Summary
MALDI-TOF massaspectrometrie werd met succes gebruikt om de amide waterstof / deuterium uitwisseling in proteïne kinase Pak2 activatie te controleren.
Abstract
Amide waterstof / deuterium uitwisseling (H / D exchange) gekoppeld aan massaspectrometrie is op grote schaal gebruikt om de interface van eiwit-eiwit interacties, proteïne conformatie verandering, dynamiek en eiwit-eiwit-ligand interacties te analyseren. H / D uit te wisselen over de backbone amide posities is gebruikt om de deuteration tarieven van de micro-regio's in een eiwit te meten door massaspectrometrie 1,2,3. De resolutie van deze methode hangt af van pepsine vertering van de gedeutereerde eiwit van belang in de peptiden die variëren 3-20 residuen. Hoewel de resolutie van de H / D uitwisseling gemeten door middel van massaspectrometrie lager is dan de single residu resolutie gemeten door de heteronucleair Single Quantum Coherence (HSQC) methode van NMR, de massaspectrometrie meting in H / D uitwisseling wordt niet beperkt door de grootte van de eiwit 4. H / D uitwisseling wordt uitgevoerd in een waterige oplossing die eiwitconformatie onderhoudt. Wij bieden een methode die utilizes de MALDI-TOF voor detectie 2, in plaats van een HPLC / ESI (electrospray ionisatie)-MS-systeem 5,6. De MALDI-TOF zorgt voor nauwkeurige massa-intensiteit van gegevens voor de peptiden van de verteerd eiwit, in dit geval proteïne kinase Pak2 (ook wel γ-Pak). Proteolyse van Pak 2 wordt uitgevoerd in een offline pepsine spijsvertering. Deze alternatieve methode, wanneer de gebruiker geen toegang heeft tot een HPLC kolom en pepsine verbonden met massa-spectrometrie, of wanneer de pepsine column op HPLC resulteert niet in een optimale vertering kaart, bijvoorbeeld, de zwaar disulfide-gebonden afgescheiden fosfolipase A 2 hebben (SPLA 2). Gebruik te maken van deze methode hebben we met succes gevolgd veranderingen in het deuteration niveau tijdens activatie van Pak2 door caspase 3 decollete en autofosforylatie 7,8,9.
Protocol
1. Pak2 Activering
- Voeg de juiste vooraf geteste hoeveelheid van caspase 3 tot 20 pl van 12 mg / ml Pak2 in buffer A (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2 mM DTT en bij pH 7,5) en incubeer bij 34 ° C gedurende 30 min volledig te splitsen en te activeren Pak2.
- Analyseer de splitsing producten door SDS-PAGE (10%) en Coommassie blauwe vlekken.
- Voeg de gesplitste Pak2 om de activering buffer B (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 15 mM MgCl2, 10 mM ATP) bij pH 7,5, in 20 ul tot een uiteindelijke concentratie van 10 mg / ml Pak2, en incuberen bij 34 ° C gedurende 30 minuten volledig te activeren Pak2 door autofosforylatie op 8 locaties.
- Bevestigen volledige splitsing van Pak2 door migratie van de p34 en p27 fragmenten, zoals bepaald door SDS-PAGE 10. Een degelijke controle van de autofosforylatie voorwaarden wordt via autoradiografie in een apart experiment met behulp van (32 P) ATP of massa spectrometrie aan fosfopeptiden op te sporen.
2. Identificatievan Pepsine-bundel Pak2 Fragments
- Voeg 1 ml van 0,1% Trifluroacetic Acid (TFA) bij pH 2,5 tot de agarose parels wassen twee keer voorafgaand aan gebruik. Dan, centrifuge de monsters gedurende 15 sec bij 2000 xg om de kralen te verwijderen.
- Voeg Pak2 (20 pg in 2 ui 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl en 2 mM DTT bij pH 7,5) tot 100 pi van 0,1% TFA, en incubeer het monster gedurende 5 min met 30 pi van pepsine-geconjugeerde agarose parels .
