Summary
MALDI-TOF масс-спектрометрии была успешно использована для контроля амид водород / дейтерий обмена белка активации киназы Pak2.
Abstract
Амид водород / дейтерий обмена (H / D обмена) в сочетании с масс-спектрометрии широко используется для анализа интерфейс белок-белковых взаимодействий, белка конформационные изменения, динамики белков и белок-лиганд. H / D обмена на позиции позвоночник амид был использован для измерения дейтерирования темпы микро-регионов белка методом масс-спектрометрии 1,2,3. Разрешение этого метода зависит от пепсина переваривания дейтерированных белок на пептиды, которые обычно в диапазоне от 3-20 остатков. Хотя разрешение H / D обмена измеряется методом масс-спектрометрии ниже, чем одной резолюции остаток измеряется Гетероядерные одиночной квантовой когерентности (HSQC) методом ЯМР, масс-спектрометрия измерения в H / D обмена не ограничен размер белок 4. H / D обмена осуществляется в водном растворе, который поддерживает конформации белка. Мы предлагаем метод, который Utilхарактеризует MALDI-TOF для обнаружения 2, вместо того, чтобы HPLC / ESI (электрораспылением ионизации)-системы MS 5,6. MALDI-TOF обеспечивает получение точных данных интенсивности массы для пептиды усваиваются белки, в этом случае протеинкиназы Pak2 (также называется γ-Pak). Протеолиз Пак 2 проводится в автономном пищеварения пепсина. Этот альтернативный метод, когда пользователь не имеет доступа к высокоэффективной жидкостной хроматографии и пепсина колонки подключены к масс-спектрометрия, или когда пепсина колонке HPLC не приводит к оптимальным карте пищеварения, например, сильно дисульфидными связями выделяются фосфолипазы 2 (SPLA 2). Используя этот метод, мы успешно мониторинг изменений в дейтерирования уровне во время активации Pak2 по каспазы 3 расщепления и аутофосфорилирования 7,8,9.
Protocol
1. Pak2 активации
- Добавить соответствующие предварительные испытания количество каспазы 3 до 20 мкл 12 мг / мл Pak2 в буфере (50 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, 2 мМ DTT при рН 7,5) и инкубировать при температуре 34 ° С в течение 30 мин полностью расщепляют и активируют Pak2.
- Анализ расщепления продуктов SDS-PAGE (10%) и Coommassie синего окрашивания.
- Добавить расщепляется Pak2 к активации буфера B (50 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, 15 мМ MgCl 2, 10 мМ АТФ) при рН 7,5, в 20 мкл до конечной концентрации 10 мг / мл Pak2, и инкубировать при 34 ° С в течение 30 минут, чтобы полностью активировать Pak2 по аутофосфорилирование на 8 мест.
- Подтверждение полной расщепления Pak2 по миграции p34 и p27 фрагментов, как это определено SDS-PAGE 10. Правильная проверка аутофосфорилирование условиях осуществляется через авторадиографии в отдельном эксперименте с использованием (32 P), АТФ или масс-спектрометрии для обнаружения фосфопептидов.
2. Идентификацияпепсина-дайджестом Pak2 Фрагменты
- Добавьте 1 мл 0,1% Trifluroacetic кислота (ТФК) при рН от 2,5 до мытья агарозном бисером дважды перед использованием. Тогда, центрифуга образцы в течение 15 сек при 2000 мкг для удаления бисером.
- Добавить Pak2 (20 мкг в 2 мкл 150 мМ NaCl, 50 мМ Трис-HCl и 2 мМ DTT при рН 7,5) до 100 мкл 0,1% TFA и инкубировать образца в течение 5 мин с 30 мкл пепсина-сопряженных бисером агарозном .
- Уравновешивать обратный ВЭЖХ C18 колонке с основной системой растворителей в размере 0,1% TFA при рН 2,5. Пепсина переваривать (50 мкл) вымывают с помощью линейного 100-мин градиентом 0 - 80% ацетонитрила, содержащего 0,1% ТФУ при скорости потока 0,2 мл / мин. Фракции собираются каждые 2 мин.
