における幹細胞移植 in vitroで模擬虚血/再灌流モデル

Summary

我々は、セットアップする方法を示しています

Abstract

幹細胞移植のプロトコルは、臨床実践^1,2,3への道を模索しています。 、より良い結果を得るためのプロトコルは、より堅牢な作り、そして埋め込 ​​み型細胞の新しい源を見つけることは^4,5最近の研究の焦点です。細胞治療の有効性を調査することは容易ではないとの新しいツールは、処理工程⁶に関与するメカニズムを調査するために必要とされる。我々は、虚血/再灌流傷害時に、幹細胞移植後の携帯電話接続、さらには細胞内メカニズムの観察を可能にすると細胞療法の有効性を評価するために、虚血/再灌流の実験的なプロトコルを設計した。 H9c2 cardiomyoblast細胞は、細胞培養プレート^7,8の上に置かれた。虚血は0.5％以下の酸素レベルとグルコースを含まない培地で150分でシミュレートされました。その後、通常のメディアと酸素レベルは、再灌流をシミュレートするために再導入されました。酸素グルコース欠乏後に、損傷した細胞を培養するためにそれらを追加することにより、間葉系幹細胞由来の標識されたヒトの骨髄の移植で治療された。彼らは簡単に拡張および自家、最小侵襲手術で簡単にアクセス可能であるため、間葉系幹細胞が臨床試験で好ましい。共培養の24時間後、細胞は生細胞と死細胞を区別するためカルセインとエチ-ホモ二量体で染色した。このセットアップでは、私たちは共焦点蛍光顕微鏡を用いて細胞間の接続を調査し、フローサイトメトリーによる虚血後の細胞の生存率を定量化することができました。共焦点顕微鏡は、細胞融合と細胞間のナノチューブの形成などの2つの細胞集団の相互作用を示した。フローサイトメトリー分析は、グラフ上にプロットし、統計的に分析することができる損傷した細胞の3つのクラスタを明らかにした。これらの集団が別々に調べることができると結論は、シミュレートの有効性にこれらのデータを描画することができます治療的アプローチ。

Protocol

1。 H9c2 cardiomyoblast細胞の準備

H9c2ラットcardiomyoblastsは、ATCC（ヴェーゼル、ドイツ）から入手し、高グルコース（4.5 g / L）のDMEM、10％ウシ胎児血清、4mMのL -グルタミン、100 U / mlペニシリンおよび100μg/ mlのストレプトマイシンを含むで増殖させた。 H9c2筋芽細胞株は、ラット胚の心臓に由来する、それが骨格と心筋^8,9の両方のin vitroモデルとして使用されます。

H9c2細胞の12ウェルプレートを準備します。

1. H9c2細胞のペトリ皿から培地を削除します。
2. 2〜3ミリリットル0.05％トリプシン/ EDTAを5mlのPBSとダイジェストで細胞を2回洗浄する。
3. 37℃インキュベーター内で5分間、ペトリ皿を置きます。
4. 10ミリリットルのDMEM培地とトリプシンを阻害する。
5. 8分間1200rpmで細胞をスピンダウン。
6. 1ミリリットルDMEM培地とトリパンブルー染色を用いて血球計算板でカウント細胞上清、再懸濁し、細胞を除去した後。
7. 12ウェルプレートにウェル当たり2ミリリットルDMEMでシード3万H9c2細胞を。
8. 24時間37℃のCO ₂インキュベーター内にプレートを置きます。

2。シミュレートされた虚血/再灌流

虚血/再灌流はH9c2細胞培養で酸素グルコース欠乏（OGD）を実行することにより、in vitroでシミュレートされました。この手順は、OGD中の細胞の観察を可能にPeCon細胞培養系（Erbach、ドイツ）とツァイス共焦点顕微鏡のステージで行われました。

1. H9c2細胞の12ウェルプレートから吸引して培養液を除去。
2. PBSで2回細胞を洗浄する。
3. ウェルあたり3 mlのグルコースフリー培地を追加。
4. 細胞の培養系にプレートを置きます。
5. インキュベーションシステムのうち、酸素をパージするために窒素ガスを開始します。
6. その後、タイマーを開始する酸素のレベルが0.5％に達するまで待ちます。 0.5％の酸素が約3 mmHgの部分的な緊張を意味します。 1〜対象セルシミュレートされた虚血の50分。
7. シミュレートされた虚血の終わりには、細胞からグルコース培地を取り除く。
8. ウェルにピペット2ミリリットル通常の培養培地。
9. 37℃CO ₂インキュベーターで30分間、12ウェルプレートを置きますが、これは"再灌流の期間"です。

