Transplante de Células-tronco em um In vitro Modelo de isquemia / reperfusão Simulated

Summary

Demonstramos como configurar um

Abstract

Protocolos de transplante de células-tronco estão encontrando seu caminho na prática clínica ^1,2,3. Obter melhores resultados, fazendo com que os protocolos mais robustos, e encontrar novas fontes de células implantáveis ​​são o foco de pesquisas recentes ^4,5. Investigar a eficácia de terapias celulares não é uma tarefa fácil e novas ferramentas são necessários para investigar os mecanismos envolvidos no processo de tratamento ^6. Nós projetamos um protocolo experimental de isquemia / reperfusão, a fim de permitir a observação de conexões celulares e mecanismos subcelulares mesmo durante a isquemia / reperfusão e após o transplante de células-tronco e para avaliar a eficácia da terapia celular. H9c2 cardiomyoblast células foram colocadas em placas de cultura de células ^7,8. Isquemia foi simulado com 150 minutos em um meio de glicose livre com nível de oxigênio abaixo de 0,5%. Então, a mídia normal e os níveis de oxigênio foram reintroduzidos para simular reperfusão. Após a privação de glicose oxigênio,as células danificadas foram tratados com transplante de medula óssea humana rotulados derivados de células-tronco mesenquimais, adicionando-os à cultura. Células-tronco mesenquimais são as preferidas em ensaios clínicos, porque eles são facilmente acessíveis com cirurgia minimamente invasiva, facilmente expansível e autólogo. Após 24 horas de co-cultivo, as células foram coradas com calceína e de etídeo-homodímero de diferenciar entre células vivas e mortas. Esta configuração permitiu investigar as conexões intercelulares por microscopia de fluorescência confocal e quantificar a taxa de sobrevivência de células pós-isquêmica por citometria de fluxo. Microscopia confocal mostrou as interações das duas populações de células, tais como fusão celular e formação de nanotubos intercelular. Citometria de fluxo revelou três grupos de células danificadas que podem ser plotados em um gráfico e analisados ​​estatisticamente. Essas populações podem ser investigados separadamente e conclusões podem ser tiradas destes dados sobre a eficácia do simuladoabordagem terapêutica.

Protocol

1. Preparando H9c2 células cardiomyoblast

H9c2 cardiomyoblasts ratos foram obtidos a partir ATCC (Wesel, Alemanha) e ampliado em glicose (4,5 g / L) DMEM contendo 10% de soro fetal bovino, 4 mM L-glutamina, 100 U / ml de penicilina e estreptomicina 100 mg / ml. O H9c2 linha celular de mioblastos é derivada de coração de rato embrionárias, é usada como um modelo in vitro para ambos os músculos esqueléticos e cardíaco ^8,9.

Prepare 12 placa bem de H9c2 células:

1. Remova o meio de cultura de Petri prato de H9c2 células.
2. Lave as células duas vezes com 5 ml de PBS e digerir com 2-3 ml 0,05% tripsina / EDTA.
3. Coloque placa de Petri por 5 minutos nos 37 ° C incubadora.
4. Inibir a tripsina com 10 ml meio de cultura DMEM.
5. Girar as células a 1200 RPM por 8 minutos.
6. Depois de retirar o sobrenadante, ressuspender as células em um meio de cultura DMEM ml e contagem de células com hemocitômetro usando Trypan coloração azul.
7. Semente H9c2 30.000 células em 2 ml DMEM por bem em uma placa de 12 poços.
8. Coloque a placa no 37 ° C incubadora de CO ₂ por 24 horas.

2. Isquemia simulada / reperfusão

Isquemia / reperfusão foi simulada in vitro através da realização de privação de oxigênio glicose (OGD) em H9c2 culturas de células. Este procedimento foi realizado no palco do microscópio confocal Zeiss com o sistema de incubação de células Pecon (Erbach, Alemanha), permitindo a observação das células durante OGD.

1. Remova o meio por aspiração de 12 placa bem de H9c2 células.
2. Lave as células duas vezes com PBS.
3. Adicionar 3 ml de glicose livre médio por poço.
4. Coloque a placa no sistema de incubação de células.
5. Iniciar gás nitrogênio para purgar o oxigênio do sistema de incubação.
6. Aguarde até que o nível de oxigênio atinge 0,5%, em seguida, iniciar o temporizador. De oxigênio de 0,5% significa aproximadamente 3 mmHg de tensão parcial. Células sujeitas a uma50 minutos de isquemia simulada.
7. No final da isquemia simulada, remova a mídia de glicose livre das células.
8. Pipetar 2 ml meio de cultura normal para os poços.
9. Coloque a placa de 12 poços por 30 minutos nos 37 ° C incubadora de CO _2, este é o "período de reperfusão".

