Summary
MALDI-TOF ספקטרומטריית מסה נוצל בהצלחה כדי לפקח על חילופי אמיד מימן / דאוטריום בהפעלת חלבון kinase Pak2.
Abstract
חילופי אמיד מימן / דאוטריום (H / D החליפין) יחד עם ספקטרומטריית מסה כבר בשימוש נרחב על מנת לנתח את הממשק של אינטראקציות בין חלבונים, שינויי קונפורמציה בחלבון, הדינמיקה חלבון וחלבון-אינטראקציות ליגנד. H / D החליפין על עמדות אמיד עמוד השדרה נוצל כדי למדוד את שיעורי deuteration של מיקרו אזורים בחלבון על ידי ספקטרומטריית מסה 1,2,3. הרזולוציה של שיטה זו תלויה העיכול פפסין של החלבון deuterated עניין לתוך פפטידים, כי בדרך כלל בטווח 3-20 שאריות. למרות ההחלטה של H / D חילופי נמדד על ידי ספקטרומטריית מסה נמוכה יותר ברזולוציה שאריות אחד נמדד לפי שיטת Heteronuclear יחיד קוונטית (HSQC) קוהרנטיות של התמ"ג, המדידה ספקטרומטריית מסה ב-H / D החליפין אינו מוגבל על ידי גודל של חלבון 4. H / D החליפין מתבצע בתמיסה מימית אשר שומרת קונפורמציה בחלבון. אנו מספקים שיטה utilizes MALDI-TOF לגילוי 2, במקום HPLC / ESI (יינון electrospray)-MS מערכת 5,6. MALDI-TOF מספק נתונים מדויקים עוצמת המסה של פפטידים של חלבון מתעכל, בכל מקרה זה חלבון קינאז Pak2 (המכונה גם γ-Pak). Proteolysis של 2 פאק מתבצע העיכול פפסין מקוון. זו שיטה חלופית, כאשר המשתמש אין גישה לעמודה HPLC ו עכלן המחובר ספקטרומטריית מסה, או כאשר העמודה עכלן על HPLC אינו תוצאה של המפה לעיכול אופטימלי, למשל, בכבדות דיסולפיד-מלוכדות מופרש phospholipase 2 (SPLA 2). ניצול שיטה זו, אנו מצליחים לעקוב שינויים ברמת deuteration במהלך ההפעלה של Pak2 ידי מחשוף 3 caspase ו autophosphorylation 7,8,9.
Protocol
1. Pak2 Activation
- הוסף את הסכום המתאים מראש נבדק של caspase 3 עד 20 μl של Pak2 12 מ"ג / מ"ל במאגר (50 mM טריס-HCl, 150 mM NaCl, ו 2 DTT mM ב-pH 7.5) ו לדגור על 34 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות באופן מלא לדבוק ולהפעיל Pak2.
- נתח את המוצרים המחשוף על ידי SDS-PAGE (10%) ו מכתים Coommassie כחול.
- מוסיפים את Pak2 ביקע למאגר הפעלת B (50 מ"מ טריס-HCl, 150 mM NaCl, 15 מ"מ MgCl 2, 10 mM ATP) ב-pH 7.5, ב 20 μl לריכוז סופי של Pak2 10 מ"ג / מ"ל, ו - דגירה על 34 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי להפעיל באופן מלא על ידי Pak2 autophosphorylation ב -8 אתרים.
- אשר מחשוף מלא Pak2 על ידי הגירה של p34 ו - p27 שברי כפי שנקבע על ידי SDS-PAGE 10. אימות נאות של תנאי autophosphorylation נעשית באמצעות autoradiography בניסוי נפרד באמצעות (32 P) ה-ATP או ספקטרומטריית מסה לזהות phosphopeptides.
2. הזדהותשל פפסין-מתעכל Pak2 שברים
- הוסף 1 מ"ל של חומצה Trifluroacetic 0.1% (TFA) ב-pH 2.5 לשטוף את חרוזי agarose פעמיים לפני השימוש. ואז, צנטריפוגה דגימות עבור 15 שניות ב XG 2000 כדי להסיר את החרוזים.
- הוסף Pak2 (20 מיקרוגרם ב 2 μl של 150 mM NaCl, 50 מ"מ טריס-HCl ו - 2 mM DTT ב-pH 7.5) עד 100 μl של TFA 0.1%, ו דגירה המדגם עבור 5 דקות עם 30 μl של פפסין, מצומדות חרוזים agarose .
