Stamcelletransplantasjon i en In vitro Simulert ischemia / reperfusjon Model

Summary

Vi viser hvordan du setter opp en

Abstract

Stamcelletransplantasjon protokoller finner veien inn i klinisk praksis ^1,2,3. Få bedre resultater, noe som gjør protokollene mer robust, og finne nye kilder for implanterte cellene er i fokus for nyere forskning ^4,5. Gransker effektiviteten av cellen terapi er ikke en lett oppgave og nye verktøy er nødvendig å undersøke mekanismene som er involvert i behandlingsprosessen ^6. Vi har utformet en forsøksprotokoll av iskemi / reperfusjon slik at observasjon av cellulære forbindelser og selv subcellular mekanismene under iskemi / reperfusjon skade og etter stamcelletransplantasjon og å evaluere effekten av celleterapi. H9c2 cardiomyoblast celler ble plassert på celle kultur plater ^7,8. Iskemi ble simulert med 150 minutter i en glukose frie medium med oksygen nivå under 0,5%. Deretter var normale media og oksygennivået i blodet gjeninnføres å simulere reperfusjon. Etter oksygen glukose deprivasjon,de skadede cellene ble behandlet med transplantasjon av merket human benmarg avledet stamceller ved å legge dem til kultur. Stamceller er foretrukket i kliniske studier, fordi de er lett tilgjengelig med minimal invasiv kirurgi, lett utvidbare og autolog. Etter 24 timer med co-dyrking, ble cellene farget med calcein og ethidium-homodimer å skille mellom levende og døde celler. Dette oppsettet tillot oss å undersøke intercellular tilkoblinger ved hjelp confocal fluoriserende mikroskopi og å kvantifisere overlevelsesraten postischemic celler ved flowcytometri. Konfokalmikroskopi viste interaksjonene mellom de to celle populasjoner som celle fusjon og dannelse av intercellulær nanorør. Flowcytometri analyse avslørte tre klynger av skadede celler som kan plottes på en graf og analysert statistisk. Disse populasjoner kan bli etterforsket separat og konklusjoner kan trekkes på disse data om effektiviteten av den simulerteterapeutisk tilnærming.

Protocol

1. Forbereder H9c2 cardiomyoblast celler

H9c2 rotte cardiomyoblasts ble hentet fra ATCC (Wesel, Tyskland) og utvidet i høy glukose (4,5 g / L) DMEM inneholder 10% føtale bovint serum, 4 mm L-glutamin, 100 U / ml penicillin og 100 mikrogram / ml streptomycin. Den H9c2 myoblast cellelinje er avledet fra embryonale rotte hjerte, er det brukt som en in vitro modell for både skjelett-og hjertemuskulatur ^8,9.

Forbered 12 godt plate av H9c2 celler:

1. Fjern kultur medium fra petriskål av H9c2 celler.
2. Vask cellene to ganger med 5 ml PBS og fordøye med 2-3 ml 0,05% trypsin / EDTA.
3. Plasser petriskål for 5 minutter i 37 ° C inkubator.
4. Inhibit trypsin med 10 ml DMEM kultur medium.
5. Spin ned cellene ved 1200 RPM for 8 minutter.
6. Etter å ha fjernet supernatanten, resuspender cellene i 1 ml DMEM kultur medium og telle celler med hemocytometer bruker Trypan blå flekker.
7. Seed 30000 H9c2 cellene i 2 ml DMEM per brønn i en 12 bra plate.
8. Sett platen inn i 37 ° C CO ₂ inkubator i 24 timer.

2. Simulert iskemi / reperfusjon

Iskemi / reperfusjon ble simulert in vitro ved å utføre oksygen glukose deprivasjon (OGD) på H9c2 cellekulturer. Denne prosedyren ble utført på scenen av Zeiss confocal mikroskop med PeCon celle inkubering system (Erbach, Tyskland), slik at observasjon av cellene under OGD.

1. Fjern medium ved aspirasjon fra 12 vel plate av H9c2 celler.
2. Vask cellene to ganger med PBS.
3. Tilsett 3 ml glukose gratis medium per brønn.
4. Sett platen inn i cellen inkubering systemet.
5. Begynn nitrogengass for å rense oksygen ut av inkubering systemet.
6. Vent til nivået av oksygen når 0,5% deretter starte tidtakeren. 0,5% oksygen betyr ca 3 mmHg delvis spenning. Subject celler til 150 minutter med simulert iskemi.
7. På slutten av simulert iskemi, fjerner glukose fritt medium fra cellene.
8. Pipetter 2 ml normal kultur medium til brønnene.
9. Plasser 12 godt plate i 30 minutter i 37 ° C CO ₂ inkubator, dette er "reperfusjon periode".

