gener er mottagelig for knockout studier. For eksempel, knockouts av flere dobbel tråd pause reparasjons proteiner er embryonically dødelig eller forringe B-celle utvikling 11-14. Dessuten, noen ganger spesifikk funksjon av et protein i SHM eller CSR kan maskeres av mer global defekter forårsaket av knockout. I tillegg kan siden eksperimenter i mus være lange, endre uttrykket av individuelle gener i celle linjer har blitt et stadig mer populært første skritt for å identifisere og karakterisere kandidat gener 15-18.
Ramos - en Burkitt lymfom cellelinje som konstitutivt gjennomgår SHM - har vært et populært celle-line modell for å studere SHM 18-24. En fordel med Ramos celler er at de har en innebygd praktisk semi-Kvantitative mål på SHM. Wild typen celler uttrykker IgM, og som de plukker opp mutasjoner, noen av mutasjonene knock out IgM uttrykk. Derfor analysere IgM tap av fluorescens-aktivert celle skanning (FACS) gir en rask lese-out for nivået på SHM. En mer kvantitativ måling av SHM kan fås ved direkte sekvensering antistoffet gener.
Siden Ramos celler er vanskelig å transfektere, produserer vi stabile derivater som har økt eller senket uttrykk for en individuell genet ved å infisere celler med retrovirale eller lentiviral konstruksjoner som inneholder enten en overekspresjon kassett eller en kort hårnål RNA (shRNA), henholdsvis. Her beskriver vi hvordan vi infisere Ramos celler og deretter bruke disse cellene til å undersøke hvilken rolle spesifikke gener på SHM (Figur 1).
Protocol
1. Forbereder prøver og celler
- Utfør en medium skala utarbeidelse av DNA (midiprep) av overekspresjon eller shRNA inneholder konstruerer og retrovirale emballasjen vektor pKat2 eller lentiviral emballasjen vektorer pVSV-G, pMDLg / pRRE og pRSV-Rev 25. Bruk 6 mikrogram DNA for hver konstruere og enten 4 mikrogram pKat2 (for retrovirale infeksjoner) eller 1,5 mikrogram DNA for hver av de pVSV-g, pMDLg / pRRE og pRSV-Rev emballasje vektorer (for lentiviral infeksjoner).
- Klargjør Bosc 23 media. For transfeksjon, bruke både uendret Dulbecco modifiserte Eagle medium (DMEM) samt komplette DMEM. For å gjøre komplett DMEM, tilsett 1% HEPES buffer, 1% penicillin-streptomycin-glutamin (PGS), og 10% nyfødt kalv serum (NCS) til en flaske DMEM.
- Klargjør Ramos media. For infeksjonen trinnet, gjør komplett RPMI-1640 medium (RPMI) ved å tilsette 1% HEPES, 1% PGS, og 10% fetal bovint serum (FBS) til en flaske RPMI. For enkelt celle seeding trinn, mÅke "betinget" media ved å dyrke Ramos celler i fullstendig RPMI for 2 dager, spinning ned cellene nede på 400 X g for 4 minutter og filtrering supernatanten med et 0,2 mikrometer filter i en steril flaske. Som andre komplett media, er betinget media lagret ved 4 ° C inntil nødvendig.
- Split 3 x 10 6 Bosc 23 celler i en 100 mm-plate i 10 ml komplett DMEM dagen før transfeksjon slik at cellene vil være på 50-60% confluency dag transfeksjon. Lag en plate av celler for hver vektor du har tenkt på transfecting. Det er viktig at cellene ikke har vært holdt i kultur for lenge, bruk lav passasje antall celler eller nylig tint celler for både transfeksjon og infeksjon skritt for å sikre en god infeksjon.
- Inkludere kontroller for dine eksperimenter. For transfections og infeksjoner, skaper en negativ kontroll (untransfected eller infiserte celler) og en positiv kontroll (virus som uttrykker GFP og puromycin-motstand genet). For shRNA knock-down kompetanseiments, infisere en brønn med en kryptert eller irrelevante shRNA kontroll.
2. Transfecting Bosc 23 celler
- Varme flasker uendret DMEM og fullstendig DMEM ved 37 ° C.
- Fjern utskriftsmateriale fra Bosc 23 celler og erstatte med 5 mL av komplette DMEM. Tilbake cellene til en 37 ° C inkubator til bruk i trinn 2.6.