3。準備救助間葉系幹細胞

ヒト由来の骨髄は、4 mM L -グルタミン、T75フラスコに入れ、10％ウシ胎児血清（FCS）、100 U / mlペニシリンおよび100μg/ mlのストレプトマイシンを含むダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）培地で希釈し、 1g /リットルのグルコース。フラスコは、3日間、5％CO ₂の完全な加湿雰囲気中で37℃でインキュベートした。潜伏期間の後にフラスコや骨髄の残りのコンポーネントの表面に付着したBMSCを、PBSで洗浄することにより排除された。使用されるBMSCを、実験1と5の通路の間であった。 IDEN細胞のティティは、フローサイトメトリーによる系統特異的細胞表面マーカーの存在によって確認された。造血LINAGE -特異的表面マーカー（CD34、CD45）と間葉の表面マーカー（CD73、CD90、CD105およびCD166）を調べた。

シミュレートされた虚血時には、移植用間葉系幹細胞を救う準備。

1. VybrantはDMEM培地で1:200の割合で、DID蛍光色素を希釈する。
2. 救助の細胞から培地を吸引除去し、Vybrantがやったと300μlのDMEMを加える。
3. 37℃CO ₂インキュベーターで30分間場所ペトリ皿。
4. 間葉系幹細胞のペトリ皿から培地を削除します。
5. 2〜3ミリリットル0.05％トリプシン/ EDTAを5mlのPBSとダイジェストで細胞を2回洗浄する。
6. 37℃インキュベーター内で5分間、ペトリ皿を置きます。
7. 10ミリリットルのDMEM培地とトリプシンを阻害する。
8. 8分間1200rpmで細胞をスピンダウン。
9. スーパを除去した後1ミリリットルDMEM培地およびトリパンブルー染色を用いて血球計算板でカウント細胞におけるrnatant、再懸細胞。
10. 再灌流の最後の30分後に虚血後のH9c2心筋芽細胞にも当たり20,000の間葉系幹細胞を加える。
11. 24時間37℃CO ₂インキュベーターに場所細胞の共培養。

4。共焦点顕微鏡による解析

シミュレートされた虚血/再灌流障害の後、細胞を24時間、通常の培養培地中でインキュベートされる。

1. 24時間は、PBSで細胞を2回洗浄した後。
2. 30分間、500μlのLIVE / DEAD色素溶液（5 nMのカルセインと400nmのPBSでエチジウム-ホモ二量体^{-2）（5 × 10 4}細胞/ ml）で細胞を染色。

形態と蛍光によって選択された生細胞と死細胞のための共焦点画像の評価は、ImageJのソフトウェア（国立衛生研究所、米国）で行うことができます。 cの場合にO -文化、MSCはそのVybrantのDID細胞標識のためにH9c2細胞と区別することができます。死細胞の割合は、盲検¹⁰の各カルチャのビューの4つの独立した分野（10倍目標）で評価することができます。

42 mmのガラス製カバースリップ上で培養H9c2 cardiomyoblastsはまた共焦点顕微鏡の細胞の培養系を用いて虚血/再灌流障害中および後の時間経過ビデオ顕微鏡で調べることができる。このような細胞融合と細胞間のナノチューブの形成などの細胞間相互作用は、時間をかけて研究することができる。

