Summary
13 C-isotopen märkning är en användbar teknik för att bestämma cellens centrala metabolism för olika typer av mikroorganismer. Efter celler har odlats med en märkt visst substrat, kan GC-MS mätning avslöjar funktionella metabola vägar bygger på en unik märkning mönster i proteinogena aminosyror.
Abstract
Mikroberna har komplexa metaboliska vägar som kan undersökas med hjälp av biokemi och funktionell genomik metoder. En viktig teknik för att undersöka cellens centrala metabolism och upptäck nya enzymer är 13 C-assisterad metabolism analys 1. Denna teknik bygger på isotop märkning, där mikrober matas med en 13 märkta C substrat. Genom att spåra stigar atomen övergången mellan metaboliter i biokemiska nätverk kan vi bestämma funktionella vägar och upptäcka nya enzymer.
Som en kompletterande metod för att transcriptomics och proteomik, tillvägagångssätt för isotopomer-assisterad analys av metaboliska vägar innehåller tre stora steg 2. För det första växer vi celler med 13 märkta C substrat. I det här steget, sammansättningen av mediet och valet av märkta substrat är två viktiga faktorer. För att undvika mätning ljud från omärkta kol i näringsämne kosttillskottÄr en minimal medium med ett enda kolkälla krävs. Vidare är valet av en märkt substrat baserat på hur effektivt det kommer att belysa vägen som analyseras. Eftersom nya enzymer ofta medför olika reaktioner stereokemi eller mellanprodukter i allmänhet, var för sig märkt kol substrat är mer informativa för att upptäcka nya vägar än enhetligt märkt dem för att upptäcka nya vägar 3, 4. För det andra analyserar vi aminosyran mönster syra märkning med GC -MS. Aminosyror är rik på protein och därmed kan erhållas från biomassa hydrolys. Aminosyror kan derivatiserade av N-(tert-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide (TBDMS) innan GC separation. TBDMS derivatiserade aminosyror kan vara splittrat av MS och resulterar i olika kedjor av fragment. Baserat på massa för att laddning (m / z) ratio på fragmenterade och unfragmented aminosyror, kan vi härleda möjliga märkt mönster av de centrala metaboliter somprekursorer av aminosyror. tredje spår vi 13C kol övergångar i den föreslagna vägar och, baserat på isotopomer data, bekräfta om dessa vägar är aktiva 2. Mätning av aminosyror ger isotop märkning information om åtta viktiga föregångare metaboliter i de centrala ämnesomsättningen. Dessa metabola viktiga noder kan spegla funktioner associerade central-vägar.
13 C-assisterad metabolism analys via proteinogena aminosyror kan ofta används för funktionell karakterisering av dåligt kännetecknas mikrobiell metabolism 1. I detta protokoll kommer vi att använda Cyanothece 51.142 som modell stam att demonstrera användningen av märkt kol substrat för att upptäcka nya enzymatiska funktioner.
Protocol
1. Cellkultur (Figur 1)
- Väx celler i minimal medium med spårämnen, salter, vitaminer och särskild märkning substrat kol som är bäst för väg utredning. Använd antingen skaka flaskor eller bioreaktorer för cellodling. Organiska näringsämnen, såsom jästextrakt, kan störa mätningen av aminosyran märkning och kan därför inte vara närvarande i odlingsmedium.
- Övervaka celltillväxt genom den optiska densitet kulturen på ett optimalt våglängd (t.ex. OD 730 för Cyanothece 51.142) med en UV / Vis spektrofotometer.
- Celler kan först odlas i en omärkt medium. Den mellersta-log tillväxtfas celler är att föredra för att användas för inokulering (3% (v / v) i volym ympning ratio) av den märkta medium. Det märkta kulturen ska vara sub-odlade (3% v / v ympning ratio) i märkt samma medium för att undvika införandet av icke-märkta kol från den ursprungliga inokulat.
- Harvest sub-odlade celler (10mL) i mitten-log tillväxtfas genom centrifugering (10 min, 8000 × g).