- Varme flaske FuGENE 6 ved romtemperatur i 5 minutter så kort vortex (<1 sekund).
- Delmengde 600 mL uendret DMEM inn i en 1,5 mL mikrosentrifuge tube.
- Fortynne 30 mL FuGENE 6 til 600 mL uendret DMEM, vortex kort (<1 sekund), og deretter Inkuber ved romtemperatur i fem minutter. Vær forsiktig med å pipette direkte inn i media. Ikke la FuGENE 6 berører sidene av røret.
- Tilsett 6 mikrogram konstruere og enten 4 mikrogram pKat2 (retrovirale infeksjoner) eller 1,5 mg hver av pVSV-G, pMDLg / pRRE og pRSV-Rev (lentiviral infeksjoner) til DMEM / FuGENE 6 mix, vortex BRI efly (<1 sekund), og deretter Inkuber ved romtemperatur i 25 minutter.
- Legg til DNA / DMEM / FuGENE seks mix til Bosc 23 celler og gå tilbake til 37 ° C inkubator i 24 timer.
- Etter 24 timer, tilsett 5 ml komplett DMEM til transfektert cellene og gå tilbake til 37 ° C inkubator i ytterligere 24 timer.
3. Høsting viruspartikler
- Høste de 10 ml av media fra transfektert Bosc 23 celler med en 10 ml sprøyte.
- Fest en 0,45 mikrometer filter til enden av sprøyten og filter media i en ren 15 mL polypropylen tube.
- Bruk viral media umiddelbart eller fryse som 1 ml alikvoter i 2 mL kryogene ampuller ved -80 ° C.
- Etter høsting av viral media, bekrefter at effektiv transfeksjon har skjedd i positiv kontroll celler ved FACS. Dette kan også gjøres for alle prøver hvis konstruere inneholder enten et lysrør (f.eks GFP) eller en celle-overflate markør (f.eks Thy1).
- Seed 2 mL av 2 x 10 5 celler / ml Ramos celler i fullstendig RPMI inn i en 6-brønns plate 24 timer før infeksjon. Igjen, husk å bruke lav passasje antall celler eller nylig tint celler for å sikre god infeksjon.
- Hvis du bruker frosne alikvoter av virus, tine viral media raskt ved 37 ° C.
- Bland 1 mL viral media med 3 mL av 10 mg / ml polybrene. Den endelige konsentrasjonen av polybrene bør være 10 mg / ml i et totalt volum på 3 ml.
- Legg til virus / polybrene mix til cellene og bland godt med pipettering. Som nevnt tidligere, en brønn bør brukes som en frisk kontroll, tilsett 1 ml komplett RPMI og 3 mL polybrene til denne brønnen i stedet for 1 mL virus. Pass på å infisere en brønn med en matchet negativ kontroll. Vi har også infisere en brønn med en GFP inneholder vektor, for å fastslå infeksjon effektivitet ved FACS.
- Sentrifuger seks-brønns plate ved 3000 X g i 90 minutter ved romtemperatur.
- Tilbake platen tilen 37 ° C inkubator i 48 timer.
- Etter 48 timer, spinn ned den infiserte celler i en 15 mL polypropylen rør på 400 X g for 4 minutter ved romtemperatur. Fjern media ved aspirasjon, være sikker på å ikke forstyrre cellen pellet. Suspender cellene i frisk RPMI.
- Bekrefte effektiviteten av infeksjon i positiv kontroll prøven ved FACS. Som før, kan du gjøre dette for alle dine prøver hvis konstruere inneholder enten et lysrør (f.eks GFP) eller en celle-overflate markør (f.eks Thy1).
- Begynn utvalg av celler (eventuelt). Våre shRNA inneholder konstruerer alle inneholder en puromycin motstand kassett. Vi velger shRNA-infiserte Ramos celler med 0,25 mg / ml puromycin. Vi finner at derivater av Ramos celler iblant show endret mottakelighet for puromycin, og derfor utfører vi drepe kurver å optimalisere konsentrasjonen av puromycin for hvert derivat. Også behandle friske kontroll celler med puromycin å bekrefte at valget er effektiv.
Enkelt seeding kan utføres på to måter: ved FACS sortering eller manuelt.
