Summary
MALDI-TOF मास स्पेक्ट्रोमेट्री सफलतापूर्वक प्रोटीन kinase Pak2 सक्रियण में एमाइड विनिमय / हाइड्रोजन ड्यूटेरियम की निगरानी के लिए उपयोग किया गया था.
Abstract
एमाइड / हाइड्रोजन ड्यूटेरियम (एच / डी मुद्रा) के विनिमय मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ मिलकर व्यापक रूप से किया गया है प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत, प्रोटीन गठनात्मक परिवर्तन, प्रोटीन गतिशीलता और प्रोटीन ligand बातचीत के इंटरफेस का विश्लेषण किया. एच / डी रीढ़ एमाइड पदों पर विनिमय मास स्पेक्ट्रोमेट्री 1,2,3 द्वारा एक प्रोटीन में सूक्ष्म क्षेत्रों के deuteration दर को मापने के लिए उपयोग किया गया है. इस विधि का संकल्प ब्याज की deuterated प्रोटीन की है कि आम तौर पर 3-20 अवशेषों से लेकर पेप्टाइड्स में पेप्सिन पाचन पर निर्भर करता है है. हालांकि एच / डी मुद्रा का संकल्प मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा मापा एकल अवशेषों Heteronuclear एनएमआर, एच / डी मुद्रा में मास स्पेक्ट्रोमेट्री माप की एकल क्वांटम जुटना विधि (HSQC) द्वारा मापा संकल्प की तुलना में कम है के आकार के द्वारा सीमित नहीं है 4 प्रोटीन. एच / डी मुद्रा जो प्रोटीन रचना का कहना है एक जलीय घोल में किया जाता है. हम एक विधि प्रदान करते हैं कि utilपता लगाने के लिए 2 / HPLC एमएस ईएसआई (electrospray ionization) - 5,6 प्रणाली के बजाय, MALDI-TOF izes. MALDI-TOF पचा प्रोटीन के पेप्टाइड्स के लिए इस मामले में प्रोटीन kinase Pak2 (भी बुलाया γ - पाक) में सटीक जन तीव्रता डेटा प्रदान करता है. 2 पाक के proteolysis बाहर एक ऑफ़लाइन पेप्सिन पाचन में किया जाता है. यह वैकल्पिक विधि है, जब उपयोगकर्ता एक HPLC और पेप्सिन मास स्पेक्ट्रोमेट्री से जुड़े स्तंभ का उपयोग, या जब HPLC पर पेप्सिन स्तंभ एक इष्टतम पाचन नक्शे में परिणाम नहीं करता है उदाहरण के लिए, भारी डाइसल्फ़ाइड बंधुआ secreted 2 Phospholipase नहीं है (2 SPLA). इस विधि का उपयोग, हम सफलतापूर्वक Pak2 के कस्पासे 3 दरार और 7,8,9 autophosphorylation द्वारा सक्रियण के दौरान deuteration स्तर में परिवर्तन पर नजर रखी .
Protocol
1. Pak2 सक्रियकरण
- बफर में 20 μl 12 मिलीग्राम / एमएल Pak2 के पूर्व परीक्षण कस्पासे 3 की उचित राशि जोड़ें एक और 34 (7.5 पीएच में 50 Tris - एचसीएल मिमी, 150 मिमी NaCl, और 2 मिमी डीटीटी) सेते ° 30 मिनट के लिए सी पूरी तरह से फोड़ना और को सक्रिय करने Pak2.
- एसडीएस - पेज (10%) और Coommassie नीले रंग धुंधला हो जाना द्वारा विपाटन उत्पादों का विश्लेषण.
- सक्रियण बफर बी cleaved Pak2 जोड़ें (50 Tris - एचसीएल मिमी, 150 मिमी NaCl, 15 मिमी 2 MgCl, 10 मिमी एटीपी) 7.5 पीएच पर 20 μl में 10 मिलीग्राम / एमएल Pak2 के अंतिम एकाग्रता, और 34 में सेते डिग्री सेल्सियस के लिए 30 मिनट के लिए पूरी तरह से autophosphorylation द्वारा 8 स्थलों पर Pak2 सक्रिय.
- P34 और p27 के रूप में एसडीएस - पेज 10 द्वारा निर्धारित टुकड़े के प्रवास से Pak2 के पूर्ण दरार की पुष्टि करें. Autophosphorylation शर्तों के उचित सत्यापन एक अलग प्रयोग में एटीपी (32 पी) या मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करने के लिए phosphopeptides पता लगाने autoradiography के माध्यम से किया जाता है.