3. Preparar resgate células-tronco mesenquimais

Medula óssea de origem humana foi levada em T75 frascos e diluídas com meio modificado Dulbecco Águia (DMEM) meio de cultura contendo 10% de soro fetal bovino (FCS), 100 U / ml de penicilina e 100 estreptomicina mcg / ml, 4 mM L-glutamina e 1 g / l de glicose. Os frascos foram incubados a 37 ° C em uma atmosfera totalmente umidificado de 5% de CO ₂ para 3 dias. Após o período de incubação, a BMSCs aderidos à superfície dos frascos e os demais componentes da medula óssea foram eliminados por lavagem com PBS. O BMSCs utilizadas foram entre 1 e 5 passagens nos experimentos. A identidade de células foi confirmada pela presença de marcadores de linhagem específica de superfície celular por citometria de fluxo. Marcadores de linhagem hematopoiéticas específicos de superfície (CD34, CD45) e marcadores de superfície mesenquimais (CD73, CD90, CD105 e CD166) foram investigados.

Durante a isquemia simulada, preparar resgate de células-tronco mesenquimais para transplante.

1. Diluir o corante fluorescente Vybrant fez em razão de 1:200 em meio de cultura DMEM.
2. Aspirar médio das células de resgate e adicionar 300 mL com DMEM Vybrant DiD.
3. Prato de Petri lugar por 30 minutos nos 37 ° C incubadora de CO _2.
4. Remova o meio de cultura de Petri prato de células-tronco mesenquimais.
5. Lave as células duas vezes com 5 ml de PBS e digerir com 2-3 ml 0,05% tripsina / EDTA.
6. Coloque placa de Petri por 5 minutos nos 37 ° C incubadora.
7. Inibir a tripsina com 10 ml meio de cultura DMEM.
8. Girar as células a 1200 RPM por 8 minutos.
9. Depois de retirar o supernatant, ressuspender as células em um meio de cultura DMEM ml e contagem de células com hemocitômetro usando Trypan coloração azul.
10. Depois de 30 minutos no final da reperfusão adicionar 20.000 células-tronco mesenquimais por bem ao pós-isquêmica H9c2 mioblastos cardíacos.
11. Lugar de co-cultura de células para a 37 ° C incubadora de CO ₂ por 24 horas.

4. Análise com microscopia confocal

Após a lesão de isquemia / reperfusão simulados, as células são incubadas em meio de cultura normal para 24 horas.

1. Após 24 horas de lavagem células duas vezes com PBS.
2. Mancha as células em 500 solução vivo / morto mL de corante por 30 minutos (5 nM e 400 nM calceína etídio-homodímero-2 em PBS) (5x10 ⁴ células / ml).

A avaliação das imagens confocal para as células vivas e mortas selecionados pela morfologia e de fluorescência pode ser realizada com o software ImageJ (National Institutes of Health, EUA). Em caso de co-culturas, MSCs pode ser distinguido do H9c2 células, devido à sua rotulagem célula Vybrant DiD. A proporção de células mortas pode ser avaliada em 4 campos independentes de vista (objetiva de 10x) para cada cultura de uma forma cega ^10.

H9c2 cardiomyoblasts cultivadas em lamínulas de vidro 42 mm, podem também ser investigado com o tempo de vídeo microscopia de lapso durante e depois da isquemia / reperfusão usando o sistema de incubação de células do microscópio confocal. Célula a célula-interações como a fusão celular e formação de nanotubos intercelular pode ser estudada ao longo do tempo.

5. A análise por citometria de fluxo

Após a lesão de isquemia / reperfusão simulados, as células são incubadas em meio de cultura normal para 24 horas.