- לאזן בשלב הפוכה HPLC טור C18 עם מערכת ממס העיקרי של TFA 0.1% ב-pH 2.5. לעכל עכלן (50 μl) הוא eluted באמצעות שיפוע ליניארי 100 דקות של 0-80% אצטוניטריל המכיל TFA 0.1% בקצב זרימה של 0.2 ml / min. שברים נאספים כל 2 דקות.
- יבש את השברים HPLC עם מהירות-VAC (3 שעות) ו resuspend דגימות בתמיסה של אצטוניטריל (5 μl) ו TFA 0.1% (5 μl) ב-pH 2.5.
- בתחילה, כל שבריר לגילוי פפטידים באמצעות MALDI-TOF PerSeptive Biosystems וויאג'ר STR DE (PE Biosystems, פוסטר סיטי, קליפורניה, ארה"ב).
- 16 שברים המכיל פפטידים כפופים ספקטרומטריית מסה טנדם באמצעות ספקטרומטר Q-TOF המוני XL QSTAR oMALDI MS / MS לזהות את שברי.
- רצף של פפטיד זה מאומת על ידי יונים מוצר שנוצר על ידי ספקטרומטריית מסה בד בבד עם / m z יחסי התיאורטי מבוסס על הרצף הראשוני של Pak2 השימוש באתר חלבון מחפש הזהב ( http://prospector.ucsf.edu/ ) 11.
3. מדידה של Exchange אמיד H / D
- החזק את כל הפתרונות הדרושים ריאגנטים H / D החליפין של 25 מעלות בתוך אמבט מים. ה-ATP הוא מומס במים ואת ה-pH מותאם 7.0 לפני השימוש. נוסף 4mm ATP ב 2 D O חיץ היא למנוע ה-ATP ניתק מן Pak2 לאחר דילול.
- ליזום H / D החליפין על ידי תוספת של 18 μl של בופר D 2 O (50 mM מגבים pH 6.98, 125 mM NaCl) כדי μl 2 (20 מיקרוגרם) של Pak2 במאגר המכיל 150 mM NaCl, 50 מ"מ טריס-HCl (pH 7.5) ו 2 DTT מ"מ, וכתוצאה מכך רמת Pak2 של 10 מ"ג / מ"ל ו - pH של 7.0 ב 0 ° C.
- דגירה דגימות בשלושה עותקים בחילופי H / D עבור 0, 0.5, 1, 3, 5, ו - 10 דקות, או 24 ח
- להרוות את תהליך H / D החליפין על ידי הוספת 180 μl של TFA קר כקרח 0.1% ב-pH 2.2, אשר מביאה את ה-pH עד 2.5 בנפח סופי של 200 μl. עבור דגימות המכילות ATP, 180 μl של TFA קר כקרח 0.11% ב-pH 2.2 משמש כדי לשמור על pH ב 2.5 במצב הרווה.
- הוסף aliquot (100 μl) של המדגם כל הרווה ל μl 30 של הפעיל פפסין-מצומדות חרוזים agarose. העיכול פפסין מותר להמשיך על קרח דק חמש דוגמאות vortexed כל 30 שניות.
- לסיים את מערכת העיכול על ידי צנטריפוגה של המדגם עבור 15 שניות XG ב 5000 ב 4 ° C כדי להסיר את פפסין.
- במהירות ההקפאה דגימות נוזלי N 2 ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ 2לפני ניתוח MALDI-TOF ימים.
- מטריצה עבור MALDI הוא 5 מ"ג / מ"ל של α-cyano-4-hydroxycinnamic חומצה (CHCA) המומסים בתמיסה (1:01:01) של אתנול אצטוניטריל, TFA ו 0.1% ב-pH 2.5 והחזיק ב 0 ° C.
- חלקית להפשיר כל מדגם במהירות לערבב 1 μl של כל דגימה עם μl 1 של מטריקס במקום על צלחת 4 ° C MALDI היעד.
- החלת ואקום בינוני עד הצלחת לייבש את נקודות ב 30 שניות לפני ניתוח MALDI-TOF. הזמן בין הפשרת המדגם ואחזור הספקטרום הוא כ 3 דקות.
