Summary

Bedöma Somatisk Hypermutation i Ramos B-celler efter överuttryck eller Knockdown av specifika gener

Published: November 01, 2011
doi:

Summary

Vi beskriver hur du utför retrovirala eller Lentiviral infektioner i överuttryck eller shRNA innehåller konstruktioner i människans Ramos B-cellinje och hur man mäter somatiska hypermutation i dessa celler.

Abstract

B-celler börja sitt liv med låg affinitet antikroppar genereras av V (D) J rekombination. Men efter att upptäcka en patogen är den rörliga (V) region i ett immunglobulin (IG) genen muterad ca 100 tusen gånger mer än resten av genomet genom somatisk hypermutation (SHM), vilket resulterar i hög affinitet antikroppar 1,2. Dessutom producerar klass växla rekombination (CSR) antikroppar med olika effektorfunktioner beroende på vilken typ av immunsvar som behövs för en viss patogen. Både CSR och SHM initieras av aktivering-inducerad cytidindeaminas (AID), som deaminates cytosin rester i DNA för att producera uracils. Dessa uracils behandlas av felbenägen former av reparationer vägar, till slut leder till mutationer och rekombination 1-3.

Vår nuvarande förståelse av de molekylära detaljerna i SHM och CSR kommer från en kombination av studier på möss, galvaniska element, cellinjer, och cell-free experiment. Musmodeller kvar guldmyntfoten med genetiska knockouts visar kritiska roller för många reparation faktorer (t.ex. Ung, MSH2, Msh6, Exo1 och polymeras η) 4-10. Men inte alla gener kan bli föremål för knockout studier. Till exempel knockouts av flera dubbel-strand proteiner paus reparationer embryonically dödliga eller försämra B-cells utveckling 11-14. Dessutom ibland särskilda funktion av ett protein i SHM, eller CSR kan maskeras av mer globala fel orsakade av knockout. Dessutom kan eftersom experiment på möss vara långa, ändra uttrycket av enskilda gener i cellinjer har blivit ett allt populärare första steget att identifiera och karakterisera gener 15-18.

Ramos – en Burkitt lymfom cellinje som konstitutivt genomgår SHM – har varit ett populärt cell-line modell för att studera SHM 18-24. En fördel med Ramos celler är att de har en inbyggd bekväm semi-Kvantitativa mått på SHM. Vildtyp celler uttrycka IgM och, som de plockar upp mutationer, några av de mutationer som slår ut IgM uttryck. Därför testmetoder IgM förlust av fluorescens-aktiverade celler skanning (FACS) ger en snabb läs-out för nivån på SHM. En mer kvantitativ mätning av SHM kan erhållas genom att direkt sekvensering antikroppen gener.

Eftersom Ramos celler är svåra att transfektera, vi producerar stabila derivat som har ökat eller sänkt uttryck av en enskild gen genom att infektera celler med retrovirus eller Lentiviral konstruktioner som innehåller antingen ett överuttryck kassett eller en kort hårnål RNA (shRNA), respektive. Här beskriver vi hur vi infektera Ramos celler och sedan använda dessa celler för att undersöka betydelsen av specifika gener på SHM (Figur 1).

Protocol

1. Förbereda prover och celler Utför en medelstor skala preparation av DNA (midiprep) av överuttryck eller shRNA innehåller konstruerar och retrovirus förpackningen vektor pKat2 eller Lentiviral vektorer förpackningen pVSV-G, pMDLg / pRRE och pRSV-Rev 25. Använd 6 mikrogram DNA för varje konstruera och antingen 4 mikrogram pKat2 (för retrovirus infektioner) eller 1,5 mikrogram DNA för varje pVSV-g, pMDLg / pRRE och pRSV-Rev vektorer förpackningar (för Lentiviral infektioner). …

Discussion

Som diskuterats tidigare har cellinje modeller för antikropp diversifiering blivit en populär utgångspunkt för att identifiera nya proteiner som påverkar olika steg under antikropp diversifiering. Vi presenterar här en metod för att använda virusinfektion för att antingen slå ner eller överuttrycker proteiner i Ramos B-cell linje och sedan undersöka effekterna på SHM.