- FACS: Bruk en FACS sorter med en plate adapter til frø en celle / brønn i en 96-brønns plate pre-fylt med 100 mL av 40% RPMI/40% betinget media/20% FBS. Denne metoden gir en mye mer enkelt celle kloner per plate.
- Manuelt: Tell celler. Fortynn en delmengde av celler til 10 celler / ml i 40% RPMI/40% betinget media/20% FBS. Bruk 10 ml av fortynnet celler for hver seeded plate. Ulike kloner vil vise variable recovery på dette stadiet derfor er det nyttig å sette opp flere plater på ulike konsentrasjoner (alt 3-20 celler / ml). Bruk den som produserer færre utvekster å unngå kloner som følge av flere celler). Bruk en multikanal pipette til frø 96-brønn plater med 100 mL fortynnet celler.
- Sett platen i en 37 ° C inkubator i 2 uker.
- Sjekk individuelle brønner under mikroskop for å bekrefte tilstedeværelse av celler en dag etter seeding. Enkeltceller kan være vanskelig å finne på grunn av behovet for å fokusere på riktig dybde. Fokusering på brønnen tallene trykt på bunnen av den 96-bra plate bør hjelpe. Celler er lettere å finne når dekkes av FACS sorter siden de fleste brønner har en celle.
- Etter 2 uker, kan økende kolonier være knapt sett av blotte øye ved å se på platene fra undersiden. De er mye lettere å se under mikroskopet. Colonies tendens til å vokse langs kantene av brønnen og vanligvis mest kolonier i en plate vokser langs samme kant i forskjellige brønner. Marker brønner med robust cellevekst og overfør cellene til 24-brønn plater i 1 mL RPMI og gå tilbake til 37 ° C inkubator.
- Vedlikeholde celler ved 1 x 10 5 til 1 x 10 6 celler / ml. Endre media ved å spinne cellene på 400 X g for 4 minutter ved romtemperatur og fjerne media etter behov. Bytt ut med 1 mL frisk RPMI.
- Etter flere days av vekst, overføre cellene til en 6-brønn plate og fortsette å vokse i et 37 ° C inkubator.
- Etter 3 uker, analysere kloner for IgM tap (som beskrevet nedenfor).
- Fortsett å dyrke cellene i 2 uker og deretter analysere kloner igjen på 5 ukers tidspunkt.
Seks. Analyse: IgM tap (3 uker og 5 uker)
- Delmengde 5 x 10 5 celler fra hver brønn inn i en 1,5 mL mikrosentrifuge tube og spinne celler ned på 400 X g for 4 minutter ved romtemperatur. Bruk celler fra hver av kontroll og shRNA-knock-down brønner, samt én prøve for en unstained kontroll.
- Vask cellene i 1 mL PBS og deretter spinne igjen på 400 X g for 4 minutter ved romtemperatur.
- Resuspender i 50 mL PBS (unstained kontroll) eller PBS + 01:20 utvanning av PE-merket α-human IgM antistoff. Inkuber på is for 1 time.
- Spinn cellene ned ved 400 X g for 4 minutter ved romtemperatur.
- Vask calen to ganger med 1 mL PBS og spinn for 400 X g for 4 minutter hver gang ved romtemperatur.
- Fjern supernatanten og resuspender i 100 mL PBS. Overfør resuspendert farget cellene til en FACS tube.
- Analyser cellene ved hjelp av en FACS maskin.
- Sammenlign prosentandelen av IgM - celler fra kontrollene vs shRNA slått ned celler. Som nevnt før, er IgM tapet målt ved FACS en pålitelig semi-kvantitative mål på SHM i Ramos celler.
7. Analyse: Bekreft knock-down av kvantitativ RT-PCR (5 uker)
- Delmengde 3 x 10 6 celler fra hver brønn og spinn ned på 400 X g for 4 minutter ved romtemperatur.
- Forbered RNA fra delmengde av celler. Vi bruker TRIzol henhold til produsentens anbefalinger.
- Forbered cDNA fra RNA prep. Vi bruker to mikrogram RNA og Hevet II i henhold til produsentens anbefalinger.
- Utfør en kvantitativ PCR hjelp av cDNA til confirm knock-down. Vi bruker GAPDH som en normalisering kontroll, og SYBR FAST qPCR kit i en 10 mL total reaksjon volum.
