Transplantation de cellules souches dans un In vitro Simulation d'ischémie / reperfusion modèle

Summary

Nous démontrons comment mettre en place une

Abstract

Protocoles greffe de cellules souches trouvent leur chemin dans la pratique clinique ^1,2,3. Obtenir de meilleurs résultats, ce qui rend les protocoles plus robustes, et de trouver de nouvelles sources de cellules implantables font l'objet de recherches récentes ^4,5. Étude de l'efficacité des thérapies cellulaires n'est pas une tâche facile et de nouveaux outils sont nécessaires pour étudier les mécanismes impliqués dans le processus ^de traitement ^6. Nous avons conçu un protocole expérimental d'ischémie / reperfusion en vue de permettre l'observation des connexions cellulaires et des mécanismes subcellulaires même durant l'ischémie / reperfusion et après la transplantation de cellules souches et d'évaluer l'efficacité de la thérapie cellulaire. H9c2 cellules cardiomyoblast ont été placés sur des plaques de culture cellulaire ^7,8. L'ischémie a été simulé avec 150 minutes dans un milieu glucose libre avec le niveau d'oxygène inférieur à 0,5%. Ensuite, les médias normaux et les niveaux d'oxygène ont été réintroduits afin de simuler la reperfusion. Après privation de glucose d'oxygène,les cellules endommagées ont été traités avec la transplantation de moelle osseuse humaine marquée dérivées des cellules souches mésenchymateuses en les ajoutant à la culture. Les cellules souches mésenchymateuses sont préférés dans les essais cliniques, car ils sont facilement accessibles grâce à la chirurgie invasive minimale, facilement extensible et autologues. Après 24 heures de co-culture, les cellules ont été colorées avec calcéine et éthidium homodimère-à différencier entre les cellules vivantes et mortes. Cette configuration nous a permis d'étudier les connexions intercellulaires utilisant microscopie confocale à fluorescence et de quantifier le taux de survie des cellules post-ischémique par cytométrie en flux. La microscopie confocale a montré les interactions entre les deux populations cellulaires telles que la fusion cellulaire et la formation des nanotubes intercellulaires. L'analyse par cytométrie en flux a révélé trois groupes de cellules endommagées qui peuvent être reportés sur un graphique et analysées statistiquement. Ces populations peuvent être étudiés séparément et conclusions peuvent être tirées de ces données sur l'efficacité de la simulationapproche thérapeutique.

Protocol

1. Préparation H9c2 cellules cardiomyoblast

H9c2 cardiomyoblasts rat ont été obtenus auprès de l'ATCC (Wesel, Allemagne) et élargi en glucose (4,5 g / L) DMEM contenant 10% de sérum fœtal bovin, 4 mM de L-glutamine, 100 U / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine. La ligne de cellules myoblastes H9c2 est dérivé de coeur de rat embryonnaire, il est utilisé comme un modèle in vitro pour les deux muscles squelettiques et cardiaques ^8,9.

Préparer la plaque 12 puits de cellules H9c2:

1. Enlever un milieu de culture à partir de la boîte de Pétri H9c2 cellules.
2. Laver les cellules deux fois avec 5 ml de PBS et de digérer avec 2-3 ml de 0,05% de trypsine / EDTA.
3. Placez une boîte de Pétri pendant 5 minutes dans l'étuve à 37 ° C.
4. Inhibition de la trypsine avec 10 ml de milieu de culture DMEM.
5. Isoler les cellules à 1200 RPM pendant 8 minutes.
6. Après élimination du surnageant, remettre les cellules en 1 ml de milieu de culture DMEM et les cellules compter avec l'aide hémocytomètre coloration au bleu trypan.
7. Graine 30000 H9c2 cellules dans 2 ml de DMEM par puits dans une plaque de 12 puits.
8. Placer la plaque dans l'incubateur à 37 ° C CO ₂ pendant 24 heures.

2. L'ischémie simulée / reperfusion

Ischémie / reperfusion a été simulé in vitro, en effectuant privation de glucose d'oxygène (AMG) sur H9c2 cultures cellulaires. Cette procédure a été effectuée sur la scène du microscope confocal Zeiss avec le système PeCon incubation cellulaire (Erbach, Allemagne) permettant l'observation des cellules au cours des AMG.

1. Retirer moyennes par aspiration à partir de 12 plaques à puits d'H9c2 cellules.
2. Laver les cellules deux fois avec du PBS.
3. Ajouter 3 ml de glucose moyennes gratuitement par puits.
4. Placer la plaque dans le système d'incubation des cellules.
5. Démarrer l'azote gazeux à purger l'oxygène du système d'incubation.
6. Attendez que le niveau d'oxygène atteint 0,5% puis démarrer le chronomètre. D'oxygène de 0,5% signifie environ 3 mmHg de tension partielle. Sous réserve de cellules 150 minutes d'ischémie simulée.
7. A la fin de l'ischémie simulée, éliminer le milieu glucose libre à partir des cellules.
8. Pipeter 2 ml de milieu de culture normales dans les puits.
9. Placer la plaque de 12 puits pendant 30 minutes dans les 37 ° C de CO ₂ incubateur, ce qui est de la "période de reperfusion».