För dessa studier använder vi både WT Ramos och HJÄLPEN hej Ramos celler. WT celler kan användas…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Den pMSCV-AID-I-Thy1.1 och pKat2 vektorer var en slags gåva från GD Schatz och pVSV-G, pRSV-Rev, och pMDLg / pRRE vektorer var en slags gåva från BR Cullen.

Materials

Suggested reagents – most of these may be substituted with similar products from other vendors.

Name of the reagent Company Catalogue number Comments
6-well clear TC-treated plates Corning 3516  
10 mL BD Luer-Loksyringes BD Medical 309604  
24-well clear TC-treated plates Corning 3526  
96-well clear flat bottom polystyrene TC-treated microplates Corning 3596  
100 mm TC-treated culture dishes Corning 430167  
Acrodisc syringe filters, 0.45 μm Pall Life Sciences 4604  
Agar Teknova A7777  
Agarose GeneMate E-3120-500  
Ampicillin Sigma A0166 100 mg/mL in water
BD FACSCanto II flow cytometer BD Biosciences   or similar
BD Falcon round bottom polystyrene tubes BD Biosciences 352054 for FACS
BOSC 23 cells ATCC CRL-11270  
CO2 incubator capable of 37°C      
DMEM (Dulbecco′s modified Eagle′s medium) Sigma D6429  
FBS (fetal bovine serum) Gemini Bio-Products 100-106  
FITC α-rat CD90/mouse CD90.1 antibody BioLegend 202503 FITC α-Thy1.1
FuGENE 6 Transfection Reagent Roche 11814443001  
HEPES buffer solution Invitrogen 15630-080  
KAPA HiFi DNA polymerase KAPA Biosystems KK2101  
LB Broth (lysogeny broth – Luria) Powder Difco 240230  
MISSION TRC shRNA bacterial glycerol stock Sigma   shRNA vectors
NCS (newborn calf serum) Gemini Bio-Products 100-504  
PBS (phosphate buffered solution) Invitrogen 70011 diluted to 1x in water
PE α-human IgM antibody BioLegend 314508  
PGS (penicillin-streptomycin-glutamine solution) Gemini Bio-Products 400-110  
Polybrene (hexadimethrine bromide) Sigma 107689 10 mg/mL in water
PureYield Plasmid Midiprep System Promega A2495  
Puromycin Sigma P8833 250 μg/mL in water
QIAquick gel extraction kit QIAGEN 28706  
Ramos (RA 1) cells ATCC CRL-1596  
RPMI-1640 medium Sigma R8758  
SuperScript II Invitrogen 18064-022  
SYBR FAST qPCR kit KAPA Biosystems KK4601  
Taq DNA Polymerase Invitrogen 18038-042  
TOPO TA Cloning kit Invitrogen K4520-01  
TRIzol Invitrogen 15596-026  
Wizard SV Genomic DNA purification system Promega A2361  
X-Gal [5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galatopyranoside] Growcells C-5687 40 mg/mL in DMSO