3. Forbereder redde stamceller

Beinmarg av human opprinnelse ble tatt i T75 kolber og fortynnes med Dulbecco modifiserte Eagle er Medium (DMEM) kultur medium som inneholder 10% kalvefoster serum (FCS), 100 U / ml penicillin og 100 mikrogram / ml streptomycin, 4 mm L-glutamin og 1 g / l glukose. Flaskene ble inkubert ved 37 ° C i en fullstendig fuktet atmosfære av 5% CO ₂ i 3 dager. Etter inkubasjonstiden den BMSCs levd opp til overflaten av kolber og de resterende komponentene i beinmargen ble eliminert ved å vaske med PBS. Den brukte BMSCs var mellom 1 og 5 passasjer i forsøkene. Den identity av celler ble bekreftet av tilstedeværelsen av avstamning-bestemt celle overflate markører med flowcytometri. Hematopoetiske linage-spesifikk overflate markører (CD34, CD45) og mesenchymale overflate markører (CD73, CD90, CD105 og CD166) ble undersøkt.

Under simulert iskemi, forberede redde stamceller for transplantasjon.

1. Fortynn den fluorescerende fargestoff Vybrant gjorde i 1:200 forholdet i DMEM kultur medium.
2. Aspirer medium fra Rescue cellene og legge til 300 mL DMEM med Vybrant gjorde.
3. Plasser petriskål i 30 minutter i 37 ° C CO ₂ inkubator.
4. Fjern kultur medium fra petriskål av stamceller.
5. Vask cellene to ganger med 5 ml PBS og fordøye med 2-3 ml 0,05% trypsin / EDTA.
6. Plasser petriskål for 5 minutter i 37 ° C inkubator.
7. Inhibit trypsin med 10 ml DMEM kultur medium.
8. Spin ned cellene ved 1200 RPM for 8 minutter.
9. Etter å ha fjernet Supernatant, resuspender cellene i 1 ml DMEM kultur medium og telle celler med hemocytometer bruker Trypan blå flekker.
10. Etter 30 minutter ved slutten av reperfusjon legge 20000 stamceller per brønn til postischemic H9c2 kardiale myoblasts.
11. Plasser co-kulturen av celler inn i 37 ° C CO ₂ inkubator i 24 timer.

Fire. Analyse med konfokalmikroskopi

Etter simulert iskemi / reperfusjon skade, er celler inkubert i normal kultur medium i 24 timer.

1. Etter 24 timer vaskes celler to ganger med PBS.
2. Stain cellene i 500 mL live / dead dye løsning for 30 minutter (5 nM calcein og 400 nM Ethidium-homodimer-2 i PBS) (5x10 ⁴ celle / ml).

Evalueringen av confocal bilder for levende og døde celler valgt av morfologi og fluorescens kan utføres med ImageJ programvaren (National Institutes of Health, USA). I tilfelle av co-kulturer, kan MSCS skilles fra H9c2 celler på grunn av deres Vybrant DID celle merking. Forholdet av døde celler kan evalueres i 4 uavhengige synsfelt (objektiv 10x) for hver kultur i en blind mote ^10.

H9c2 cardiomyoblasts dyrket på 42 mm glass Dekkglass kan også undersøkes med tid lapse video mikroskopi under og etter iskemi / reperfusjon skade bruke cellen inkubering system av confocal mikroskop. Cell-til-celle interaksjoner som celle fusjon og dannelse av intercellulær nanorør kan studeres over tid.

5. Analyse med flowcytometri

Etter simulert iskemi / reperfusjon skade, er celler inkubert i normal kultur medium i 24 timer.