- רוכשת MALDI-TOF המוני ספקטרום עם STR PerSeptive Biosystems DE וויאג'ר. רכישת נתונים בקצב של 2 GHz דגימה ב 100.000 ערוצי נתונים, עם מתח 20000-V מואצת, וכן מתח רשת 65% באמצעות מיצוי מתעכב עם עיכוב של 180 ns דופק. מאה סריקות הם בממוצע תוך 2 דקות. המכשיר MALDI-TOF אינו מוגבל כל מותג או כל תוכנה מיוחדת.
- השתמש Data Explorer 4.0 תוכנית מחשב calculאכלו את deuteration של כל קטע.
- חישוב החליפין בחזרה מבוסס על היחס בין מספר deuteron בפועל שולבו ב 24 שעות של H / D חילופי מחולק כל האתרים חליפי אפשרי, שהם עמוד השדרה למעט ואימידים אמיד N-הטרמינל (איור 1).
4. נציג תוצאות:
מחשוף caspase ו autophosphorylation מאומתים על ידי מכתים Commassie SDS-PAGE. Pak2 פעילה היא להקה אחת של 58 kDa. המחשוף של caspase Pak2 תושלם, מייצרת שני שברים, p27 ו - p34 אשר נודדים בנפרד. ההגירה של p27 ו - p34 מראה autophosphorylated חפיפה על הג'ל עקב הגירה של מפגר בקטע p27 phosphorylated במלואו (איור 2).
H / D ניסויים החליפין מתבצעות מספר פעמים בין 0 ל 10 דק '(איור 3). כדוגמה, את מהלך הזמן ההתאגדות דאוטריום לתוך m / ZPeak של 1,697.85 Pak2 פעיל מורכב פסגות איזוטופי מרובים כפי שמוצג על ידי שינוי של המעטפה המונית לאורך זמן.
באיור 1. משוואה לחישוב deuteration.
באיור 2. Autophosphorylation ו מחשוף caspase של Pak2. Caspase-ביקע Pak2 (הנתיב השמאלי), Pak2 פעיל שלם (באמצע הנתיב) ו caspase-ביקע Pak2 autophosphorylated (נתיב ימין) נותחו על ידי SDS-PAGE ו מכתים Coommassie כחול. מעובד מתוך הסו, י.ח. ואח' 2.
באיור 3. הספקטרום המוניים כמובן זמן ההתאגדות דאוטריום עבור Pak2 פעיל. Pak2 פעילה היה נתון H / D exchange דקות 0-10 ונותחו על ידי MALDI-TOF. דוגמה של חלוקת איזוטופי מורחבת של MALDI-TOF של שיא m / z 1,697.85 במהלך תקופה של H / D חילופי מוצג. קו מקווקו אדום מציין את הממוצע של המעטפה המונית במשמרת של המעטפה מציגה את ההמונים deuteration של פפטיד.
Discussion
זיהוי פפסין-מתעכל שברי הוא שלב קריטי של הניסוי חילופי H / D. זיהוי שגוי של הפפטיד יכול להוביל למסקנה שגויה. Pak2 פפסין, הוא מתעכל eluted דרך טור הפוך שלב HPLC C18 כדי לקבל רקע נקי. בניסויים שלנו, סך של 40 שברים נאספו נתונים MALDI-TOF. פפטידים מרובות ניתן לזהות בכל אחד החלקים. פפטידים היו נתונים טנדם ספקטרומטריית מסה (Q-TOF MS / MS ו oMALDI MS / MS) כדי לזהות רצפים שלהם. ספקטרום MS / MS של פפטיד צריך לפחות שלוש יונים מוצר כדי לאשר את הזיהוי של הפפטיד.