References

  1. Di Noia, J. M., Neuberger, M. S. Molecular mechanisms of antibody somatic hypermutation. Annu. Rev. Biochem. 76, 1-22 (2007).
  2. Peled, J. U. The biochemistry of somatic hypermutation. Annu. Rev. Immunol. 26, 481-511 (2008).
  3. Longerich, S., Basu, U., Alt, F., Storb, U. AID in somatic hypermutation and class switch recombination. Curr. Opin. Immunol. 18, 164-174 (2006).
  4. Bardwell, P. D. Altered somatic hypermutation and reduced class-switch recombination in exonuclease 1-mutant mice. Nat. Immunol. 5, 224-229 (2004).
  5. Martomo, S. A., Yang, W. W., Gearhart, P. J. A role for Msh6 but not Msh3 in somatic hypermutation and class switch recombination. J. Exp. Med. 200, 61-68 (2004).
  6. Phung, Q. H. Increased hypermutation at G and C nucleotides in immunoglobulin variable genes from mice deficient in the MSH2 mismatch repair protein. J. Exp. Med. 187, 1745-1751 (1998).
  7. Rada, C., Ehrenstein, M. R., Neuberger, M. S., Milstein, C. Hot spot focusing of somatic hypermutation in MSH2-deficient mice suggests two stages of mutational targeting. Immunity. 9, 135-141 (1998).
  8. Rada, C. Immunoglobulin isotype switching is inhibited and somatic hypermutation perturbed in UNG-deficient mice. Curr. Biol. 12, 1748-1755 (2002).
  9. Delbos, F., Aoufouchi, S., Faili, A., Weill, J. C., Reynaud, C. A. DNA polymerase eta is the sole contributor of A/T modifications during immunoglobulin gene hypermutation in the mouse. J. Exp. Med. 204, 17-23 (2007).
  10. Masuda, K. DNA polymerase eta is a limiting factor for A:T mutations in Ig genes and contributes to antibody affinity maturation. Eur. J. Immunol. 38, 2796-2805 (2008).
  11. Lim, D. S., Hasty, P. A mutation in mouse rad51 results in an early embryonic lethal that is suppressed by a mutation in p53. Mol. Cell. Biol. 16, 7133-7143 (1996).
  12. Xiao, Y., Weaver, D. T. Conditional gene targeted deletion by Cre recombinase demonstrates the requirement for the double-strand break repair Mre11 protein in murine embryonic stem cells. Nucleic. Acids. Res. 25, 2985-2991 (1997).
  13. Zhu, J., Petersen, S., Tessarollo, L., Nussenzweig, A. Targeted disruption of the Nijmegen breakage syndrome gene NBS1 leads to early embryonic lethality in mice. Curr. Biol. 11, 105-109 (2001).
  14. Luo, G. Disruption of mRad50 causes embryonic stem cell lethality, abnormal embryonic development, and sensitivity to ionizing radiation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7376-7381 (1999).
  15. Pavri, R. Activation-induced cytidine deaminase targets DNA at sites of RNA polymerase II stalling by interaction with Spt5. Cell. 143, 122-133 (2010).
  16. Lee-Theilen, M., Matthews, A. J., Kelly, D., Zheng, S., Chaudhuri, J. CtIP promotes microhomology-mediated alternative end joining during class-switch recombination. Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 75-79 (2011).
  17. Basu, U. The RNA exosome targets the AID cytidine deaminase to both strands of transcribed duplex DNA substrates. Cell. 144, 353-363 (2011).
  18. Yabuki, M., Fujii, M. M., Maizels, N. The MRE11-RAD50-NBS1 complex accelerates somatic hypermutation and gene conversion of immunoglobulin variable regions. Nat. Immunol. 6, 730-736 (2005).
  19. Sale, J. E., Neuberger, M. S. TdT-accessible breaks are scattered over the immunoglobulin V domain in a constitutively hypermutating B cell line. Immunity. 9, 859-869 (1998).
  20. Cumbers, S. J. Generation and iterative affinity maturation of antibodies in vitro using hypermutating B-cell lines. Nat. Biotechnol. 20, 1129-1134 (2002).
  21. Papavasiliou, F. N., Schatz, D. G. Cell-cycle-regulated DNA double-stranded breaks in somatic hypermutation of immunoglobulin genes. Nature. 408, 216-221 (2000).
  22. Parsa, J. Y. AID mutates a non-immunoglobulin transgene independent of chromosomal position. Mol. Immunol. 44, 567-575 (2007).
  23. Zhang, W. Clonal instability of V region hypermutation in the Ramos Burkitt’s lymphoma cell line. Int. Immunol. 13, 1175-1184 (2001).
  24. Ukai, A. Induction of a:T mutations is dependent on cellular environment but independent of mutation frequency and target gene location. J. Immunol. 181, 7835-7842 (2008).
  25. Dull, T. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J. Virol. 72, 8463-8471 (1998).
  26. Nakamura, M. High frequency class switching of an IgM+ B lymphoma clone CH12F3 to IgA+ cells. Int. Immunol. 8, 193-201 (1996).
  27. Muramatsu, M. Specific expression of activation-induced cytidine deaminase (AID), a novel member of the RNA-editing deaminase family in germinal center B cells. J. Biol. Chem. 274, 18470-18476 (1999).

Play Video

Cite This Article
Upton, D. C., Unniraman, S. Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes. J. Vis. Exp. (57), e3573, doi:10.3791/3573 (2011).

View Video