8. Analyse: Genomisk sekvensering (5 uker)
- Delmengde 5 x 10 6 celler fra hver brønn og spinn ned på 400 X g for 4 minutter ved romtemperatur.
- Isoler genomisk DNA fra disse cellene. Vi bruker Wizard SV genomisk DNA rensing kit i henhold til produsentens anbefalinger.
- PCR forsterke genomisk DNA for Ig V genene 19 (tabell 1) og eventuelle andre gener av interesse å bruke KAPA HiFi DNA polymerase. Vi bruker denne polymerase på grunn av sin lave feil priser, men noen hi-fi-PCR-polymerase bør være akseptabel.
- Gel renser PCR produktene på en 1% agarose gel bruker QIAquick gel utvinning kit.
- Noen polymeraser legge en eneste deoxyadenosine (A) rester til 3 'endene av PCR produktene, mens andre ikke. Disse 3 'A haler er nødvendig for topo TAkloning trinn. Den KAPA HiFi polymerase ikke etterlater 3 'A haler. A-hale PCR produktene ved incubating 25 mL gel-renset PCR produkt med 3 mL 10x Taq reaksjon buffer, 1 mL 10 mm dNTPs, og 1 enhet Taq polymerase ved 72 ° C i 30 minutter.
- Klone gel-renset PCR produkter ved hjelp av Topo TA Cloning kit. Transformere produkter fra Topo reaksjonen til de medfølgende E. coli DH5α-T1 R kompetente celler og plate på LB / agar plater som inneholder 100 mikrogram / ml ampicillin og supplert med 1,6 mg av X-gal i henhold til produsentens anbefalinger.
- Send individuelle kolonier for sekvensering.
- Utfør sekvens analyse for å bestemme typer og steder av mutasjoner.
9. Representant Resultater:
Som nevnt før, bruker vi en positiv kontroll viral vektor som uttrykker både GFP samt en puromycin-motstand genet. Vi vanligvis ser 50-75% GFP + celler to dageretter transfeksjon. I vår infeksjoner, vi vanligvis ser er 50-70% celler GFP + to dager etter smitte, men før valget. Etter valget er ferdig,> 95% av cellene er GFP +.
Som representant eksperimenter, viser vi effekten av overekspresjon hjelp eller slå ned en reparasjon faktor i Ramos celler. Spesielt transfektert vi en retrovirale overekspresjon vektor for AID koblet via en IRES nettsted til Thy1.1 sammen med retrovirale emballasjen vektor pKat2 inn Bosc 23 celler. Virus som inneholder media ble filtrert og deretter brukt til å infisere Ramos celler. Både vill type (WT) og AID overekspresjon (AID hi) celler var enkelt celle sådd og dyrket i 3 uker, og da de ble analysert for genuttrykk ved QRT-PCR (figur 2) og for IgM tap av FACS (figur 3 ). For FACS flekker, ble cellene inkubert med både 01:20 utvannet PE-merket α-human IgM antistoff samt 1:400 fortynnede FITC-merket α-rotte CD90/mouseCD90.1 (Thy1.1) antistoff. I et separat eksperiment ble lentiviruses inneholder enten en irrelevant shRNA (kontroll) eller en shRNA mot en high-fidelity DNA reparasjon faktor forventes å beskytte mot SHM gjort i Bosc 23 celler, og deretter smittet til et hjelpemiddel hi klone av Ramos celler. Igjen var genekspresjon (figur 4) og IgM tap (figur 5) analysert i én celle kloner etter 3 uker. Siden reparasjon faktoren er tenkt å gi beskyttelse mot mutasjoner under SHM, ser vi en økning i IgM tap og SHM i fravær av faktoren. Hvis vi hadde slått ned en faktor involvert i generering SHM-assosierte mutasjoner, ville vi ha sett en nedgang i IgM tap i stedet.