סייר נתוני התוכנית 4.0 המחשב (Applied Biosystems) מבצעת את תיקון הבסיס הראשוני סינון רעש. כל הספקטרום צריך להיות מכויל מבוסס על שתי פסגות רצף. אנו לכייל ספקטרום שלנו על ידי המסה התיאורטית של מ undeuterated / z שהם 923.45 ו - 1697.84. Tהוא דיוק המוני אחרי כיול יכול להגיע 10 עמודים לדקה. עם deuteration, מונו איזוטופ עשוי לעבור מסה גבוהה יותר. מגביר צעד לפירוק היחסים הללו כדי m / z הניב את ההמונים משופרת הקשורים deuteration. עוצמות השיא של המעטפה המונית לא ישפיע על רמת deuteration. עם זאת, עוצמות השיא של פסגות איזוטופי במעטפה מסה מסוימת הם קריטיים לחישוב מסת הממוצע. הצעד הראשון של החישוב של deuteron שולבו היא הפחתת מסת פפטיד של המדגם הלא deuterated מן המדגם deuterated. שלושה גורמים אחרים, דילול D 2 O, deuterons שיורית רשתות לוואי החליפין לאחור, יהיה צורך לשקול נוספת בחישוב (איור 1). דילול 2 O D הוא גורם לדילול של D 2 O לאחר ערבוב המדגם ו-D 2 O חיץ ליזום את H / D החליפין. Deuteron שיורי (4.5%) ב שרשראות צד של עכלן לעיכולפפטידים עורך צריך להיות מופחתים. בחזרה לבורסה הוא אובדן בלתי נמנעת של deuteration בכל פפטידים deuterated ו-עכלן מתעכל בתהליך מדידה המונית.
הפפטיד נגיש ממס ביותר (m / z = 1105.60) אחרי שעה של H-24 / D חילופי מייצג אזור deuteration מלא. מספר deuteron משולבים עבור כל אחד פפטידים ההבדל בין centroid של פפטידים deuterated ולא deuterated פפטי Pak2. הפפטיד ביותר deuterated ביותר מ / z 1105 נבחרה לייצג deuteration מלא כאשר Pak2 היה 24 שעות של H / D החליפין. יחס חליפין חזרה חושבה לפי מספר deuteron בפועל שולבו ב 24 שעות של H / D חילופי מחולק כל האתרים חליפי אפשרי פפטיד m / z 1105.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת בחלק מן המכונים הלאומיים לבריאות גרנט GM-26738 (אל ג'ת).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D2O | Aldrich | 7789-20-0 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma-Aldrich | 28166-41-8 | |
| MALDI-TOF | PE Biosystems | Voyager DE STR | |
| Q-TOF mass spectrometer | Q-TOF Ultima-Global | ||
| QSTAR XL oMALDI MS/MS | Applied Biosystems | ||
| Data Explorer 4.0 computer program | Applied Biosystems |
References
- Anand, G. S., Hughes, C. A., Jones, J. M., Taylor, S. S., Komives, E. A. Amide H/2H exchange reveals communication between the cAMP and catalytic subunit-binding sites in the R(I)alpha subunit of protein kinase. A. J. Mol. Biol. 323, 377-386 (2002).
- Hsu, Y. H., Johnson, D. A., Traugh, J. A. Analysis of conformational changes during activation of protein kinase Pak2 by amide hydrogen/deuterium exchange. J. Biol. Chem. 283, 36397-36405 (2008).
- Englander, S. W., Kallenbach, N. R. Hydrogen exchange and structural dynamics of proteins and nucleic acids. Q. Rev. Biophys. 16, 521-655 (1983).
- Katta, V., Chait, B. T. Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Commun. Mass. Spectrom. 5, 214-217 (1991).
- Dennis, E. A. Localizing the membrane binding region of Group VIA Ca2+-independent phospholipase A2 using peptide amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. J. Biol. Chem. 284, 23652-23661 (2009).
- Hsu, Y. H. Calcium binding rigidifies the C2 domain and the intradomain interaction of GIVA phospholipase A2 as revealed by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. J. Biol. Chem. 283, 9820-9827 (2008).
- Lee, N. Activation of hPAK65 by caspase cleavage induces some of the morphological and biochemical changes of apoptosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 13642-13647 (1997).
- Rudel, T., Bokoch, G. M. Membrane and morphological changes in apoptotic cells regulated by caspase-mediated activation of PAK2. Science. 276, 1571-1574 (1997).
- Roig, J., Traugh, J. A. Cytostatic p21 G protein-activated protein kinase gamma-PAK. Vitam. Horm. 62, 167-198 (2001).
- Walter, B. N. Cleavage and activation of p21-activated protein kinase gamma-PAK by CPP32 (caspase 3). Effects of autophosphorylation on activity. J. Biol. Chem. 273, 28733-28739 (1998).
- Clauser, K. R., Baker, P., Burlingame, A. L. Role of accurate mass measurement (+/- 10 ppm) in protein identification strategies employing MS or MS/MS and database searching. Anal. Chem. 71, 2871-2882 (1999).
