גזע השתלת תאים ב במבחנה דגם סימולציה איסכמיה / reperfusion

Summary

אנו מדגימים כיצד להקים

Abstract

השתלת תא גזע פרוטוקולים מוצאים את דרכם לתוך הפרקטיקה הקלינית ^1,2,3. קבלת תוצאות טובות יותר, מה שהופך את הפרוטוקולים חזקים יותר, ולמצוא מקורות חדשים עבור תאים להשתלה הם מוקד של מחקר שנעשה לאחרונה ^4,5. בחינת היעילות של טיפולים בתא אינה משימה קלה, כלים חדשים נדרשים כדי לחקור את המנגנונים המעורבים בתהליך הטיפול ^6. תכננו פרוטוקול הניסוי של איסכמיה / reperfusion כדי לאפשר תצפית של חיבורי הסלולר מנגנוני subcellular גם במהלך הפציעה איסכמיה / reperfusion ואחרי השתלת תא גזע כדי להעריך את היעילות של טיפול בתא. H9c2 תאים cardiomyoblast הונחו על תרבות צלחות התא ^7,8. איסכמיה היה מדומה עם 150 דקות בתווך גלוקוז חופשי עם רמת חמצן מתחת 0.5%. ואז, מדיה נורמלי רמות החמצן היו מחדש כדי לדמות reperfusion. לאחר שלילת חמצן גלוקוז,התאים שנפגעו טופלו השתלה של מח עצמות אדם נגזר תווית בתאי גזע mesenchymal ידי הוספתם התרבות. בתאי גזע mesenchymal עדיפים בניסויים קליניים משום שהם נגישים בקלות עם ניתוח פולשני מינימלי, ניתן להרחבה בקלות עצמיים. לאחר 24 שעות של עיבוד משותף, התאים היו מוכתמות calcein ו-ethidium homodimer להבדיל בין תאים חיים ומתים. התקנה זו מאפשרת לנו לחקור את הקשרים אינטר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal ו לכמת את שיעור ההישרדות של תאים postischemic ידי cytometry הזרימה. מיקרוסקופיה Confocal הראה את יחסי הגומלין של שתי אוכלוסיות תאים כגון איחוי תאים היווצרות של צינורות אינטר. Cytometry ניתוח תזרים חשף 3 אשכולות של תאים פגומים אשר ניתן להתוות על הגרף ונותחו סטטיסטית. אוכלוסיות אלה יכולים להיחקר בנפרד ניתן להסיק על נתונים אלה על האפקטיביות של סימולציהtherapeutical גישה.

Protocol

1. הכנת H9c2 תאים cardiomyoblast

H9c2 cardiomyoblasts עכברוש התקבלו ATCC (Wesel, גרמניה) התרחבה גלוקוז גבוהה (4.5 גר '/ ל') DMEM המכיל 10% בסרום שור עוברית, 4 מ"מ L-גלוטמין, 100 U / ml פניצילין 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין. H9c2 התא קו myoblast נגזר לב עוברי חולדה, הוא משמש מודל במבחנה עבור השריר הן השלד לב ^8,9.

הכן 12 צלחת היטב H9c2 תאים:

1. הסר בינוני תרבות מצלחת פטרי H9c2 של תאים.
2. שטפו תאים פעמיים עם 5 מ"ל PBS ולעכל עם 2-3 מ"ל 0.05% טריפסין / EDTA.
3. מניחים צלחת פטרי במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס חממה.
4. לעכב טריפסין בינוני עם 10 תרבות DMEM מ"ל.
5. ספין מטה את התאים ב 1200 סל"ד במשך 8 דקות.
6. לאחר הסרת supernatant, תאים resuspend בינוני 1 DMEM תרבות מ"ל ותאי לספור עם hemocytometer באמצעות מכתים Trypan כחול.
7. 30,000 זרעים H9c2 תאים 2 מ"ל לכל DMEM גם בצלחת 12 באר.
8. מניחים את הצלחת לתוך 37 ° C-CO ₂ באינקובטור למשך 24 שעות.