Som forventet, vår QRT-PCR resultater viser en markert økning i bistand uttrykk følgende infeksjon av celler med et hjelpemiddel overekspresjon vektor (figur 2), mens nivået av DNA-reparasjon faktor fall i nærvær av en målrettet shRNA mot at factor (Figur 4 ). Fordi individuelle clones kan variere, kan du se noen variasjoner i genuttrykk nivåer. Fordi genuttrykk kan variere, er det nødvendig å bekrefte uttrykket i hver klone du har tenkt på å analysere videre. Ulike shRNAs mot det samme genet kan ha ulik effekt på genuttrykk i tillegg, så du bør skjermen flere shRNAs å avgjøre hvilke har størst innvirkning. Knockdown kan også være bekreftet på protein nivå ved immunoblotting. Likeledes kan den enkelte kloner varierer sterkt i nivå av IgM tap. Noen kloner kunne demonstrere en "jackpot" effekt, der en IgM mutasjon oppstod i en av de tidligste celledelinger - for eksempel, vil du se> 50% IgM tap bare fordi en av cellene ble IgM - på de to-cellers stadiet. Påvirkningen av disse kloner er minimert ved å beregne median for flere enkelt celle kloner.
Figur 1. Skjematisk for det transeuropeiskesjon, infeksjon og analyse av IgM tap. Se teksten for detaljer.
Figur 2. AID overekspresjon i Ramos celler. WT og AID hi Ramos celler ble enkelt celle klonet og dyrket i 3 uker, og da AID uttrykk i de enkelte kloner ble målt ved QRT-PCR. GAPDH uttrykket ble brukt for normalisering. WT ble satt til 1. Medianverdien er indikert. * Indikerer ap verdi <0,01, beregnet som ensidige Student t-test.
Figur 3. Økte IgM tap i bistand hi celler i forhold til WT celler. Surface IgM ble målt ved FACS på 3 ukers tidspunkt, og andelen av IgM tap ble beregnet for WT og AID hi celler. (A) Representant FACS handlingen i en WT klone og et hjelpemiddel hi klone. AID overekspresjon vEctor har bistanden knyttet til Thy1.1 via en IRES nettsted, så Thy1.1 uttrykket brukes som et surrogat for AID uttrykk. (B) Kvantitering av IgM tap i flere WT og AID hi kloner. Medianverdien er indikert. * Indikerer ap verdi <0,01, beregnet som ensidige Student t-test.
Figur 4. Knockdown av en reparasjon faktor i bistand hi celler. Celler ble infisert med enten en irrelevant shRNA kontroll (kontroll) eller vår shRNA av interesse (shRNA), og enkelt celle seedet. Etter 3 uker var genuttrykk i individuelle kloner målt ved QRT-PCR. GAPDH uttrykket ble brukt for normalisering. WT ble satt til 1. Medianverdien er indikert. * Indikerer ap verdi <0,01, beregnet som ensidige Student t-test.
Figur 5. Økt IgM tapi bistand hi celler med slo ned nivåene av en reparasjon faktor. Surface IgM i flere kloner ble målt ved FACS på 3 ukers tidspunkt, og andelen av IgM tap ble beregnet i cellene fortsatt overekspresjon AID. Medianverdien er indikert. * Indikerer ap verdi <0,01, beregnet som ensidige Student t-test.
. Tabell 1 Primer sekvenser for Ig genene 19: den konstante regionen Cμ, de tunge kjeden V-regionen (V H), og lyset kjeden V-regionen (V L).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som diskutert tidligere, har cellelinje modeller for antistoff diversifisering blitt et populært utgangspunkt for å identifisere nye proteiner som påvirker ulike trinnene i løpet av antistoff diversifisering. Vi presenterer her en metode for å bruke viral infeksjon enten knock-down eller overuttrykker proteiner i Ramos B-celle linje og deretter undersøke virkningen på SHM.
For disse studiene benytter vi både WT Ramos og AID hi Ramos celler. WT cellene kan brukes til å studere faktorer involvert i målrettet eller et uttrykk av bistand samt reparasjon av AID-genererte lesjoner, mens AID hi celler ekskludere faktorer som påvirker AID uttrykk.
Det bør også bemerkes at SHM måles her ved å analysere for tap av IgM fra en populasjon av celler som er utgangspunktet IgM +. Alternativt er det mulig å starte med IgM -. Celler og se etter en gevinst på IgM + celler i et hjemfall analysen 23 </ P>
Ved å bruke forskjellige utvalg markører (f.eks puromycin, hygromycin, GFP, eller Thy1.1), kan vi også utføre flere infeksjoner samtidig med samme protokoll. Vi har imidlertid funnet ut at når man bruker to forskjellige antibiotika markeringsindikatorene, følsomheten til cellene endringen. Det vil være nødvendig å utføre flere drepe kurver for å optimalisere forholdene for valg med to antibiotika samtidig. Vi kan lett generere doble knock-downs av to forskjellige faktorer eller en knock-down av én faktor pluss en overekspresjon av en annen, osv.