- Equilibreren een omgekeerde fase HPLC C18 kolom met een primair oplosmiddel systeem van 0,1% TFA bij pH 2,5. De pepsine te verteren (50 ul) is geëlueerd met een lineaire 100-min gradiënt van 0 - 80% acetonitril met 0,1% TFA bij een debiet van 0,2 ml / min. Fracties worden verzameld om de 2 minuten.
- Droog de HPLC-fracties met een snelheid-Vac (3 uur) en resuspendeer de monsters in een oplossing van acetonitril (5 pl) en 0,1% TFA (5 pi) bij pH 2,5.
- In eerste instantie wordt elke fractie gescreend op peptiden met behulp van de MALDI-TOF PerSeptive Biosystems Voyager DE STR (PE Biosystems, Foster City, CA, USA).
- De 16 fracties die peptiden worden onderworpen aan tandem massaspectrometrie met behulp van een Q-TOF massaspectrometer en een QStar XL oMALDI MS / MS om de fragmenten te identificeren.
- De volgorde van elk peptide wordt gecontroleerd door het product ionen gegenereerd door de tandem massaspectrometrie met de theoretische m / z ratio's gebaseerd op de primaire sequentie van Pak2 het gebruik van de Protein Prospector website ( http://prospector.ucsf.edu/ ) 11.
3. Meting van Amide H / D Exchange
- Houd alle oplossingen en reagentia die nodig zijn voor H / D wisselen bij 25 ° C in een waterbad. ATP is opgelost in water en de pH wordt aangepast tot 7,0 voorafgaand aan gebruik. De extra 4mm ATP in de D 2 O buffer is om ATP te voorkomen dat los te zien van Pak2 na verdunning.
- Initiëren H / D uitwisseling door toevoeging van 18 ul van gebufferde D 2 O (50 mM MOPS pH 6,98, 125 mM NaCl) tot en met 2 pl (20 pg) Van Pak2 in een buffer die 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) en 2 mM DTT, wat resulteert in een Pak2 niveau van 10 mg / ml en een pH van 7,0 bij 0 ° C.
- Incubeer de monsters in drievoud in de H / D ruilen voor 0, 0,5, 1, 3, 5 en 10 minuten, of 24 uur
- Quench de H / D wisselen proces door toevoeging van 180 ul ijskoude 0,1% TFA bij pH 2,2, die de pH brengt 2,5 in een eindvolume van 200 ul. Voor de monsters met ATP, 180 ul ijskoude 0,11% TFA bij pH 2.2 is gebruikt om de pH op 2,5 in de gedoofd conditie te houden.
- Voeg een hoeveelheid (100 pi) van elk uitgeblust monster 30 pi van geactiveerde pepsine-geconjugeerd agarose parels. De pepsine spijsvertering mag gaan op ijs gedurende vijf minuten en de monsters zijn gevortexed elke 30 sec.
- Beëindig de vertering door middel van centrifugeren van het monster gedurende 15 sec bij 5000 xg bij 4 ° C om de pepsine te verwijderen.
- Snel bevriezen de monsters in vloeibare N 2 en bewaar bij -80 ° C voor niet meer dan 2dagen voorafgaand aan de MALDI-TOF-analyse.
- De matrix voor de MALDI is 5 mg / ml van de α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) opgelost in een oplossing (01:01:01) acetonitril, ethanol en 0,1% TFA bij pH 2,5 en gehouden op 0 ° C.
- Gedeeltelijk snel ontdooien elk monster en meng 1 pi van elk monster met 1 pi matrix en vlek op een 4 ° C MALDI richtplaat.
- Breng een matig vacuüm om de plaat aan de vlekken in 30 sec droog voorafgaand aan de MALDI-TOF-analyse. De tijd tussen het ontdooien van het monster en spectrum ophalen is ongeveer 3 minuten.
- Acquire MALDI-TOF massa spectra met een PerSeptive Biosystems Voyager DE STR. Te verwerven gegevens op een 2-GHz sampling rate op 100000 data kanalen, met een 20.000-V versnellen voltage, en een 65% netspanning met behulp van vertraagde extractie met een 180-ns puls vertraging. Honderd scans zijn gemiddeld in 2 minuten. De MALDI-TOF instrument is niet beperkt tot een merk of een bepaalde software.