1. Após 24 horas, colher os meios de cultura. É muito importante recolher o meio de cultura também, porque algumas células mortas poderiam ter separado da superfície da placa de cultura durante a incubação 24 horasção.
2. Lave as células duas vezes com PBS e digerir com 0,05% de tripsina-EDTA.
3. Inibir a tripsina com meio de cultura DMEM.
4. Girar as células eo meio de cultura colhida em 1200 RPM (aproximadamente 150-200g) por 8 minutos.
5. Desprezar o sobrenadante.
6. Suspender as células em 500 solução vivo / morto mL de corante por 30 minutos (5 nM e 400 nM calceína etídio-homodímero-2 em PBS) (5x10 ⁴ células / ml).
7. Transferência de células para citometria de fluxo de tubos.
8. Inicie o software Pro CellQuest.
9. Para configurar o citômetro de fluxo para medição, controle de preparar amostras de células vivas e mortas.
   1. Placa H9c2 células a uma densidade de 3x10 ⁴ em 12 placas bem como descrito no ponto 1.
   2. Prepare viver controles célula com trypsinisation única como descrito no ponto 1.
   3. Prepare os controles de células mortas através de tratamento com 10 mM H ₂ O ₂ por 1 hora.
   4. Depois trypsinisation, resuspend viver e controles de células mortas em 500 mL de solução de corante ao vivo / morto (5 nM calceína-AM e 400 nM de etídio-homodímero-2 em PBS).
10. As configurações de instrumento deve ser ajustado de modo que as células vivas são calceína positivo e de etídeo homodímero negativo, enquanto as células mortas são calceína negativos e de etídeo homodímero positivo.
11. A porcentagem dessas populações pode ser expressa como barras em um gráfico e análise estatística podem ser realizadas sobre esses valores.
12. Medir os diferentes grupos experimentais.

6. Resultados representativos:

Nossos resultados mostraram que acrescentou células-tronco mesenquimais pode melhorar a sobrevivência de células cardíacas pós-isquêmica. Imagens de microscopia confocal revelou direta célula-célula para interações, como a ligação da membrana parcial ou nanotubos intercelular, o que provavelmente desempenham um papel importante na proteção observada ^10. Esses nanotubos decorrerá ao longo de distâncias de várias células diameters, e seus diâmetros foram entre 200 e 500 nm (setas brancas).

Figura 1. Formação de nanotubos entre as células. Nanotubos de formação (seta branca) foi observada entre cardiomyoblasts Vybrant Dio rotulados e DiD Vybrant rotulados células-tronco mesenquimais.

Citometria de fluxo mostraram as populações de sobreviver e cardiomyoblasts necrótico e células-tronco mesenquimais. Curiosamente, também observamos uma terceira, 'feridos' população de células que continha cardiomyoblast calceína mas também continha o indicador das células mortas, homodímero de etídio (Figura 2).

Figura 2. Representante dot-plot dos diferentes populações de células após a isquemia simulada.

A avaliação de vários experimentos showed que a adição de células-tronco mesenquimais para cardiomyoblast H9c2 pós-isquêmica aumentou significativamente a percentagem de células vivas em comparação com os mioblastos cardíacos cultivadas somente após a isquemia (Figura 3).

Figura 3. . Efeito do tratamento com células-tronco em cardiomyoblasts pós-isquêmica Percentagem de células vivas foi significativamente reduzida após isquemia simulada em relação ao controle (controle versus modelo de IR: 90,36 ± 2,60 vs 10,52 ± 0,48, *** p <0,001), que aumentou após a adição de células-tronco mesenquimais (IR modelo vs IR + BMSC: 10,52 ± 0,48 vs 25,21 ± 2,13, *** p <0,001). Os dados representam média ± SEM. Análise estatística dos dados foi realizada utilizando uma forma de análise de variância com pós Tukey de comparações múltiplas hoc teste.

Discussion

O protocolo demonstrado in vitro é uma abordagem para a questão muito mais complexa da terapia com células-tronco em infarto do miocárdio, com todas as vantagens e desvantagens de tal modelo. Obviamente, ele não pode refletir a complexa (imunológica, por exemplo) eventos que ocorrem durante e após infarto do miocárdio, mas pode se concentrar sobre os efeitos diretos das células adicionado nas células pós-isquêmica. Os efeitos da isquemia simulada sobre H9c2 cardiomyoblasts depende muito do tempo de OGD, sobre o número passagem das células utilizadas e sobre a concentração de O _2. Deve-se ajustar esses parâmetros com precisão e encontrar as condições ideais para um tipo de célula certas para ter um protocolo padronizado. Posteriormente, o protocolo pode ser usado de várias maneiras (renal, hepática ou isquemia / reperfusão cerebral ^11,12,13,14) para investigar os efeitos de diferentes tipos de células acrescentado, tais como células-tronco embrionárias, células-tronco pluripotentes induzidas, ou células-tronco adultas ^15, e osffectiveness de meio condicionado ^{de 16} ou pré-tratamentos vários ^17,18 ou de qualquer parâmetro no foco de interesse.