3. Préparation des cellules souches mésenchymateuses de secours

La moelle osseuse d'origine humaine a été prise en flacons T75 et dilué avec de milieu Dulbecco modifié Eagle (DMEM) milieu de culture contenant 10% de sérum de veau foetal (FCS), 100 U / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine, 4 mM de L-glutamine et 1 g / l de glucose. Les fioles ont été incubées à 37 ° C dans une atmosphère totalement humidifiée de 5% de CO ₂ pendant 3 jours. Après la période d'incubation de la BMSCs collé à la surface des fioles et les autres composantes de la moelle osseuse ont été éliminés par un lavage avec du PBS. Le BMSCs utilisées étaient entre 1 et 5 passages dans les expériences. L'identité de cellules a été confirmé par la présence de la lignée des marqueurs spécifiques de surface cellulaire avec la cytométrie de flux. Marqueurs de surface spécifiques lignée hématopoïétiques (CD34, CD45) et des marqueurs de surface mésenchymateuses (CD73, CD90, CD105 et CD166) ont été étudiés.

Durant l'ischémie simulée, de préparer le sauvetage des cellules souches mésenchymateuses pour la transplantation.

1. Diluer le colorant fluorescent Vybrant DID en 1:200 ratio en milieu de culture DMEM.
2. Aspirer moyennes à partir des cellules de sauvetage et ajouter 300 ul DMEM avec Vybrant DID.
3. Placez une boîte de Petri pendant 30 minutes dans les 37 ° C incubateur à CO _2.
4. Retirer milieu de culture de boîte de Pétri de cellules souches mésenchymateuses.
5. Laver les cellules deux fois avec 5 ml de PBS et de digérer avec 2-3 ml de 0,05% de trypsine / EDTA.
6. Placez une boîte de Pétri pendant 5 minutes dans l'étuve à 37 ° C.
7. Inhibition de la trypsine avec 10 ml de milieu de culture DMEM.
8. Isoler les cellules à 1200 RPM pendant 8 minutes.
9. Après avoir retiré la REMPrnatant, remettre les cellules en 1 ml de milieu de culture DMEM et les cellules compter avec l'aide hémocytomètre coloration au bleu trypan.
10. Après 30 minutes à la fin de la reperfusion ajouter 20 000 cellules souches mésenchymateuses par puits à l'H9c2 postischémique myoblastes cardiaques.
11. Placez la co-culture de cellules dans les 37 ° C incubateur à CO ₂ pendant 24 heures.

4. Analyse par microscopie confocale

Après la simulation de l'ischémie / reperfusion, les cellules sont incubées dans un milieu de culture normal pour 24 heures.

1. Après 24 heures laver les cellules deux fois avec du PBS.
2. Colorer les cellules dans 500 ul vivants / morts solution de colorant pendant 30 minutes (5 nM et 400 nM calcéine éthidium homodimère-2-en PBS) (5x10 ⁴ cellules / ml).

L'évaluation des images confocal pour les cellules vivantes et mortes sélectionné par la morphologie et la fluorescence peut être effectuée avec le logiciel ImageJ (National Institutes of Health, Etats-Unis). En cas de co-cultures, les CSM peuvent être distinguées des cellules H9c2 en raison de leur marquage cellulaire Vybrant DID. Le ratio de cellules mortes peuvent être évalués dans 4 champs de vue indépendant (objectif 10x) pour chaque culture d'une manière aveugle, ^10.

H9c2 cardiomyoblasts cultivés sur des lamelles en verre 42 mm peuvent également être étudiés par microscopie vidéo laps de temps pendant et après l'ischémie / reperfusion en utilisant le système d'incubation des cellules du microscope confocal. De cellule à cellule des interactions telles que la fusion cellulaire et la formation des nanotubes intercellulaires peuvent être étudiés au cours du temps.

5. Analyse avec la cytométrie en flux

Après la simulation de l'ischémie / reperfusion, les cellules sont incubées dans un milieu de culture normal pour 24 heures.