- Återsuspendera pelleten i 1,5 mL av 6M HCl och överföra det till ett klart glas, skruvlock GC flaskan. Cap flaskorna och placera dem i en 100 ° C ugn i 24 timmar för att hydrolysera det biomassa proteiner till aminosyror. Hydrolys av biomassa pellets kan ge 16 av de 20 vanliga aminosyrorna (Figur 2) 5. Cystein och tryptofan bryts ner, och glutamin och asparagin omvandlas till glutamat och aspartat, respektive.
- Centrifugera aminosyran lösningen på 20.000 × g under 5 min med 2 ml Eppendorf-rör, och överföra supernatanterna till nya GC-flaskor. Detta steg avlägsnar fasta partiklar i hydrolys lösningen.
- Ta bort GC flaskan lock och torka proverna helt under en luftström med en Thermo Scientific Reacti-Vap förångare (notera: en frysning torktumlare kan också användas to torra prover). Detta steg kan göras över en natt.
3. Aminosyra derivatisering och GC-MS villkor
Analys av aminosyror eller debiteras / mycket polära metaboliter via GC kräver att dessa metaboliter vara derivatiserade, så att de aminosyror som är flyktiga och kan separeras med gaskromatografi 2.
- Lös upp torkade prover med 150 mikroliter av tetrahydrofuran (THF) och 150 mikroliter av N-(tert-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide derivatisering reagens.
- Inkubera alla prover i en ugn eller i vattenbad mellan 65 och 80 ° C i 1 timme. Vortex emellanåt för att se att metaboliter i flaskan löses upp.
- Centrifugera proverna på 20.000 × g under 10 minuter, och sedan överföra supernatanten till nya GC-flaskor. Supernatanten bör vara en klar och gulaktig. På grund av mättnad av detektorer, kan GC-MS mätnoggrannhet kan påverkas av den höga concentration av injicerade TBDMS derivatiserade aminosyror (dessa prover visar ofta mörkbrun färg), därför bör vi späda ut dessa prover med THF innan GC-MS mätning 6.
- Analysera prover med GC-MS (använd en 1:05 eller 1:10 delningsfaktorn, injektionsvolym = 1 mikroliter, bärgas helium = 1,2 ml / min). Använd följande GC temperaturprogram: håll vid 150 ° C i 2 minuter, öka till 3 ° C per minut till 280 ° C, ökar vid 20 ° C per minut till 300 ° C, och håll sedan i 5 minuter. Lösningsmedel fördröjning kan ställas in som ~ 5 min (för en 30 meter GC-kolonn). Utbudet av massa för att Debiteringsgraden (m / z) i MS kan ställas in mellan 60 och 500.
4. GC-MS analys av data
- TBDMS derivatiserade aminosyra mätning kan också påverkas av isotop diskriminering i GC-separering. Ljus isotoper gå något snabbare än vräka isotoper i GC-kolumn. För att minska de potentiella mätfel, kan vi i genomsnitt massan spektrum av helaaminosyra topp utbud 6
- GC och MS spektra av TBDMS derivatiserade metaboliter har rapporterats före 7. GC uppehållstid och den unika m / z toppar för varje aminosyra illustreras i figur 3.
- Derivatisering av aminosyror eller centrala metaboliter introducerar stora mängder naturligt-märkta isotoper, inklusive 13 C (1,13%), 18 O (0,20%), 29 Si (4,70%) och 30 Si (3,09%). Mätningen buller från naturliga isotoper i den råa massan isotopomer spektrum kan korrigeras med hjälp av publicerade program 5, 8. Den slutliga isotopiska märkning uppgifter redovisas som viktandel, t.ex. 0 M, M 1, M 2, M 3 och M 4 (motsvarande fragment som innehåller noll till fyra 13 C-märkt kol).