2. पहचानके पेप्सिन पचा Pak2 टुकड़े
- 0.1% 2.5 पीएच agarose मोती धोने दो बार पहले उपयोग करने के लिए पर Trifluroacetic एसिड (TFA) के 1 मिलीलीटर जोड़ें. फिर, 2000 XG में 15 सेकंड के लिए नमूने के मोती हटायें अपकेंद्रित्र.
- 0.1% TFA के 100 μl Pak2 (150 मिमी NaCl के 2 μl में 20 μg, 7.5 पीएच में 50 मिमी Tris - एचसीएल और 2 मिमी डीटीटी) जोड़ें, और पेप्सिन संयुग्मित agarose मोतियों की 30 μl के साथ 5 मिनट के लिए नमूना सेते .
- 2.5 पीएच 0.1% TFA के एक प्राथमिक विलायक प्रणाली के साथ एक रिवर्स चरण HPLC C18 स्तंभ समभार बनाना. 80% 0.2 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह की दर में 0.1% TFA युक्त acetonitrile - पेप्सिन पचाने में (50 μl) 100 मिनट ढाल 0 के एक रेखीय का उपयोग करने के लिए eluted है. Fractions हर 2 मिनट एकत्र कर रहे हैं.
- एक गति Vac (3 घंटे) के साथ HPLC भिन्न सूखी और (5 μl) acetonitrile और 0.1% 2.5 पीएच पर TFA (5 μl) के एक समाधान में नमूने resuspend.
- प्रारंभ में, प्रत्येक अंश MALDI-TOF PerSeptive Biosystems मल्लाह डे (STR पीई द्विपक्षीय का उपयोग कर पेप्टाइड्स के लिए जांच की हैosystems, फोस्टर शहर, सीए, संयुक्त राज्य अमरीका).
- 16 पेप्टाइड्स युक्त भिन्न अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री एक क्यू-TOF मास स्पेक्ट्रोमीटर और QSTAR एक्स्ट्रा लार्ज oMALDI एमएस / एमएस का उपयोग करने के लिए टुकड़े को पहचान करने के लिए अधीन हैं.
- प्रत्येक पेप्टाइड अनुक्रम उत्पाद सैद्धांतिक मी / z Pak2 के प्राथमिक अनुक्रम प्रोटीन पूर्वेक्षक (वेबसाइट का उपयोग पर आधारित अनुपात के साथ अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा उत्पन्न आयनों द्वारा सत्यापित है http://prospector.ucsf.edu/) 11.
3. एमाइड / एच डी एक्सचेंज का मापन
- एक पानी के स्नान में सभी समाधान और अभिकर्मकों के लिए आवश्यक 25 एच / डी मुद्रा ° C पकड़ो. एटीपी पानी में भंग कर रहा है और पीएच 7.0 से निकाला जाता है पहले का उपयोग करने के लिए. अतिरिक्त 4mm डी 2 हे बफर में एटीपी एटीपी कमजोर पड़ने के बाद dissociated रोकने के Pak2 से है .
- बफर D 2 हे (50 मिमी MOPS पीएच 6.98, 125 मिमी NaCl) के 18 μl 2 μl के अलावा द्वारा एच / डी विनिमय प्रारंभ करें (20 μg) Pak2 150 मिमी वाले बफर में NaCl, 50 Tris - एचसीएल मिमी (7.5 पीएच) और 2 मिमी डीटीटी, 10 मिलीग्राम / एमएल के एक Pak2 स्तर में जिसके परिणामस्वरूप और 0 पर 7.0 का एक pH डिग्री सेल्सियस
- एच / डी मुद्रा में तीन प्रतियों में 0, 0.5, 1, 3, 5, और 10 मिनट, या 24 एच. के लिए नमूने सेते
- ठंडा पीएच 2.2 है, जो 200 μl के अंतिम मात्रा में 2.5 पीएच लाता में 0.1% TFA के 180 μl जोड़कर / एच डी विनिमय प्रक्रिया बुझाने. एटीपी, बहुत ठंडा 2.2 पीएच पर 0.11% TFA के 180 μl युक्त नमूने लिए बुझती हालत में पर 2.5 पीएच बनाए रखने के लिए प्रयोग किया जाता है.
- सक्रिय पेप्सिन संयुग्मित agarose मोती के 30 μl प्रत्येक बुझती नमूने के एक विभाज्य जोड़ें (100 μl). पेप्सिन पाचन पांच मिनट के लिए बर्फ पर आगे बढ़ने की अनुमति है और नमूने हर 30 सेकंड vortexed हैं.
- 5,000 XG में 4 पर 15 सेकंड के लिए नमूने के centrifugation द्वारा पाचन बर्खास्त डिग्री सेल्सियस पेप्सिन हटाने के लिए.