1. Après 24 heures, la récolte des milieux de culture. Il est très important de recueillir le milieu de culture aussi parce que certaines cellules mortes pourraient avoir détaché de la surface boîte de culture au cours des 24 heures d'incubationtion.
2. Laver les cellules deux fois avec du PBS et digérer avec 0,05% de trypsine-EDTA.
3. Inhibition de la trypsine avec milieu de culture DMEM.
4. Isoler les cellules et le milieu de culture récoltée à 1200 RPM (environ 150-200g) pendant 8 minutes.
5. Jeter le surnageant.
6. Suspendre les cellules dans 500 ul vivants / morts solution de colorant pendant 30 minutes (5 nM et 400 nM calcéine éthidium homodimère-2-en PBS) (5x10 ⁴ cellules / ml).
7. Transfert aux cellules de flux de tubes de cytométrie.
8. Démarrez le logiciel Pro CellQuest.
9. Pour configurer le cytomètre en flux pour la mesure, de contrôle de préparer des échantillons de cellules vivantes et mortes.
   1. Plaque H9c2 cellules à une densité de 3x10 ⁴ en plaques de 12 puits comme décrit au point 1.
   2. Préparer contrôle direct cellule avec trypsinisation unique comme décrit au point 1.
   3. Préparer les contrôles de cellules mortes par un traitement avec 10 uM H ₂ O ₂ pendant 1 heure.
   4. Après trypsinisation, resuspend vivre et de contrôle de cellules mortes dans 500 ul solution de colorant vivants / morts (5 nM calcéine-AM et 400 nM éthidium homodimère-2-en PBS).
10. Les réglages de l'instrument doit être réglé afin que les cellules vivantes sont calcéine positive et éthidium homodimère négative, tandis que les cellules mortes sont calcéine négatifs et positifs éthidium homodimère.
11. Le pourcentage de ces populations peut être exprimé comme barres sur un graphique et l'analyse statistique peuvent être effectuées sur ces valeurs.
12. Mesurer les différents groupes expérimentaux.

6. Les résultats représentatifs:

Nos résultats ont montré que les cellules souches mésenchymateuses ajoutée pourrait améliorer la survie des cellules cardiaques post-ischémique. Images de microscopie confocale a révélé direct de cellule à cellule des interactions, comme la connexion à membrane partielle ou nanotubes intercellulaires, qui jouent probablement un rôle important dans la protection observée ^10. Ces nanotubes s'étendent sur des distances de plusieurs cellules diameters, et leurs diamètres sont compris entre 200 et 500 nm (flèches blanches).

Figure 1. Formation de nanotubes entre les cellules. Formation de nanotubes (flèche blanche) a été observée entre cardiomyoblasts DiO Vybrant étiquetés et Vybrant DiD étiquetés cellules souches mésenchymateuses.

L'analyse par cytométrie en flux a montré les populations de survivre et de cardiomyoblasts nécrotiques et les cellules souches mésenchymateuses. Fait intéressant, nous avons également observé une troisième population, «blessés» cardiomyoblast cellule qui contenait calcéine mais contenait aussi l'indicateur des cellules mortes, d'éthidium homodimère (figure 2).

Figure 2. Représentant dot-plot des populations cellulaires différentes après ischémie simulée.

L'évaluation de plusieurs expériences shoMer que l'ajout de cellules souches mésenchymateuses à H9c2 cardiomyoblast postischémique augmenté de manière significative le pourcentage de cellules vivantes par rapport à des myoblastes cardiaques cultivées seules après ischémie (figure 3).

Figure 3. . Effet du traitement sur ​​les cellules souches cardiomyoblasts postischémique pourcentage de cellules vivantes a été significativement réduite après une ischémie simulée par rapport au contrôle (contrôle vs IR modèle: 90,36 ± 2,60 vs 10,52 ± 0,48, *** p> 0,001), qui a augmenté après l'addition des cellules souches mésenchymateuses (IR modèle vs IR + BMSC: 10,52 ± 0,48 vs 25,21 ± 2,13, *** p> 0,001). Les données représentent la moyenne ± SEM. L'analyse statistique des données a été réalisée en utilisant une analyse de variance avec post comparaison multiple de Tukey hoc test.

Discussion

Le protocole a démontré une approche in vitro à la question beaucoup plus complexe de la thérapie de cellules souches dans l'infarctus du myocarde, avec tous les avantages et les inconvénients d'un tel modèle. Évidemment, il ne peut pas refléter la complexité (immunologiques, par exemple) des événements qui ont lieu pendant et après l'infarctus du myocarde, mais peuvent se concentrer sur les effets directs des cellules ajoutés sur les cellules post-ischémique. Les effets de l'ischémie simulée sur H9c2 cardiomyoblasts dépendent fortement du temps d'autres ministères, sur le nombre de passage des cellules utilisées et sur ​​la concentration d'O _2. On doit ajuster ces paramètres avec précision et trouver les conditions optimales pour un type de cellule de certains afin d'avoir un protocole standardisé. Ensuite, le protocole peut être utilisé de plusieurs façons (rénale, hépatique ou cérébrale d'ischémie / reperfusion ^11,12,13,14) pour étudier les effets des différents types de cellules ajoutée tels que les cellules souches embryonnaires, cellules souches pluripotentes induites ou cellules souches adultes ^15, le courrierFFICACITÉ du milieu conditionné ^{de 16} ou divers prétraitements ^17,18 ou tout autre paramètre dans le centre d'intérêt.