2. איסכמיה reperfusion סימולציה /

איסכמיה / reperfusion היה מדומה במבחנה על ידי ביצוע גלוקוז חמצן קיפוח (OGD) H9c2 על תרביות תאים. הליך זה בוצע על הבמה של המיקרוסקופ confocal Zeiss עם מערכת תא הדגירה Pecon (Erbach, גרמניה) המאפשר תצפית של תאים במהלך OGD.

1. הסר בינוני על ידי שאיפה מהצלחת 12 היטב H9c2 תאים.
2. שטפו פעמיים עם תאים PBS.
3. הוסף 3 מ"ל גלוקוז בינוני חינם לכל טוב.
4. מניחים את הצלחת לתוך מערכת הדגירה התא.
5. התחל גז חנקן לטהר את החמצן מחוץ למערכת הדגירה.
6. המתן עד לרמה של 0.5% חמצן מגיע ואז להפעיל את הטיימר. חמצן 0.5% כלומר כ 3 מ"מ כספית מתח חלקי. תאים בכפוף 150 דקות של איסכמיה מדומה.
7. בסופו של איסכמיה מדומה, להסיר את המדיום גלוקוז חופשי מן התאים.
8. פיפטה 2 מ"ל בינוני תרבות נורמלי הבארות.
9. מניחים את צלחת 12 היטב במשך 30 דקות ב 37 ° C-CO ₂ באינקובטור, זוהי "תקופת reperfusion".

3. הכנת mesenchymal הצלה בתאי גזע

מוח עצם ממקור אנושי נלקח T75 צלוחיות ו מדולל בינוני השתנה Dulbecco של הנשר (DMEM) בינוני תרבות המכיל 10% עוברית עגל בסרום (FCS), 100 U / ml פניצילין 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין, 4 מ"מ L-גלוטמין ו 1 g / l גלוקוז. צלוחיות הודגרו ב 37 ° C באווירה humidified מלא של 5% CO ₂ למשך 3 ימים. לאחר תקופת דגירה BMSCs דבקו פני השטח של צלוחיות ואת המרכיבים הנותרים של מח העצם בוטלו על ידי שטיפה עם PBS. BMSCs בשימוש היו בין 1 ל 5 קטעים הניסויים. IDENtity של תאים אושרה על ידי נוכחות של שושלת ספציפית משטח סמנים תא עם cytometry הזרימה. Hematopoietic linage הסמנים הספציפיים פני השטח (CD34, CD45) ו סמנים משטח mesenchymal (CD73, CD90, CD105 ו CD166) נחקרו.

במהלך איסכמיה מדומה, להכין הצלה בתאי גזע mesenchymal להשתלה.

1. לדלל את צבע פלואורסצנטי Vybrant האם ביחס 1:200 במדיום תרבות DMEM.
2. לשאוב בינוני מתאי הצלה להוסיף 300 DMEM μl עם Vybrant עשה.
3. מניחים צלחת פטרי במשך 30 דקות ב 37 ° C-CO ₂ באינקובטור.
4. הסר בינוני תרבות מצלחת פטרי של בתאי גזע mesenchymal.
5. שטפו תאים פעמיים עם 5 מ"ל PBS ולעכל עם 2-3 מ"ל 0.05% טריפסין / EDTA.
6. מניחים צלחת פטרי במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס חממה.
7. לעכב טריפסין בינוני עם 10 תרבות DMEM מ"ל.
8. ספין מטה את התאים ב 1200 סל"ד במשך 8 דקות.
9. לאחר הסרת supernatant, תאים resuspend בינוני 1 DMEM תרבות מ"ל ותאי לספור עם hemocytometer באמצעות מכתים Trypan כחול.
10. אחרי 30 דקות בסוף reperfusion להוסיף 20,000 בתאי גזע mesenchymal לכל היטב את H9c2 myoblasts postischemic לב.
11. המקום שיתוף התרבות של תאים לתוך 37 ° C-CO ₂ באינקובטור למשך 24 שעות.

