Трансплантация стволовых клеток в В пробирке Имитация ишемии / реперфузии модели

Summary

Мы демонстрируем, как настроить

Abstract

Стволовые протоколов трансплантации клеток находят свой ​​путь в клиническую практику ^1,2,3. Получение лучших результатов, делая протоколы более надежной, и найти новые источники для имплантируемых клетки находятся в центре внимания недавнего исследования ^4,5. Исследование эффективности клеточной терапии является не простой задачей и новые инструменты необходимы для исследования механизмов, вовлеченных в процесс лечения ^6. Мы разработали экспериментальный протокол ишемии / реперфузии, чтобы позволить наблюдение сотовой связи и даже субклеточные механизмы при ишемии / реперфузии и после трансплантации стволовых клеток и оценить эффективность клеточной терапии. H9c2 клетки cardiomyoblast были размещены на культуре клеток пластины ^7,8. Ишемия был смоделирован с 150 минут в глюкозу среде без кислорода ниже уровня 0,5%. Затем, нормальные средства массовой информации и уровень кислорода вновь были введены, чтобы имитировать реперфузии. После кислородное голодание глюкозы,поврежденные клетки обрабатывали трансплантации меченых костного мозга человека производных мезенхимальных стволовых клеток, добавив их в культуру. Мезенхимальные стволовые клетки являются предпочтительными в клинических испытаниях, потому что они легко доступны с минимальной инвазивной хирургии, легко расширяемой и аутологичных. После 24 часов совместного культивирования клетки были окрашены кальцеин и этидий-гомодимера провести различие между живыми и мертвыми клетками. Эта установка позволяет исследовать межклеточных соединений с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии и количественно выживаемость постишемического клетки с помощью проточной цитометрии. Конфокальной микроскопии показали, взаимодействия двух клеточных популяций, таких как слияние клеток и формирование межклеточного нанотрубок. Анализ проточной цитометрии выявлено 3 скопления поврежденных клеток, которые могут быть нанесены на график и статистическому анализу. Эти группы населения могут быть исследованы отдельно и выводы можно сделать из этих данных об эффективности моделируемыхтерапевтический подход.

Protocol

1. Подготовка H9c2 клетки cardiomyoblast

H9c2 cardiomyoblasts крысы были получены из АТСС (Везель, Германия) и расширена в высокий уровень глюкозы (4,5 г / л) DMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 4 мМ L-глутамина, 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина. H9c2 миобластов клеточной линии происходит от эмбрионального сердца крысы, он используется как в пробирке модель для скелетных и сердечной мышцах ^8,9.

Подготовка 12-луночного планшета из H9c2 клеток:

1. Удалить из питательной среды чашки Петри из H9c2 клеток.
2. Вымойте клетки в два раза с 5 мл PBS и переварить с 2-3 мл 0,05% трипсина / ЭДТА.
3. Место чашки Петри в течение 5 минут в 37 ° C инкубатора.
4. Запрет трипсина с 10 мл культуральной среде DMEM.
5. Спином вниз клетки при 1200 оборотов в течение 8 минут.
6. После удаления надосадочной, ресуспендирования клеток в 1 мл DMEM культуральной среде и считать клетки с использованием гемоцитометра Голубой Трипан окрашивания.
7. Семенной 30000 H9c2 клеток в 2 мл DMEM на лунку в 12-луночного планшета.
8. Место пластинки в 37 ° C CO ₂ инкубаторе в течение 24 часов.

2. Имитация ишемии / реперфузии

Ишемии / реперфузии был смоделирован в пробирке, выполняя кислорода глюкоза депривации (OGD) на H9c2 клеточных культурах. Эта процедура была выполнена на этапе Zeiss конфокальной микроскопии с PeCon инкубации клеточной системы (Эрбах, Германия), позволяющая наблюдения клеток при OGD.

1. Удалить среде стремление с 12 лунками в H9c2 клеток.
2. Вымойте клетки дважды с PBS.
3. Добавьте 3 мл среды без глюкозы на лунку.
4. Место пластинки в системе инкубации клеток.
5. Начало газообразный азот для продувки кислородом из инкубационного системы.
6. Подождите, пока уровень кислорода до 0,5%, то включите таймер. 0,5% кислорода означает примерно на 3 мм рт.ст. парциального напряжения. Тема клетки 150 минут моделирования ишемии.
7. В конце моделирования ишемии, удалить глюкозы среде, свободной от клеток.
8. Внести 2 мл нормальной питательной среды для скважин.
9. Место 12-луночного планшета на 30 минут в 37 ° C CO ₂ инкубаторе, это "реперфузионного периода".