Vi har også tilpasset denne protokoll for andre B-celle-line modeller også. For eksempel med CH12F3-2 celler (en mus B-cellelinje som brukes til å studere CSR) 26,27, kan den samme infeksjonen trinn brukes til å infisere 1 x 10 6 CH12F3-2 celler seeded på dagen for infeksjon (variant av steg 4,1). Disse cellene er valgt med 1 mikrogram / mL puromycin. Likeledes, den samme protokollen kan ogsåbrukes for kylling DT40 celler - en cellelinje modell for AID-initiert genet konvertering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Den pMSCV-Aid-I-Thy1.1 og pKat2 vektorer var en slags gave fra DG Schatz og pVSV-G, pRSV-Rev, og pMDLg / pRRE vektorer var en slags gave fra BR Cullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Suggested reagents - most of these may be substituted with similar products from other vendors. | |||
| 6-well clear TC-treated plates | Corning | 3516 | |
| 10 mL BD Luer-Loksyringes | BD Biosciences | 309604 | |
| 24-well clear TC-treated plates | Corning | 3526 | |
| 96-well clear flat bottom polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3596 | |
| 100 mm TC-treated culture dishes | Corning | 430167 | |
| Acrodisc syringe filters, 0.45 μm | Pall Corporation | 4604 | |
| Agar | TEKnova, Inc. | A7777 | |
| Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A0166 | 100 mg/mL in water |
| BD FACSCanto II flow cytometer | BD Biosciences | or similar | |
| BD Falcon round bottom polystyrene tubes | BD Biosciences | 352054 | for FACS |
| BOSC 23 cells | ATCC | CRL-11270 | |
| CO2 incubator capable of 37°C | |||
| DMEM (Dulbecco′s modified Eagle′s medium) | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| FBS (fetal bovine serum) | Gemini Bio Products | 100-106 | |
| FITC α-rat CD90/mouse CD90.1 antibody | BioLegend | 202503 | FITC α-Thy1.1 |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Roche Group | 11814443001 | |
| HEPES buffer solution | Invitrogen | 15630-080 | |
| KAPA HiFi DNA polymerase | KAPA Biosystems | KK2101 | |
| LB Broth (lysogeny broth - Luria) Powder | Difco Laboratories | 240230 | |
| MISSION TRC shRNA bacterial glycerol stock | Sigma-Aldrich | shRNA vectors | |
| NCS (newborn calf serum) | Gemini Bio Products | 100-504 | |
| PBS (phosphate buffered solution) | Invitrogen | 70011 | diluted to 1x in water |
| PE α-human IgM antibody | BioLegend | 314508 | |
| PGS (penicillin-streptomycin-glutamine solution) | Gemini Bio Products | 400-110 | |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 107689 | 10 mg/mL in water |
| PureYield Plasmid Midiprep System | Promega Corp. | A2495 | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | 250 μg/mL in water |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28706 | |
| Ramos (RA 1) cells | ATCC | CRL-1596 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| SuperScript II | Invitrogen | 18064-022 | |
| SYBR FAST qPCR kit | KAPA Biosystems | KK4601 | |
| Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 18038-042 | |
| TOPO TA Cloning kit | Invitrogen | K4520-01 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596-026 | |
| Wizard SV Genomic DNA purification system | Promega Corp. | A2361 | |
| X-Gal [5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galatopyranoside] | Growcells | C-5687 | 40 mg/mL in DMSO |
References
- Di Noia, J. M., Neuberger, M. S. Molecular mechanisms of antibody somatic hypermutation. Annu. Rev. Biochem. 76, 1-22 (2007).
- Peled, J. U.
- Longerich, S., Basu, U., Alt, F., Storb, U. AID in somatic hypermutation and class switch recombination. Curr. Opin. Immunol. 18, 164-174 (2006).
- Bardwell, P. D. Altered somatic hypermutation and reduced class-switch recombination in exonuclease 1-mutant mice. Nat. Immunol. 5, 224-229 (2004).
- Martomo, S. A., Yang, W. W., Gearhart, P. J. A role for Msh6 but not Msh3 in somatic hypermutation and class switch recombination. J. Exp. Med. 200, 61-68 (2004).