- Gebruik maken van de Data Explorer 4.0-computer programma om calculat de deuteration van elk fragment.
- Bereken de rug uitwisseling op basis van de verhouding van de werkelijke opgenomen deuteron aantal op 24 uur van de H / D wisselen, gedeeld door alle mogelijke verwisselbare sites, die de ruggengraat amiden, behalve de N-terminale amide (figuur 1).
4. Representatieve resultaten:
Het caspase decollete en autofosforylatie worden gecontroleerd door SDS-PAGE Commassie vlekken. Inactief Pak2 is een enkele band van 58 kDa. Caspase splitsing van Pak2 is voltooid, en produceert twee fragmenten, p27 en p34 die apart migreren. De migratie van autophosphorylated p27 en p34 toont een overlap op de gel als gevolg van de vertraagde migratie van de volledig gefosforyleerd p27 fragment (figuur 2).
H / D uitwisseling experimenten worden uitgevoerd meerdere malen tussen de 0 en 10 min (figuur 3). Als voorbeeld, het tijdsverloop van deuterium opname in de m / ZPEAK 1697,85 van inactieve Pak2 bestaat uit meerdere isotopen pieken zoals blijkt uit de verschuiving van de massa envelop in de tijd.
Figuur 1. Vergelijking voor de berekening van deuteration.
Figuur 2. Autofosforylatie en caspase splitsing van Pak2. Caspase-gesplitst Pak2 (linkerbaan), intact inactief Pak2 (middelste rijbaan) en caspase-gesplitst autophosphorylated Pak2 (rechter rijbaan) werden geanalyseerd door SDS-PAGE en Coommassie blauwe vlekken. Aangepast van Hsu, YH et al. 2.
Figuur 3. Massa spectrum van een tijdsverloop van deuterium incorporatie voor inactieve Pak2. Inactieve Pak2 werd onderworpen aan H / D exchaNSE voor 0-10 min en geanalyseerd door MALDI-TOF. Een voorbeeld van de uitgebreide isotopische verdeling van de MALDI-TOF van de peak m / z 1697,85 in het tijdsverloop van de H / D uitwisseling wordt getoond. De rode stippellijn geeft het gemiddelde van de massa-enveloppe en de verschuiving van de massa envelop toont de deuteration van een peptide.
Discussion
Identificatie van de pepsine-bundel Fragments is een belangrijke stap van de H / D wisselen experiment. Onjuiste identificatie van de peptide kan leiden tot een verkeerde conclusie. Pepsine-verteerd Pak2 is geëlueerd door middel van een omgekeerde fase HPLC C18 kolom aan een schone achtergrond te verkrijgen. In onze experimenten, werden in totaal 40 fracties verzameld en onderworpen aan MALDI-TOF. Meerdere peptiden konden worden geïdentificeerd in elk van de fracties. De peptiden werden onderworpen aan tandem massaspectrometrie (Q-TOF-MS / MS en oMALDI MS / MS) om hun sequenties te identificeren. De MS / MS spectra van een peptide moeten ten minste drie product-ionen tot de identificatie van de peptide te bevestigen.
De Data Explorer 4.0 computerprogramma (Applied Biosystems) voert de initiële uitgangswaarde correctie en ruis filtratie. Elk spectrum moet worden gekalibreerd op basis van twee opeenvolgende pieken. We kalibreren onze spectrum door de theoretische massa van de undeuterated m / z die 923,45 en 1697,84. Thij nauwkeurigheid van massa's na de kalibratie kan oplopen tot 10 ppm. Bij deuteration, kan de mono-isotoop verschuiving naar een grotere massa. Unitaire stap neemt toe tot deze m / z-verhoudingen leverde de verbeterde massa's verbonden met deuteration. De piek intensiteiten van de massa envelop heeft geen invloed op de deuteration niveau. Echter, de piek intensiteiten van de isotopische pieken in een bepaalde massa envelop zijn van cruciaal belang voor de berekening van de gemiddelde massa. De eerste stap van de berekening van de opgenomen deuteron is het aftrekken van de peptide massa van de niet-gedeutereerde monster uit de gedeutereerde monster. Drie andere factoren, de D 2 O verdunning, de resterende deuteronen in de zijketens en de rug te wisselen, zal verder moeten worden beschouwd in de berekening (figuur 1). De D 2 O is de verdunning van de factor D 2 O na het mengen van het monster en D 2 O buffer naar de H / D-uitwisseling initiëren. De resterende deuteron (4,5%) in de zijketens van de pepsine-digested peptiden dient te worden afgetrokken. De back-uitwisseling is het onvermijdelijke verlies van deuteration in alle gedeutereerd en pepsine-verteerd peptiden in de massa meetproces.