3. Подготовка спасения мезенхимальных стволовых клеток

Костный мозг человеческого происхождения, был взят под T75 колб и разбавляют Средний Дульбеко изменения Орла (DMEM) культуральной среде, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина, 4 мМ L-глутамина и 1 г / л глюкозы. Колбы инкубировали при 37 ° С в полностью увлажненной атмосфере 5% CO _{2 в} течение 3 дней. После инкубационного периода BMSCs придерживался поверхности колбы и остальные компоненты костного мозга были устранены путем промывки PBS. Использованы BMSCs были между 1 и 5 места в экспериментах. Тожtity клеток было подтверждено наличие линии конкретной поверхности клеток маркеры с проточной цитометрии. Гемопоэтических построчная оплата конкретных поверхностные маркеры (CD34, CD45) и мезенхимальные маркеры поверхности (CD73, CD90, CD105 и CD166) исследовались.

Во время моделирования ишемии, подготовить спасательные мезенхимальных стволовых клеток для трансплантации.

1. Развести флуоресцентного красителя Vybrant сделал в 1:200 отношение в культуральной среде DMEM.
2. Аспирируйте среды от спасения клеток и добавить 300 мкл DMEM с Vybrant сделал.
3. Место чашку Петри на 30 минут в 37 ° C CO ₂ инкубатора.
4. Удалить из питательной среды чашки Петри мезенхимальных стволовых клеток.
5. Вымойте клетки в два раза с 5 мл PBS и переварить с 2-3 мл 0,05% трипсина / ЭДТА.
6. Место чашки Петри в течение 5 минут в 37 ° C инкубатора.
7. Запрет трипсина с 10 мл культуральной среде DMEM.
8. Спином вниз клетки при 1200 оборотов в течение 8 минут.
9. После удаления Супеrnatant, ресуспендирования клеток в 1 мл DMEM культуральной среде и считать клетки с использованием гемоцитометра Голубой Трипан окрашивания.
10. Через 30 минут в конце реперфузии добавить 20000 мезенхимальных стволовых клеток на лунку в постишемического H9c2 сердечной миобластов.
11. Место совместно культуре клеток в 37 ° C CO ₂ инкубаторе в течение 24 часов.

4. Анализ с конфокальной микроскопии

После моделирования ишемии / реперфузии, клетки инкубируют в нормальной культурной среде в течение 24 часов.

1. Через 24 часов клетки мыть два раза PBS.
2. Пятно клеток в 500 мкл живых / мертвых раствор красителя в течение 30 минут (5 нМ кальцеин и 400 нМ этидия-гомодимера-2 в PBS) (5x10 ⁴ клеток / мл).

Оценка конфокальных изображений для живых и мертвых клеток выбранных по морфологии и флуоресценции могут быть выполнены с ImageJ программное обеспечение (Национальный институт здоровья, США). В случае со-культур, МСК можно отличить от H9c2 клетки из-за их Vybrant DiD ячейки маркировки. Отношение мертвых клеток может быть оценена в 4-х независимых полей зрения (цель 10 раз) для каждой культуры в слепым ^10.

H9c2 cardiomyoblasts культивировали на 42 мм покровные стекла также могут быть исследованы с течением времени микроскопии видео перерыва во время и после ишемии / реперфузии использованием системы клетки инкубации конфокальной микроскопии. Сотовые к клетке взаимодействий, таких как слияние клеток и формирование межклеточного нанотрубки могут быть изучены с течением времени.

5. Анализ с помощью проточной цитометрии

После моделирования ишемии / реперфузии, клетки инкубируют в нормальной культурной среде в течение 24 часов.