- Сухой ВЭЖХ фракции со скоростью-VAC (3 ч) и ресуспендируйте образцов в растворе ацетонитрила (5 мкл) и 0,1% TFA (5 мкл) при рН 2,5.
- Первоначально, каждая фракция, проверенной на пептиды использованием MALDI-TOF PerSeptive Biosystems Voyager DE STR (PE Biosystems, Foster City, Калифорния, США).
- 16 фракций, содержащих пептиды подвергаются тандемной масс-спектрометрии использованием Q-TOF масс-спектрометра и QStar XL oMALDI MS / MS для идентификации фрагментов.
- Последовательность каждого пептида проверяется продукт ионов порожденных тандемной масс-спектрометрии с теоретическими т / г коэффициенты, связанные с первичной последовательности Pak2 использовании сайта белка Prospector ( http://prospector.ucsf.edu/ ) 11.
3. Измерение Амид H / D бирже
- Держите всех растворов и реагентов, необходимых для H / D обмена при 25 ° С на водяной бане. АТФ растворяют в воде и доводят рН до 7,0 до использования. Дополнительные 4 мм АТФ в D 2 O буфер для предотвращения АТФ отделена от Pak2 после разбавления.
- Инициировать H / D обмена путем добавления 18 мкл буфера D 2 O (50 мМ MOPS рН 6,98, 125 мМ NaCl) до 2 мкл (20 мкг) Из Pak2 в буфере, содержащем 150 мМ NaCl, 50 мМ Трис-HCl (рН 7,5) и 2 мМ DTT, в результате чего Pak2 уровне 10 мг / мл и рН 7,0 при 0 ° C.
- Инкубируйте образцы в трех экземплярах, H / D обмен на 0, 0,5, 1, 3, 5 и 10 мин, или 24 ч.
- Quench H / D процесса обмена путем добавления 180 мкл ледяной 0,1% ТФУ при рН 2,2, который приносит рН до 2,5 в конечном объеме 200 мкл. Для образцов, содержащих АТФ, 180 мкл ледяной 0,11% TFA при рН 2,2 используется для поддержания рН на уровне 2,5 в закаленном состоянии.
- Добавить аликвоты (100 мкл) каждого закаленного образца до 30 мкл активированного пепсина-сопряженных бисером агарозы. Переваривание пепсином разрешено приступить к работе на льду в течение пяти минут и образцы встряхивали каждые 30 сек.
- Завершить пищеварения путем центрифугирования образца в течение 15 сек при 5000 мкг при 4 ° С для удаления пепсина.
- Быстрое замораживание образцов в жидком N 2 и хранить при температуре -80 ° С в течение не более 2дней до MALDI-TOF анализа.
- Матрицы для MALDI составляет 5 мг / мл α-циано-4-гидроксикоричных кислоты (CHCA) растворяют в растворе (1:1:1) ацетонитрила, этанола и 0,1% TFA при рН 2,5 и выдерживают при 0 ° C.
- Частично оттепели каждого образца и быстро смешайте 1 мкл каждого образца с 1 мкл матрицы и пятно на 4 ° С пластиной целевой MALDI.
- Применить умеренной вакуума пластины сухие пятна в 30 сек до MALDI-TOF анализа. Время между таянием образца и спектр поиска составляет около 3 мин.
- Приобретать MALDI-TOF масс-спектров с PerSeptive Biosystems STR Voyager DE. Приобретать данных на 2-ГГц частота дискретизации в 100 000 каналов передачи данных, с 20 000-V ускоряющего напряжения, а 65% сетке напряжение, используя задержки экстракции с 180-нс импульс задержки. Сто сканирует усредняются в 2 мин. MALDI-TOF прибор не ограничивается какой-либо марки или какого-либо конкретного программного обеспечения.
- Используйте Data Explorer 4,0 компьютерную программу, чтобы исчислениеели дейтерирования каждого фрагмента.