- तेजी से अधिक नहीं 2 के लिए तरल 2 एन और दुकान में नमूने -80 डिग्री सेल्सियस पर स्थिरMALDI-TOF विश्लेषण करने के लिए पहले दिन.
- MALDI के लिए मैट्रिक्स 5 / मिलीग्राम मिलीलीटर α-cyano 4 hydroxycinnamic (CHCA) एसिड acetonitrile, इथेनॉल, और पीएच 2.5 से कम 0.1% TFA (01:01:01) के एक समाधान में भंग और 0 डिग्री सेल्सियस पर आयोजित
- आंशिक रूप से प्रत्येक नमूने जल्दी गल और मैट्रिक्स और एक 4 डिग्री सेल्सियस MALDI लक्ष्य थाली पर इस स्थान का 1 μl के साथ प्रत्येक नमूने के 1 μl मिश्रण.
- थाली करने के लिए एक उदारवादी निर्वात लागू MALDI-TOF विश्लेषण करने से पहले 30 सेकंड में धब्बे सूखे. नमूना और स्पेक्ट्रम पुनर्प्राप्ति का विगलन के बीच के समय के बारे में 3 मिनट है.
- एक PerSeptive Biosystems मल्लाह डे STR के साथ MALDI-TOF जन स्पेक्ट्रा मोल. एक 2 गीगा 100.000 डेटा चैनलों पर नमूना दर पर डेटा 20,000 वी तेजी वोल्टेज, और एक 65% ग्रिड 180 एनएस एक पल्स देरी से देरी निकासी का उपयोग वोल्टेज के साथ मोल. 2 मिनट में एक सौ स्कैन औसतन हैं. MALDI-TOF साधन किसी भी ब्रांड या किसी विशेष सॉफ्टवेयर के लिए सीमित नहीं है.
- Calcul के लिए डेटा एक्सप्लोरर 4.0 कंप्यूटर प्रोग्राम का उपयोग करेंप्रत्येक टुकड़ा के deuteration खा लिया.
- वापस एच / डी मुद्रा के 24 घंटा सभी संभव विनिमेय साइटों, जो एन टर्मिनल एमाइड (चित्रा 1) के अलावा रीढ़ amides द्वारा विभाजित वास्तविक शामिल ड्यूटरान संख्या के अनुपात पर आधारित मुद्रा की गणना .
4. प्रतिनिधि परिणाम:
कस्पासे दरार और autophosphorylation एसडीएस पृष्ठ Commassie धुंधला द्वारा सत्यापित कर रहे हैं. निष्क्रिय Pak2 58 केडीए के एक एकल बैंड है. Pak2 के कस्पासे दरार पूरा हो गया है, और दो टुकड़े, p27 और p34 जो अलग से विस्थापित पैदा करता है. autophosphorylated p27 और p34 पूरी तरह phosphorylated p27 टुकड़ा (चित्रा 2) के मंद प्रवास करने के लिए कारण जेल पर एक ओवरलैप से पता चलता है के प्रवास.
एच / डी मुद्रा प्रयोगों 0 और 10 मिनट (चित्रा 3) के बीच कई बार किया जाता है . एक उदाहरण के रूप में, मीटर / जिला परिषद में ड्यूटेरियम निगमन के समय पाठ्यक्रमनिष्क्रिय Pak2 eak 1,697.85 के कई समस्थानिक चोटियों के रूप में समय के साथ बड़े पैमाने पर लिफाफा के बदलाव से दिखाया गया है की रचना है.
चित्रा 1 deuteration की गणना के लिए समीकरण.
चित्रा 2 Autophosphorylation और Pak2 के कस्पासे दरार. कस्पासे cleaved Pak2 (बाईं लेन), बरकरार निष्क्रिय (मध्यम लेन) Pak2 और कस्पासे cleaved autophosphorylated Pak2 (सही लेन) एसडीएस पृष्ठ और Coommassie नीले रंग धुंधला हो जाना द्वारा विश्लेषण किया गया. सू YH, एट अल 2 से अनुकूलित है .
चित्रा 3 ड्यूटिरियम निगमन के एक निष्क्रिय Pak2 के लिए समय और पाठ्यक्रम के मास स्पेक्ट्रम . निष्क्रिय Pak2 एच / डी excha अधीन था0-10 मिनट के लिए nge और MALDI-TOF से विश्लेषण किया. एच / डी विनिमय के समय के दौरान विस्तारित मीटर / z 1697.85 चोटी के MALDI-TOF के समस्थानिक वितरण का एक उदाहरण दिखाया गया है. लाल बिंदीदार रेखा जन लिफाफा की औसत इंगित करता है और जन लिफाफे के बदलाव एक पेप्टाइड deuteration से पता चलता है.