4. ניתוח עם מיקרוסקופיה confocal

לאחר הפציעה איסכמיה / reperfusion מדומה, תאים מודגרת במדיום תרבות נורמליים למשך 24 שעות.

1. לאחר 24 שעות לשטוף תאים פעמיים עם PBS.
2. הכתם התאים פתרון 500 גר / מת μl לצבוע במשך 30 דקות (5 nM calcein ו 400 nm Ethidium-homodimer-2 ב-PBS) (5x10 ⁴ תאים / מ"ל).

ההערכה של תמונות confocal עבור תאים חיים ומתים נבחר על ידי המורפולוגיה הקרינה ניתן לבצע עם התוכנה ImageJ (המכונים הלאומיים לבריאות, ארה"ב). במקרה של גO-תרבויות, MSCs ניתן להבחין בין תאים H9c2 בשל Vybrant תיוג שלהם תא האם. היחס של תאים מתים ניתן להעריך ב 4 שדות עצמאית של תצוגה (אובייקטיבי 10x) עבור כל תרבות בצורה עיוורת ^10.

H9c2 cardiomyoblasts תרבותי coverslips על 42 מ"מ זכוכית יכול גם להיחקר עם מיקרוסקופיה זמן לשגות וידאו במהלך ואחרי פציעה איסכמיה / reperfusion באמצעות מערכת תא הדגירה של המיקרוסקופ confocal. תא אל תא אינטראקציות כגון איחוי תאים היווצרות של צינורות אינטר ניתן ללמוד לאורך זמן.

5. ניתוח עם זרימת cytometry

לאחר הפציעה איסכמיה / reperfusion מדומה, תאים מודגרת במדיום תרבות נורמליים למשך 24 שעות.

1. לאחר 24 שעות, קציר התקשורת והתרבות. חשוב מאוד לאסוף את המדיום תרבות גם בגלל כמה תאים מתים יכול להיות מנותקת מן השטח צלחת תרבות incuba במהלך 24 שעותtion.
2. שטפו פעמיים עם תאים PBS ולעכל עם 0.05% טריפסין-EDTA.
3. לדכא עם טריפסין בינוני תרבות DMEM.
4. ספין מטה את התאים המדיום תרבות שנקטפו ב 1200 סל"ד (בערך 150-200 גרם) במשך 8 דקות.
5. בטל supernatant.
6. להשעות את התאים בתמיסה 500 גר / מת μL לצבוע במשך 30 דקות (5 nM calcein ו 400 nm Ethidium-homodimer-2 ב-PBS) (5x10 ⁴ תאים / מ"ל).
7. העברת התאים לזרום צינורות cytometry.
8. הפעל את התוכנה Pro CellQuest.
9. כדי להגדיר את זרימת cytometer למדידה, בקרה להכין דגימות של תאים חיים ומתים.
   1. H9c2 פלייט תאים בצפיפות של 3x10 ⁴ ב 12 גם צלחות כפי שמתואר בשלב 1.
   2. הכן לחיות עם trypsinisation שולטת תא בודד כמתואר נקודה 1.
   3. הכן שולטת תאים מתים על ידי טיפול עם 10 מיקרומטר H ₂ O ₂ במשך שעה 1.
   4. לאחר trypsinisation, resuspenד חי ושולט התא מת פתרון 500 גר / מת μl צבען (5 nM calcein-AM ו - 400 nm Ethidium-homodimer-2 ב-PBS).
10. הגדרות המכשיר צריך להיות מותאם כך התאים החיים הם חיוביים calcein ו ethidium homodimer שלילי, בעוד תאים מתים הם שליליים calcein ו ethidium homodimer חיובית.
11. האחוז של אוכלוסיות אלה ניתן לבטא ברים על הגרף וניתוח סטטיסטי יכול להתבצע על ערכים אלה.
12. מדוד את קבוצות הניסוי השונות.