- Phung, Q. H. Increased hypermutation at G and C nucleotides in immunoglobulin variable genes from mice deficient in the MSH2 mismatch repair protein. J. Exp. Med. 187, 1745-1751 (1998).
- Rada, C., Ehrenstein, M. R., Neuberger, M. S., Milstein, C. Hot spot focusing of somatic hypermutation in MSH2-deficient mice suggests two stages of mutational targeting. Immunity. 9, 135-141 (1998).
- Rada, C. Immunoglobulin isotype switching is inhibited and somatic hypermutation perturbed in UNG-deficient mice. Curr. Biol. 12, 1748-1755 (2002).
- Delbos, F., Aoufouchi, S., Faili, A., Weill, J. C., Reynaud, C. A. DNA polymerase eta is the sole contributor of A/T modifications during immunoglobulin gene hypermutation in the mouse. J. Exp. Med. 204, 17-23 (2007).
- Masuda, K. DNA polymerase eta is a limiting factor for A:T mutations in Ig genes and contributes to antibody affinity maturation. Eur. J. Immunol. 38, 2796-2805 (2008).
- Lim, D. S., Hasty, P. A mutation in mouse rad51 results in an early embryonic lethal that is suppressed by a mutation in p53. Mol. Cell. Biol. 16, 7133-7143 (1996).
- Xiao, Y., Weaver, D. T. Conditional gene targeted deletion by Cre recombinase demonstrates the requirement for the double-strand break repair Mre11 protein in murine embryonic stem cells. Nucleic. Acids. Res. 25, 2985-2991 (1997).
- Zhu, J., Petersen, S., Tessarollo, L., Nussenzweig, A. Targeted disruption of the Nijmegen breakage syndrome gene NBS1 leads to early embryonic lethality in mice. Curr. Biol. 11, 105-109 (2001).
- Luo, G. Disruption of mRad50 causes embryonic stem cell lethality, abnormal embryonic development, and sensitivity to ionizing radiation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7376-7381 (1999).
- Pavri, R. Activation-induced cytidine deaminase targets DNA at sites of RNA polymerase II stalling by interaction with Spt5. Cell. 143, 122-133 (2010).
- Lee-Theilen, M., Matthews, A. J., Kelly, D., Zheng, S., Chaudhuri, J. CtIP promotes microhomology-mediated alternative end joining during class-switch recombination. Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 75-79 (2011).
- Basu, U. The RNA exosome targets the AID cytidine deaminase to both strands of transcribed duplex DNA substrates. Cell. 144, 353-363 (2011).
- Yabuki, M., Fujii, M. M., Maizels, N. The MRE11-RAD50-NBS1 complex accelerates somatic hypermutation and gene conversion of immunoglobulin variable regions. Nat. Immunol. 6, 730-736 (2005).
- Sale, J. E., Neuberger, M. S. TdT-accessible breaks are scattered over the immunoglobulin V domain in a constitutively hypermutating B cell line. Immunity. 9, 859-869 (1998).
- Cumbers, S. J. Generation and iterative affinity maturation of antibodies in vitro using hypermutating B-cell lines. Nat. Biotechnol. 20, 1129-1134 (2002).
- Papavasiliou, F. N., Schatz, D. G. Cell-cycle-regulated DNA double-stranded breaks in somatic hypermutation of immunoglobulin genes. Nature. 408, 216-221 (2000).
- Parsa, J. Y. AID mutates a non-immunoglobulin transgene independent of chromosomal position. Mol. Immunol. 44, 567-575 (2007).
- Zhang, W. Clonal instability of V region hypermutation in the Ramos Burkitt's lymphoma cell line. Int. Immunol. 13, 1175-1184 (2001).
- Ukai, A. Induction of a:T mutations is dependent on cellular environment but independent of mutation frequency and target gene location. J. Immunol. 181, 7835-7842 (2008).
- Dull, T. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J. Virol. 72, 8463-8471 (1998).
- Nakamura, M. High frequency class switching of an IgM+ B lymphoma clone CH12F3 to IgA+ cells. Int. Immunol. 8, 193-201 (1996).
- Muramatsu, M. Specific expression of activation-induced cytidine deaminase (AID), a novel member of the RNA-editing deaminase family in germinal center B cells. J. Biol. Chem. 274, 18470-18476 (1999).