1. Etter 24 timer, høste kultur media. Det er svært viktig å samle kulturen medium også fordi noen døde celler kunne ha løsrevet fra den kultur tallerken overflaten i løpet av 24 timers incubasjon.
2. Vask cellene to ganger med PBS og fordøye med 0.05% trypsin-EDTA.
3. Inhibit trypsin med DMEM kultur medium.
4. Spin ned celler og høstet kultur medium på 1200 RPM (ca 150-200g) for 8 minutter.
5. Kast supernatanten.
6. Suspend cellene i 500 mL live / dead dye løsning for 30 minutter (5 nM calcein og 400 nM Ethidium-homodimer-2 i PBS) (5x10 ⁴ celle / ml).
7. Overfør cellene til flowcytometri rør.
8. Start CellQuest Pro programvare.
9. Slik setter du opp flowcytometer for måling, forberede kontroll prøver av levende og døde celler.
   1. Plate H9c2 celler på en tetthet på 3x10 ⁴ i 12-brønn plater som beskrevet i punkt 1.
   2. Forbered live celle kontroller med enkel trypsinisation som beskrevet i punkt 1.
   3. Forbered død celle kontroller ved behandling med 10 mm H ₂ O ₂ for 1 time.
   4. Etter trypsinisation, resuspend levende og døde celler kontroller i 500 mL live / dead dye-løsning (5 nM calcein-AM og 400 nM Ethidium-homodimer-2 i PBS).
10. Instrumentet Innstillingene bør justeres slik at levende celler calcein positive og ethidium homodimer negative, mens de døde cellene er calcein negative og ethidium homodimer positive.
11. Andelen av disse populasjonene kan uttrykkes som barer på en graf og statistisk analyse kan utføres på disse verdiene.
12. Mål ulike eksperimentelle grupper.

Seks. Representative resultater:

Våre resultater viste at laget stamceller kan forbedre overlevelsen av postischemic kardiale celler. Konfokalmikroskopi bilder avslørte direkte celle-til-celle interaksjoner, som delvis membran tilkobling eller intercellulær nanorør, som trolig spiller en viktig rolle i den observerte beskyttelsen ^10. Disse nanorør span over avstander på flere celle diameters, og deres diameter var mellom 200 og 500 nm (hvite piler).

Figur 1. Nanorør dannelsen mellom cellene. Nanotube dannelse (hvit pil) ble observert mellom Vybrant Dio merket cardiomyoblasts og Vybrant DID merkede stamceller.

Flowcytometri analyse viste bestander av overlevende og nekrotisk cardiomyoblasts og stamceller. Interessant, har vi også observert en tredje, 'skadet' cardiomyoblast celle befolkning som inneholdt calcein men inneholdt også indikatoren av døde celler, ethidium homodimer (figur 2).

Figur 2. Representant dot-plot av de ulike celle populasjoner etter simulert iskemi.

Evalueringen av flere eksperimenter ShoOns at tillegg av mesenkymale stamceller til postischemic H9c2 cardiomyoblast økt betydelig andelen av levende celler i forhold til hjerte myoblasts kultiverte alene etter iskemi (figur 3).

Figur 3. . Effekt av stamcelle behandling på postischemic cardiomyoblasts Prosentandel av levende celler var signifikant redusert etter simulert iskemi, sammenlignet med kontroll (kontroll vs IR modell: 90,36 ± 2,60 vs 10,52 ± 0,48, *** p> 0,001), som økte etter tillegg av stamceller (IR-modellen kontra IR + BMSC: 10,52 ± 0,48 vs 25,21 ± 2,13, *** p> 0,001). Data representerer gjennomsnitt ± SEM. Statistisk analyse av data ble utført med enveis variansanalyse med Tukey multippel sammenligning post hoc test.

Discussion

Den demonstrerte protokollen er en in vitro tilnærming til mye mer komplekse utgaven av stamcelleterapi i hjerteinfarkt, med alle fordeler og ulemper ved en slik modell. Selvfølgelig kan det ikke reflektere komplekse (f.eks immunologiske) hendelser som finner sted under og etter hjerteinfarkt, men kan fokusere på de direkte effektene av den ekstra cellene på postischemic celler. Effekten av simulert iskemi på H9c2 cardiomyoblasts svært avhengig av tid på OGD på passasjen antall brukt celler og på O _{2-konsentrasjonen.} Man må justere disse parametrene nøyaktig og finne den optimale forhold for en bestemt celletype for å ha en standardisert protokoll. Etterpå kan protokollen brukes på mange måter (nyre, lever-eller cerebral iskemi / reperfusjon ^11,12,13,14) for å undersøke effekten av ulike lagt celletyper som embryonale stamceller, indusert pluripotent stamceller eller adulte stamceller ^15, effectiveness av kondisjonert medium ¹⁶ eller ulike forbehandlinger ^17,18 eller noen parameter i fokus av interesse.