De meest toegankelijke oplosmiddel peptide (m / z = 1105,60) na 24-uur van de H / D wisselen vertegenwoordigt een volledige deuteration regio. De ingebouwde deuteron aantal voor elk van de peptiden is het verschil tussen het zwaartepunt van de gedeutereerde en niet-gedeutereerde Pak2 ulcus peptiden. De meest gedeutereerde peptide m / z 1105 werd geselecteerd om volledige deuteration te vertegenwoordigen bij Pak2 was op 24 uur van de H / D wisselen. The Back Exchange Ratio is berekend door de werkelijke opgenomen deuteron aantal op 24 uur van de H / D wisselen, gedeeld door alle mogelijke verwisselbare sites op peptide m / z 1105.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund in een deel van de National Institutes of Health Grant GM-26738 (tot JAT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D2O | Aldrich | 7789-20-0 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma-Aldrich | 28166-41-8 | |
| MALDI-TOF | PE Biosystems | Voyager DE STR | |
| Q-TOF mass spectrometer | Q-TOF Ultima-Global | ||
| QSTAR XL oMALDI MS/MS | Applied Biosystems | ||
| Data Explorer 4.0 computer program | Applied Biosystems |
References
- Anand, G. S., Hughes, C. A., Jones, J. M., Taylor, S. S., Komives, E. A. Amide H/2H exchange reveals communication between the cAMP and catalytic subunit-binding sites in the R(I)alpha subunit of protein kinase. A. J. Mol. Biol. 323, 377-386 (2002).
- Hsu, Y. H., Johnson, D. A., Traugh, J. A. Analysis of conformational changes during activation of protein kinase Pak2 by amide hydrogen/deuterium exchange. J. Biol. Chem. 283, 36397-36405 (2008).
- Englander, S. W., Kallenbach, N. R. Hydrogen exchange and structural dynamics of proteins and nucleic acids. Q. Rev. Biophys. 16, 521-655 (1983).
- Katta, V., Chait, B. T. Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Commun. Mass. Spectrom. 5, 214-217 (1991).
- Dennis, E. A. Localizing the membrane binding region of Group VIA Ca2+-independent phospholipase A2 using peptide amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. J. Biol. Chem. 284, 23652-23661 (2009).
- Hsu, Y. H. Calcium binding rigidifies the C2 domain and the intradomain interaction of GIVA phospholipase A2 as revealed by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. J. Biol. Chem. 283, 9820-9827 (2008).
- Lee, N. Activation of hPAK65 by caspase cleavage induces some of the morphological and biochemical changes of apoptosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 13642-13647 (1997).
- Rudel, T., Bokoch, G. M. Membrane and morphological changes in apoptotic cells regulated by caspase-mediated activation of PAK2. Science. 276, 1571-1574 (1997).
- Roig, J., Traugh, J. A. Cytostatic p21 G protein-activated protein kinase gamma-PAK. Vitam. Horm. 62, 167-198 (2001).
- Walter, B. N. Cleavage and activation of p21-activated protein kinase gamma-PAK by CPP32 (caspase 3). Effects of autophosphorylation on activity. J. Biol. Chem. 273, 28733-28739 (1998).
- Clauser, K. R., Baker, P., Burlingame, A. L. Role of accurate mass measurement (+/- 10 ppm) in protein identification strategies employing MS or MS/MS and database searching. Anal. Chem. 71, 2871-2882 (1999).