- Mätning av aminosyror kan ge isotop märkning information om åtta viktiga föregångare metaboliter: 2-oxo-glutaråt, 3-P-glycerate, acetyl-CoA, erythrose-4-P, oxalacetat, fosfoenolpyruvat, pyruvat och ribos-5-P. Märkningen mönster i dessa metaboliter kan användas för att identifiera flera centrala metaboliska vägar (figur 2) 9. Resultatet av märkningen experimenten kan ytterligare bekräftas med andra biokemiska metoder (t.ex. RT-PCR).
5. Pathway analys med märkt aminosyra uppgifter
Genom att undersöka endast ett par viktiga aminosyror som produceras från de väldesignade 13 C spårämnesförsök, kan vi avslöja flera unika vägar eller verksamhet enzym utan att utföra sofistikerade 13 C-metabolisk flödesanalys av hela centrala metabolism.
- Entner-Doudoroff vägen: [1 - 13 C] glukos kan användas som kolkälla. Om vägen är aktiv kommer serin märkning vara betydligt lägre än märkning i alanin 10.
- Grenade TCA cykeln: [1 - 13 C]pyruvat kan användas som kolkälla. Om TCA cykeln är trasig, kan aspartat märkas av två kolatomer, medan glutamat är märkt med endast en kol 11, 12.
- CO 2-fixeringen av Calvin-Benson-Bassham cykeln i ett mixotrophic metabolism: omärkta CO 2, och märkta kol substrat både används som kolkällor. Om Calvincykeln är funktionell, kommer serin och histidin märkning vara betydligt efter utspädning, att jämföra med andra aminosyror. Sådan metod kan avgöra den relativa CO 2 fixering när organiskt kol källor är närvarande på medellång 13.
- Oxidativ pentosjäsande fosfat vägen: [1 - 13 C] glukos kan användas som kolkälla. Om vägen är aktiv kommer omärkta alanin vara> 50% 12.
- Anaplerotic vägen (t ex PEP + CO 2 à oxalacetat): 13 CO 2 och omärkta kol substrat (t ex glycerol eller PYRuvate) kan användas som kolkälla. Om vägen är aktiv kommer aspartat märkning vara betydligt berikas, att jämföra med alanin och serin 13.
- Re-citrat syntas: [1 - 13 C] pyruvat kan användas som kolkälla. Om enzymet är aktivt glutamat märkt β-karboxylgrupp 3, 4.
- Citramalate väg: [1 - 13 C] pyruvat, [2 - 13 C] glycerol, eller [1 - 13 C] acetat kan användas som kolkälla. Om vägen är aktiv, leucin och isoleucin märkning belopp är identiska 14.
- Serin-isocitrate lyase cykel: [1 - 13 C] pyruvat eller [1 - 13 C] laktat kan användas som kolkälla. Om vägen är aktiv, kommer den tredje positionen kol i serin märkas 15.
- Utnyttjande av näringsämnen (dvs exogena aminosyror): ett odlingsmedium med fullt märkt kol substrat och icke-märkta aminosyrorkan användas. Om cellerna selektivt utnyttja dessa kompletteras omärkta näringsämnen, kommer vi att se betydande märkning utspädning av dessa aminosyror i biomassa. Denna metod kan användas för att undersöka vilka näringsämnen tillskott är att föredra av cellen 16.