1. После 24 часов, сбор питательных сред. Очень важно собрать культуральной среде и потому, что некоторые мертвые клетки могли бы отделен от поверхности блюдо культуры в 24-часовой инкубацииТион.
2. Вымойте клетки дважды с PBS и переварить с 0,05% трипсина-EDTA.
3. Запрет трипсина с культуральной среде DMEM.
4. Спином вниз клетки и собрано культуральной среде при 1200 оборотов в минуту (примерно 150-200г) в течение 8 минут.
5. Удалите супернатант.
6. Приостановить клеток в 500 мкл жить / мертвых раствор красителя в течение 30 минут (5 нМ кальцеин и 400 нМ этидия-гомодимера-2 в PBS) (5x10 ⁴ клеток / мл).
7. Передача клетки проточной цитометрии труб.
8. Начало CellQuest Pro программное обеспечение.
9. Для установки проточного цитометра для измерения, подготовить контрольные образцы живых и мертвых клеток.
   1. Пластина H9c2 клетки при плотности 3х10 ⁴ в 12-луночных планшет, как описано в пункте 1.
   2. Подготовка живой клетки управления с одной trypsinisation, как описано в пункте 1.
   3. Подготовка мертвых управления ячейки путем обработки 10 мкМ H ₂ O ₂ в течение 1 часа.
   4. После trypsinisation, resuspenг живых и мертвых управления ячейки в 500 мкл жить / мертвых раствор красителя (5 нМ кальцеин-АМ и 400 нМ этидия-гомодимера-2 в PBS).
10. Настройки прибора должна быть отрегулирована таким образом живые клетки являются кальцеин положительные и этидия гомодимера отрицательным, в то время как мертвые клетки кальцеин отрицательные и положительные этидия гомодимера.
11. Процент таких групп может быть выражено в виде столбиков на графике и статистический анализ может быть выполнен на этих значениях.
12. Мера различных экспериментальных групп.

6. Представитель результаты:

Наши результаты показали, что добавил мезенхимальных стволовых клеток может улучшить выживаемость постишемического сердечных клеток. Конфокальной микроскопии изображений показал, прямой клетка-клетка взаимодействий, таких как частичное соединение мембраны или межклеточной нанотрубки, которые, вероятно, играют важную роль в наблюдаемой защиты ^10. Эти нанотрубки пролет на расстоянии нескольких ячейки гiameters, и их диаметров от 200 до 500 нм (белые стрелки).

Рисунок 1. Нанотрубки образовании между клетками. Нанотрубок образования (белая стрелка) между Vybrant Дио помечены cardiomyoblasts и Vybrant DiD помечены мезенхимальные стволовые клетки.

Анализ Проточная цитометрия показала населения на выживание и некротические cardiomyoblasts и мезенхимальных стволовых клеток. Интересно, что мы наблюдали и третий, "пострадавший" cardiomyoblast клеточной популяции в котором содержится кальцеин но и содержала показатель мертвых клеток, этидия гомодимера (рис. 2).

Рисунок 2. Представитель интернет-участок различных клеточных популяций после моделирования ишемии.

Оценки нескольких экспериментов шозамуж, что добавление мезенхимальных стволовых клеток, чтобы постишемического cardiomyoblast H9c2 значительно увеличилась доля живых клеток по сравнению с сердечной миобластов культурной только после ишемии (рис. 3).

Рисунок 3. . Влияние стволовых клеток, лечение на постишемического cardiomyoblasts Процент живых клеток было значительно сокращено после моделирования ишемии по сравнению с контролем (контроль по сравнению с ИК-модели: 90,36 ± 2,60 против 10,52 ± 0,48, *** р> 0,001), которые увеличились после того мезенхимальных стволовых клеток (IR модели по сравнению с ИК + BMSC: 10,52 ± 0,48 против 25,21 ± 2,13, *** р> 0,001). Данные представляют собой средние значения ± SEM. Статистический анализ данных проводился с использованием одностороннего дисперсионного анализа с несколькими сравнения Тьюки постфактум тест.

Discussion

Продемонстрировала протокол в пробирке подход к гораздо более сложный вопрос о стволовых клеток при инфаркте миокарда, при всех преимуществах и недостатках такой модели. Очевидно, она не может отражать комплекс (например, иммунологические) события, происходящие во время и после инфаркта миокарда, но может сосредоточиться на непосредственном воздействии на клетки добавил постишемического клеток. Эффекты моделирования ишемии при H9c2 cardiomyoblasts сильно зависят от времени OGD, на пассаж из отработавших батарей и O ₂ концентрация. Надо настроить эти параметры аккуратно и найти оптимальные условия для определенного типа клеток, чтобы иметь стандартизированный протокол. После этого протокол может быть использован во многих отношениях (почечная, печеночная или церебральной ишемии / реперфузии ^11,12,13,14) для изучения влияния различных типов клеток добавили такие, как эмбриональные стволовые клетки, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки или взрослые стволовые клетки ^15, электроннаяffectiveness из кондиционированной среды ¹⁶ или различные предварительной обработки ^17,18 или какого-либо параметра в центре внимания.