5。フローサイトメトリーによる解析

シミュレートされた虚血/再灌流障害の後、細胞を24時間、通常の培養培地中でインキュベートされる。

1. 24時間後、培地を収穫。いくつかの死んだ細胞が24時間のインキュベーション中に、培養皿の表面から剥離している可能性があるため、また、培地を収集することは非常に重要です。る。
2. 0.05％トリプシン- EDTAを含むPBSとダイジェストで細胞を2回洗浄する。
3. DMEM培地とトリプシンを阻害する。
4. 8分、1200 RPM（約150〜200グラム）で、細胞と収穫された培養液をスピンダウン。
5. 上清を捨てる。
6. 30分間500μLデッド/ライブ色素溶液（5 nMのカルセインと400nmのPBSでエチジウム-ホモ二量体^{-2）（5 × 10 4}細胞/ ml）で細胞を懸濁する。
7. フローサイトメトリーチューブに細胞を移す。
8. CellQuest Proソフトウェアを起動します。
9. 測定のためのフローサイトメーターを設定するには、生細胞と死細胞のコントロールサンプルを準備する。
   1. ポイント1で説明したように12ウェルプレートに3 × ⁴の密度でプレートH9c2細胞。
   2. ポイント1で説明したように、単一のトリプシン処理で細胞のコントロールを生きて準備。
   3. 1時間に10μMH ₂ O ₂で処理することにより、死細胞のコントロールを準備します。
   4. トリプシン処理後、resuspen500μlのLIVE / DEAD染料溶液（5 nMのカルセイン- AMおよび400nmのPBSでエチジウム-ホモ二量体A - 2）のd生と死細胞のコントロール。
10. 死んだ細胞は正のカルセイン負とエチジウムホモ二量体である間、生きている細胞は、負のカルセイン正とエチジウムホモ二量体になるように機器設定を調整する必要があります。
11. グラフと統計分析上のバーが、これらの値に対して実行できるようにこれらの人口の割合を表現することができる。
12. 別の実験群を測定する。

6。代表的な結果：

我々の結果は、追加された間葉系幹細胞は虚血後の心筋細胞の生存率を改善できることを示した。共焦点顕微鏡画像は、おそらく観察保護¹⁰で重要な役割を果たしているような部分的な膜の接続や細胞間のナノチューブのような直接的な細胞間相互作用を、明らかになった。これらのナノチューブは、いくつかのセルdの距離にまたがっている場合iameters、およびそれらの直径は200〜500 nmの（白い矢印）の間であった。

図1。セル間のナノチューブ形成。ナノチューブの形成（白矢印）はVybrant DIOラベル付けcardiomyoblastsとVybrant DIDのラベルが付いた葉系幹細胞との間で観察された。

フローサイトメトリー分析は、生存と壊死cardiomyoblastsと間​​葉系幹細胞の集団を示した。興味深いことに、我々はまた、カルセインが含まれている第三に、"負傷"cardiomyoblastの細胞集団を観察しただけでなく、死んだ細胞、エチジウムホモ二量体（図2）の指標が含まれていました。

図2。シミュレートされた虚血後の異なる細胞集団の代表は、ドットプロット。

いくつかの実験の評価翔虚血後のH9c2のcardiomyoblastに間葉系幹細胞の添加は虚血後に単独で培養した心筋芽細胞（図3）と比較して有意に生きている細胞の割合を増加させることを結婚する。

図3。虚血後のcardiomyoblasts上に幹細胞治療の効果は生きている細胞の割合が大幅にシミュレートされた虚血後に減少した対照と比較して（制御対IRモデル：90.36 ± 2.60対10.52 ± 0.48、*** P> 0.001）。、添加後の増加間葉系幹細胞の（IRモデル対IR + BMSC：10.52 ± 0.48対25.21 ± 2.13、*** P> 0.001）。データは平均値± SEMを表す。データの統計解析は、Tukeyの多重比較の事後検定と一元配置分散分析を用いて行った。

Discussion

実証プロトコルはそのようなモデルのすべての利点と欠点と心筋梗塞の幹細胞治療、のはるかに複雑な問題へのin vitroでのアプローチになります。もちろん、それが心筋梗塞の間と後に起きている複雑な（例えば、免疫学）のイベントを反映することはできませんが、虚血後の細胞で追加された細胞の直接的な効果に焦点を当てることができます。 H9c2 cardiomyoblasts上でシミュレートされた虚血の影響は非常に使用される細胞の継代の数とO ₂濃度で、OGDの時間に依存する。一つは、正確にこれらのパラメータを調整し、標準化されたプロトコルを持つために、特定の細胞型に最適な条件を見つける必要があります。その後、プロトコルは、誘導多能性幹細胞や成体幹細胞は、そのような胚性幹細胞など、さまざまな追加の細胞型の効果を調べるために多くの方法（腎、肝または脳虚血/再灌流^{11,12,13,14）}で使用することができます。 ^15、E馴化培地を¹⁶または様々な前処理を^17,18または関心の焦点に任意のパラメータのffectiveness。