Vi beskriver hur du utför retrovirala eller Lentiviral infektioner i överuttryck eller shRNA innehåller konstruktioner i människans Ramos B-cellinje och hur man mäter somatiska hypermutation i dessa celler.
B-celler börja sitt liv med låg affinitet antikroppar genereras av V (D) J rekombination. Men efter att upptäcka en patogen är den rörliga (V) region i ett immunglobulin (IG) genen muterad ca 100 tusen gånger mer än resten av genomet genom somatisk hypermutation (SHM), vilket resulterar i hög affinitet antikroppar 1,2. Dessutom producerar klass växla rekombination (CSR) antikroppar med olika effektorfunktioner beroende på vilken typ av immunsvar som behövs för en viss patogen. Både CSR och SHM initieras av aktivering-inducerad cytidindeaminas (AID), som deaminates cytosin rester i DNA för att producera uracils. Dessa uracils behandlas av felbenägen former av reparationer vägar, till slut leder till mutationer och rekombination 1-3.
Vår nuvarande förståelse av de molekylära detaljerna i SHM och CSR kommer från en kombination av studier på möss, galvaniska element, cellinjer, och cell-free experiment. Musmodeller kvar guldmyntfoten med genetiska knockouts visar kritiska roller för många reparation faktorer (t.ex. Ung, MSH2, Msh6, Exo1 och polymeras η) 4-10. Men inte alla gener kan bli föremål för knockout studier. Till exempel knockouts av flera dubbel-strand proteiner paus reparationer embryonically dödliga eller försämra B-cells utveckling 11-14. Dessutom ibland särskilda funktion av ett protein i SHM, eller CSR kan maskeras av mer globala fel orsakade av knockout. Dessutom kan eftersom experiment på möss vara långa, ändra uttrycket av enskilda gener i cellinjer har blivit ett allt populärare första steget att identifiera och karakterisera gener 15-18.
Ramos – en Burkitt lymfom cellinje som konstitutivt genomgår SHM – har varit ett populärt cell-line modell för att studera SHM 18-24. En fördel med Ramos celler är att de har en inbyggd bekväm semi-Kvantitativa mått på SHM. Vildtyp celler uttrycka IgM och, som de plockar upp mutationer, några av de mutationer som slår ut IgM uttryck. Därför testmetoder IgM förlust av fluorescens-aktiverade celler skanning (FACS) ger en snabb läs-out för nivån på SHM. En mer kvantitativ mätning av SHM kan erhållas genom att direkt sekvensering antikroppen gener.
Eftersom Ramos celler är svåra att transfektera, vi producerar stabila derivat som har ökat eller sänkt uttryck av en enskild gen genom att infektera celler med retrovirus eller Lentiviral konstruktioner som innehåller antingen ett överuttryck kassett eller en kort hårnål RNA (shRNA), respektive. Här beskriver vi hur vi infektera Ramos celler och sedan använda dessa celler för att undersöka betydelsen av specifika gener på SHM (Figur 1).
Som diskuterats tidigare har cellinje modeller för antikropp diversifiering blivit en populär utgångspunkt för att identifiera nya proteiner som påverkar olika steg under antikropp diversifiering. Vi presenterar här en metod för att använda virusinfektion för att antingen slå ner eller överuttrycker proteiner i Ramos B-cell linje och sedan undersöka effekterna på SHM.
För dessa studier använder vi både WT Ramos och HJÄLPEN hej Ramos celler. WT celler kan användas…
The authors have nothing to disclose.
Den pMSCV-AID-I-Thy1.1 och pKat2 vektorer var en slags gåva från GD Schatz och pVSV-G, pRSV-Rev, och pMDLg / pRRE vektorer var en slags gåva från BR Cullen.
Suggested reagents – most of these may be substituted with similar products from other vendors.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|
6-well clear TC-treated plates | Corning | 3516 | |
10 mL BD Luer-Loksyringes | BD Medical | 309604 | |
24-well clear TC-treated plates | Corning | 3526 | |
96-well clear flat bottom polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3596 | |
100 mm TC-treated culture dishes | Corning | 430167 | |
Acrodisc syringe filters, 0.45 μm | Pall Life Sciences | 4604 | |
Agar | Teknova | A7777 | |
Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
Ampicillin | Sigma | A0166 | 100 mg/mL in water |
BD FACSCanto II flow cytometer | BD Biosciences | or similar | |
BD Falcon round bottom polystyrene tubes | BD Biosciences | 352054 | for FACS |
BOSC 23 cells | ATCC | CRL-11270 | |
CO2 incubator capable of 37°C | |||
DMEM (Dulbecco′s modified Eagle′s medium) | Sigma | D6429 | |
FBS (fetal bovine serum) | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
FITC α-rat CD90/mouse CD90.1 antibody | BioLegend | 202503 | FITC α-Thy1.1 |
FuGENE 6 Transfection Reagent | Roche | 11814443001 | |
HEPES buffer solution | Invitrogen | 15630-080 | |
KAPA HiFi DNA polymerase | KAPA Biosystems | KK2101 | |
LB Broth (lysogeny broth – Luria) Powder | Difco | 240230 | |
MISSION TRC shRNA bacterial glycerol stock | Sigma | shRNA vectors | |
NCS (newborn calf serum) | Gemini Bio-Products | 100-504 | |
PBS (phosphate buffered solution) | Invitrogen | 70011 | diluted to 1x in water |
PE α-human IgM antibody | BioLegend | 314508 | |
PGS (penicillin-streptomycin-glutamine solution) | Gemini Bio-Products | 400-110 | |
Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma | 107689 | 10 mg/mL in water |
PureYield Plasmid Midiprep System | Promega | A2495 | |
Puromycin | Sigma | P8833 | 250 μg/mL in water |
QIAquick gel extraction kit | QIAGEN | 28706 | |
Ramos (RA 1) cells | ATCC | CRL-1596 | |
RPMI-1640 medium | Sigma | R8758 | |
SuperScript II | Invitrogen | 18064-022 | |
SYBR FAST qPCR kit | KAPA Biosystems | KK4601 | |
Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 18038-042 | |
TOPO TA Cloning kit | Invitrogen | K4520-01 | |
TRIzol | Invitrogen | 15596-026 | |
Wizard SV Genomic DNA purification system | Promega | A2361 | |
X-Gal [5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galatopyranoside] | Growcells | C-5687 | 40 mg/mL in DMSO |