Discussion
पेप्सिन पचा टुकड़े की पहचान एच / डी विनिमय प्रयोग के एक महत्वपूर्ण कदम है. पेप्टाइड की गलत पहचान एक गलत निष्कर्ष करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. पेप्सिन पचा Pak2 एक रिवर्स चरण HPLC C18 स्तंभ के माध्यम से eluted है एक साफ पृष्ठभूमि प्राप्त करने के लिए. हमारे प्रयोगों में 40 भागों की कुल एकत्र थे और MALDI-TOF के अधीन है. एकाधिक पेप्टाइड्स भागों का प्रत्येक में पहचाना जा सकता है है. पेप्टाइड्स अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (क्यू-TOF एमएस / एमएस और oMALDI एमएस / एमएस) के अधीन थे उनके दृश्यों की पहचान. स्पेक्ट्रा एमएस / एमएस एक पेप्टाइड पेप्टाइड की पहचान की पुष्टि के लिए कम से कम तीन उत्पाद आयनों है चाहिए.
डेटा एक्सप्लोरर 4.0 कंप्यूटर प्रोग्राम (एप्लाइड Biosystems) प्रारंभिक आधारभूत सुधार और शोर छानने का काम करता है. प्रत्येक अनुक्रम दो चोटियों पर आधारित स्पेक्ट्रम कैलिब्रेटेड होना चाहिए. हम undeuterated मी / z जो 923.45 और 1697.84 के सैद्धांतिक जन के द्वारा हमारे स्पेक्ट्रम जांचना. टीवह अंशांकन के बाद जन सटीकता 10 पीपीएम तक पहुँच सकते हैं. Deuteration पर, मोनो आइसोटोप एक उच्च बड़े पैमाने पर करने के लिए बदलाव कर सकते हैं. एकात्मक कदम बढ़ जाती है इन मी / z अनुपात बढ़ाया deuteration के साथ जुड़े आम जनता झुकेंगे. जन लिफाफा के शिखर तीव्रता deuteration स्तर को प्रभावित नहीं करेगा. हालांकि, एक विशेष जन लिफाफे में समस्थानिक चोटियों के शिखर तीव्रता औसत द्रव्यमान की गणना के लिए महत्वपूर्ण हैं. शामिल ड्यूटरान की गणना का पहला कदम गैर deuterated deuterated नमूना से नमूना पेप्टाइड जन घटाकर की जाती है. तीन अन्य कारकों, डी 2 हे कमजोर पड़ने, पक्ष श्रृंखला और वापस मुद्रा में अवशिष्ट deuterons, आगे की गणना में माना जा (चित्रा 1) की आवश्यकता होगी . डी 2 हे मन्दन नमूना मिश्रण और डी 2 हे एच / डी मुद्रा आरंभ बफर के बाद डी 2 हे के कमजोर पड़ने कारक है . पेप्सिन पचाने के पक्ष श्रृंखला में अवशिष्ट ड्यूटरान (4.5%)एड पेप्टाइड्स घटाया जा जरूरत है. वापस विनिमय जन माप की प्रक्रिया में सभी deuterated और पेप्सिन पचा पेप्टाइड्स में deuteration के अनिवार्य नुकसान है.
सबसे विलायक / एच डी मुद्रा के 24 घंटे के बाद सुलभ पेप्टाइड (m / z 1105.60 =) एक पूर्ण deuteration क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है. पेप्टाइड्स के प्रत्येक के लिए शामिल ड्यूटरान संख्या deuterated और गैर deuterated Pak2 पेप्टिक पेप्टाइड्स के केन्द्रक के बीच का अंतर है. सबसे उच्च deuterated पेप्टाइड m / 1105 z पूरा deuteration प्रतिनिधित्व करते हैं जब Pak2 / एच डी मुद्रा के 24 घंटे से कम था चुना गया था. वास्तविक शामिल ड्यूटरान संख्या से एच / डी मुद्रा के 24 घंटा मी / z 1105 पेप्टाइड में सभी संभव विनिमेय साइटों द्वारा विभाजित पर वापस जाएँ विनिमय अनुपात की गणना की गई.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम राष्ट्रीय संस्थानों स्वास्थ्य जीएम 26,738 अनुदान (जाट करने के लिए) से हिस्से में समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D2O | Aldrich | 7789-20-0 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma-Aldrich | 28166-41-8 | |
| MALDI-TOF | PE Biosystems | Voyager DE STR | |
| Q-TOF mass spectrometer | Q-TOF Ultima-Global | ||
| QSTAR XL oMALDI MS/MS | Applied Biosystems | ||
| Data Explorer 4.0 computer program | Applied Biosystems |
References
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