6. Representativa resultat
Nyligen bioenergi studier har återupplivat intresse i att använda nya fototrofa mikroorganismer för produktion av bioenergi och CO 2-avskiljning. Under de senaste åren har en hel del 13C-metabolism analyser, inklusive avancerade 13C-Metabola Flux Analyser (13C-MFA), har tillämpats för att undersöka centrala ämnesomsättning i fototrofa bakterier, eftersom biokemiska kunskap om centrala metaboliska vägar är inte välgrundad i dessa icke-modellorganismer 10, 11, 17-20. Här presenterar vi ett exempel på upptäckten av en alternativ isoleucin väg i Cyanothece 51.142 21. Cyanothece 51.142 innehåller inte enzymet (EG 4.3.1.19, treonin ammoniak-lyase), som katalyserar omvandlingen av treonin till 2-ketobutyrate i den typiska isoleucin syntesväg. För att lösa isoleucin vägen, växer vi Cyanothece 51.142 (20 ml) i ASP2 medelstora 22 med 54 mm glycerol (2-13C,> 98%). Cyanothece 51.142 utnyttjar 2: a plats märkt glycerol som den viktigaste kolkälla. Vi observerar att treonin och alanin ha en märkt kol, medan isoleucin är märkt med tre kolatomer. Därför kan syntes i Cyanothece 51.142 inte härledas från treonin vägen används av de flesta organismer (Figur 4). Å andra sidan, leucin och isoleucin har samma märkning mönster som bygger på fragment (M-15) + och fragment (M-159) +. Till exempel isotopomer data från [M-15] + (innehåller unfragmented aminosyror) visar samma märkning av leucin (M0 = 0,01, M1 = 0,03, M2 = 0,21, M3 = 00,69) och isoleucin (M0 = 0,01, M1 = 0,03, M2 = 0,24, M3 = 0,67). Således leucin och isoleucin måste syntetiseras från samma prekursorer (dvs. pyruvat och acetyl-CoA). Denna observation är förenlig med den märkta kol övergången i citramalate väg för isoleucin syntes. För att bekräfta denna väg, söker vi den gemensamma Genome Institute databas och hitta närvaron av en citramalate syntas Cima (cce_0248) i Cyanothece.
Figur 1. 13 C-assisterad väg analys steg.
Figur 2. Aminosyror används för att förvärva märkning mönster av deras metaboliska prekursorer. ACoA, acetyl-CoA, AKG, α-ketoglutarat, C5P, ribos 5-fosfat, CIT, citrat, E4P, erythrose 4-fosfat; G6P, glukos 6-fosfat, OAA, oxalacetat, PEP, fosfoenolpyruvat, PGA, 3-phosphoglycerate, PYR, pyruvat.
Figur 3. GC toppar för 16 aminosyror. TBDMS derivatiserade aminosyror knäckt av MS i två fragment: (M-57) +, som innehåller hela aminosyra, och (M-159) +, som saknar α karboxylgrupp av aminosyran. För leucin och isoleucin, de (M-57) + har överlappas av andra massa toppar. Vi föreslår att du använder fragmentet (M-15) + att analysera hela aminosyran märkning. Den (F302) + gruppen upptäcks i de flesta aminosyror, som innehåller endast den första (α-karboxylgrupp) och andra kolväten i en aminosyra ryggrad. Eftersom denna MS topp ofta har hög brus-to-signal nyckeltal, (F302) + rekommenderas inte för kvantitativt analysera metabola flöden 7.
igure 4 "/>
Figur 4. Labeling övergångar i isoleucin vägar i Cyanothece 51.142 (modifierad från våra tidigare papper) 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll består av utfodring cellen med en märkt substrat och mäta den resulterande isotopisk märkning mönster i de aminosyror via GC-MS. Eftersom MS-data (m / z-förhållanden) ge bara det totala beloppet för märkning av MS-joner, måste vi bedöma isotopomer distributioner av aminosyror genom att undersöka m / z förhållande både unfragmented (M-57) + och fragmenterad aminosyror (dvs (M-159) + och (F302) +). Dessutom kan vi utföra flera cellodlingar med ett kemiskt identiska medium men substrat som har olika märkning mönster (1 st ställning märkt, 2: a plats märkt, etc.). Märkningen information om metaboliter från dessa experiment kan integreras för att avkoda den verkliga rutterna kolet övergång genom de centrala metaboliska vägar.