6. נציג תוצאות:

התוצאות שלנו הראו כי הוסיף בתאי גזע mesenchymal יכול לשפר את ההישרדות של תאים לב postischemic. תמונות מיקרוסקופיה confocal חשף ישיר התא אל התא אינטראקציות, כגון חיבור קרום חלקי או צינורות אינטר, אשר ככל הנראה תפקיד חשוב בהגנה על נצפו ^10. צינורות אלה משתרעים על פני מרחקים של התא ד מספרiameters, בקטרים ​​שלהם היו בין 200 ל 500 ננומטר (חצים לבנים).

באיור 1. היווצרות Nanotube בין תאים. היווצרות Nanotube (חץ לבן) נצפתה בין cardiomyoblasts Vybrant Dio שכותרתו ועשה Vybrant תאים שכותרתו mesenchymal גזע.

Cytometry ניתוח תזרים הראה את אוכלוסיות לשרוד cardiomyoblasts נמקי ותאי גזע mesenchymal. מעניין, אנחנו גם ציין שלישי, "פצוע" cardiomyoblast תא האוכלוסייה שהכיל calcein אך הכיל גם את החיווי של תאים מתים, ethidium homodimer (איור 2).

באיור 2. נציג הדוט העלילה של אוכלוסיות תאים שונות לאחר איסכמיה מדומה.

ההערכה של מספר ניסויים shoד 'כי תוספת של תא גזע mesenchymal כדי cardiomyoblast H9c2 postischemic גדל באופן משמעותי את אחוז התאים החיים לעומת myoblasts לב בתרבית לבד לאחר איסכמיה (איור 3).

באיור 3. . השפעת הטיפול בתאי גזע על cardiomyoblasts postischemic אחוז תאים חיים צומצם משמעותית לאחר איסכמיה מדומה לעומת שליטה (שליטה מול IR דגם: 90.36 ± 2.60 לעומת 10.52 ± 0.48, *** p> 0.001), שגברה לאחר תוספת של בתאי גזע mesenchymal (IR מודל מול IR + BMSC: 10.52 ± 0.48 לעומת 25.21 ± 2.13, *** p> 0.001). הנתונים מייצגים ממוצע ± SEM. ניתוח סטטיסטי של הנתונים בוצע באמצעות חד סטרי ניתוח שונות עם פוסט השוואה של מספר טיוקי הוק הבדיקה.

Discussion

פרוטוקול הפגינו הוא בגישה חוץ גופית לנושא הרבה יותר מורכב של טיפול בתאי גזע של אוטם שריר הלב, עם כל היתרונות והחסרונות של מודל כזה. ברור שזה לא יכול לשקף את מורכבות (למשל, מערכת החיסון) האירועים המתרחשים במהלך ואחרי האוטם בשריר הלב, אך ניתן למקד את ההשפעות הישירות של תאים התווסף ב התאים postischemic. ההשפעות של איסכמיה מדומה על H9c2 cardiomyoblasts מאוד תלוי בזמן OGD, מספר על המעבר של התאים בשימוש על ריכוז O _2. צריך להתאים את הפרמטרים באופן מדויק למצוא את התנאים האופטימליים עבור סוג תאים מסוימים כדי שיהיה פרוטוקול אחיד. לאחר מכן, הפרוטוקול ניתן להשתמש בדרכים רבות (כליות, כבד או איסכמיה מוחית / reperfusion ^11,12,13,14) כדי לחקור את ההשפעות של סוגי תאים שונים מוסף כגון לתאי גזע עובריים, המושרה בתאי גזע pluripotent או בתאי גזע בוגרים ^15, הדוארffectiveness של המדיום מותנה ¹⁶ או pretreatments שונים ^17,18 או כל פרמטר מוקד של עניין.