För väg analys, är valet av en märkt substrat viktigt. I allmänhet, var för sig märkt kol substrat EASIER att använda i spåra öde märkt kol när 13 C tränger genom centrala vägar, medan flera av kol märkta substrat kan förväxla kol spårning. Dessutom, var för sig märkta substrat är mer informativt att belysa unika molekyl strukturer metaboliter än enhetligt märkta substrat. 4 Till exempel visar (Re)-typ citrat syntas annan reaktion stereokemi från normala citrat syntas, och därmed orsakar citrate att ha olika molekylära kiralitet . Å andra sidan, substrat är annorlunda i deras lämplighet att upptäcka tillhörande vägar. Glukos är bäst för att upptäcka delningsfaktorn mellan glykolysen och pentosjäsande vägar fosfat, medan pyruvat eller acetat är bäst för att analysera TCA cykeln och vissa aminosyror vägar syra. Därför är det nödvändigt att använda olika substrat för att undersöka den allmänna bilden av cellens ämnesomsättning.
13 C-isotopenmärkning är en användbar teknik för att bestämma funktionella vägar i mikroorganismer. Emellertid har denna teknik flera begränsningar. För det första det lämpar sig endast för analys av kol ämnesomsättning med hjälp av organiska substrat, eftersom det inte direkt kan lösa metabolism hos autotrofa ämnesomsättning om CO 2 används som enda kolkälla. Autotrofa kulturerna med CO 2 märka alla aminosyror i samma utsträckning som ingång 12 CO 2 / 13 CO 2 blandningen 23. Detta gör vägen analys svårt, eftersom ämnesomsättningen analysen måste härledas från en ombildning av 13 C kolatomer i metaboliter av olika metaboliska vägar. Andra presenteras i detta dokument enbart kvalitativa resultat att skilja mellan "aktiv" och "icke-aktiva" vägar. Exakt kvantifiering av metabolism kräver en sofistikerad modellering (dvs.
Slutligen ett ökande antal genomet sekvenser för icke-modell mikroorganismer som publiceras varje år. Har dock funktionell karakterisering av dessa arter släpat långt efter takten i genomiska sekvensering. 13 C-märkning metoder kan spela viktiga roller i bekräftelsen och upptäckten av metaboliska vägar i många icke-modellorganismer. Dessutom kan märkning informationen integreras med metabola modellering (13 C-MFA) att dechiffrera absolut kolflöden i mikroorganismer 25. Därför kan denna teknik vara allmänt används för att analysera biologiska system relaterade till biobränsle, EcologiCal och medicinska tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av en NSF Career Grant (MCB0954016) och en DOE Bioenergy Research Grant (DEFG0208ER64694).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TBDMS | Sigma-Aldrich | 19915 | - |
| THF | Sigma-Aldrich | 34865 | - |
| Labeled carbon substrate | Cambridge Isotope Laboratories | Depend on the experimental requirement | Website: http://www.isotope.com |
| Gas chromatograph | Agilent Technologies | Hewlett-Packard, model 7890A | - |
| GC Columns | J&W Scientific | DB5 (30m) | - |
| Mass spectrometer | Agilent Technologies | 5975C | - |
| Reacti-Vap Evaporator | Thermo Fisher Scientific, Inc. | TS-18825 | For drying amino acid samples |
References
- Zamboni, N., Sauer, U. Novel biological insights through metabolomics and 13C-flux analysis. Curr. Opin. Microbiol. 12, 553-558 (2009).
- Tang, Y. J. Advances in analysis of microbial metabolic fluxes via 13C isotopic labeling. Mass. Spectrom. Rev. 28, 362-375 (2009).
- Tang, Y. J. Investigation of carbon metabolism in Dehalococcoides ethenogenes strain 195 via isotopic and transcriptomic analysisa. J. Bacteriol. 191, 5224-5231 (2009).
- Tang, Y. J. Pathway confirmation and flux analysis of central metabolic pathways in Desulfovibrio vulgaris Hildenborough using GC-MS and FT-ICR mass spectrometry. Journal of Bacteriology. 189, 940-949 (2007).
- Dauner, M., Sauer, U. GC-MS analysis of amino acids rapidly provides rich information for isotopomer balancing. Biotechnology Progress. 16, 642-649 (2000).
- Wittmann, C.
- Antoniewicz, M. R., Kelleher, J. K., Stephanopoulos, G. Accurate assessment of amino acid mass isotopomer distributions for metabolic flux analysis. Anal. Chem. 79, 7554-7559 (2007).
- Wahl, S. A., Dauner, M., Wiechert, W. New tools for mass isotopomer data evaluation in 13C flux analysis: mass isotope correction, data consistency checking, and precursor relationships. Biotechnology and Bioengineering. 85, 259-268 (2004).
- Shaikh, A., Tang, Y. J., Mukhopadhyay, A., Keasling, J. D. Isotopomer distributions in amino acids from a highly expressed protein as a proxy for those from total protein. Analytical Chemistry. 80, 886-890 (2008).
- Tang, K. -H., Feng, X., Tang, Y. J., Blankenship, R. E. Carbohydrate metabolism and carbon fixation in Roseobacter denitrificans OCh114. PLoS One. 4, e7233-e7233 (2009).
- Tang, K. -H. Carbon flow of Heliobacterium modesticaldum is more related to Firmicutes than to the green sulfur bacteria. J. Biol. Chem. 285, 35104-35112 (2010).
- Feng, X. Characterization of the Central Metabolic Pathways in Thermoanaerobacter sp. X514 via Isotopomer-Assisted Metabolite Analysis. Appl. Environ. Microbiol. 75, 5001-5008 (2009).
- Feng, X. Mixotrophic and photoheterotrophic metabolisms in Cyanothece sp. ATCC 51142 under continuous light. Microbiology. 156, 2566-2574 (2010).
- Tang, Y. J. Flux analysis of central metabolic pathways in Geobacter metallireducens during reduction of soluble Fe(III)-NTA. Appl. Environ. Microbiol. 73, 3859-3864 (2007).
- Tang, Y. J., Meadows, A. L., Kirby, J., Keasling, J. D. Anaerobic central metabolic pathways in Shewanella oneidensis MR-1 reinterpreted in the light of isotopic metabolite labeling. Journal of Bacteriology. 189, 894-901 (2007).
- Zhuang, W. Q. Selective utilization of exogenous amino acids by Dehalococcoides ethenogenes strain 195 and the enhancement resulted to dechloronation activity. Appl. Environ. Microbiol. , Forthcoming (2011).
- Feng, X., Tang, K. -H., Blankenship, R. E., Tang, Y. J. Metabolic flux analysis of the mixotrophic metabolisms in the green sulfur bacterium Chlorobaculum tepidum. J. Biol. Chem. 285, 35104-35112 (2010).
- McKinlay, J. B., Harwood, C. S. Carbon dioxide fixation as a central redox cofactor recycling mechanism in bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, (2010).
- McKinlay, J. B., Harwood, C. S. Calvin cycle flux, pathway constraints, and substrate oxidation state together determine the H2 biofuel yield in photoheterotrophic bacteria. MBio. 2, (2011).
- Erb, T. J. Synthesis of C5-dicarboxylic acids from C2-units involving crotonyl-CoA carboxylase/reductase: The ethylmalonyl-CoA pathway. PNAS. 104, 10631-10636 (2007).
- Wu, B. Alternative isoleucine synthesis pathway in cyanobacterial species. Microbiology. 156, 596-602 (2010).
- Reddy, K. J., Haskell, J. B., Sherman, D. M., Sherman, L. A. Unicellular, aerobic nitrogen-ï¬xing cyanobacteria of the genus Cyanothece. J. Bacteriol. 175, 1284-1292 (1993).
- Shastri, A. A., Morgan, J. A. A transient isotopic labeling methodology for 13C metabolic flux analysis of photoautotrophic microorganisms. Phytochemistry. 68, 2302-2312 (2007).
- Tang, Y. J. Invariability of central metabolic flux distribution in Shewanella oneidensis MR-1 under environmental or genetic perturbations. Biotechnol Prog. 25, 1254-1259 (2009).
- Zamboni, N., Fendt, S. M., Ruhl, M., Sauer, U.