- Рассчитать обратно обмена основан на отношение фактической включены дейтрона числа в 24 ч H / D обмена делится на всех возможных сменных сайты, которые являются основой амиды, кроме N-терминал амид (рис. 1).
4. Представитель Результаты:
Расщепление каспаз и аутофосфорилирования проверяются SDS-PAGE окрашивания Commassie. Неактивные Pak2 является одной полосы в 58 кДа. Каспаз расщепления Pak2 завершена, и производит два осколка, p27 и p34, которые мигрируют по отдельности. Миграция аутофосфорилированную p27 и p34 показывает перекрытия на геле из-за отсталых миграции полностью фосфорилированного р27 фрагмента (рис. 2).
H / D обмена эксперименты проводятся несколько раз от 0 до 10 мин (рис. 3). В качестве примера, время конечно дейтерия включения в м / грЕАК 1697,85 неактивных Pak2 состоит из нескольких изотопных пиков как показывает смещение масс конверт с течением времени.
Рисунок 1. Уравнение для расчета дейтерирования.
Рисунок 2. Аутофосфорилирование и каспазы расщепления Pak2. Каспазы-расщепляется Pak2 (левая полоса), неповрежденные неактивных Pak2 (средней полосе) и каспазы-расщепляется аутофосфорилированную Pak2 (правая полоса) были проанализированы SDS-PAGE и Coommassie синего окрашивания. По материалам Хсу, YH и др. 2.
Рисунок 3. Масс-спектр время курс дейтерия включения для неактивных Pak2. Неактивные Pak2 подвергался H / D exchaНге за 0-10 мин и проанализированы MALDI-TOF. Пример расширенного изотопного распределения MALDI-TOF пика т / г 1697,85 во время хода H / D обмена показано на рисунке. Красная пунктирная линия показывает среднее значение массы оболочки и смещение масс конверт показывает дейтерирование пептида.
Discussion
Определение Пепсин-дайджестом Фрагменты является важным шагом в H / D эксперимент обмена. Неправильная идентификация пептида может привести к неправильному выводу. Пепсин-переваренной Pak2 вымывается через обратный ВЭЖХ C18 колонке для получения чистой фона. В наших экспериментах в общей сложности 40 фракций были собраны и подвергнуты MALDI-TOF. Несколько пептиды могут быть определены в каждой из фракций. Пептиды были подвергнуты тандемной масс-спектрометрии (Q-TOF MS / MS и oMALDI MS / MS) для определения их последовательности. MS / MS спектры пептида должны иметь не менее трех ионов продукт для подтверждения идентификации пептида.
Данные Explorer 4.0 Компьютерная программа (Applied Biosystems) выполняет начальную коррекция базовой линии и фильтрации шума. Каждый спектр должен быть откалиброван на базе двух последовательных пиков. Мы калибровку наших спектра теоретическая масса undeuterated т / г, которые 923,45 и 1697,84. ТОн массы точность после калибровки может достигать 10 частей на миллион. По дейтерирования, моно-изотопов могут перейти на более высокую массу. Унитарное увеличивает шаг к этим т / г соотношение дали расширенной масс связано с дейтерирования. Пик интенсивности массы конверте не повлияет дейтерирования уровне. Тем не менее, пик интенсивности изотопных пиков в частности массы оболочки имеют решающее значение для расчета средней массы. Первый шаг расчет включены дейтрона вычитания пептид массой, не дейтерированного образца из дейтерированного образца. Три других факторов, D 2 O разбавления, остаточная дейтронов в боковые цепи и обратно обмена, должны быть дополнительно рассмотрены в расчет (рис. 1). D 2 O разведения коэффициент разбавления D 2 O после смешивания образца и D 2 O буфера инициировать H / D обмена. Остаточные дейтрона (4,5%), в боковых цепей пепсина-дайджестред пептидов необходимо вычесть. Резервное обмен неизбежные потери дейтерирования во всех дейтерированных и пепсина-переваренной пептидов в процессе измерения массы.
Наиболее доступным растворителя пептид (м / г = 1105,60), после 24-часового Н / D обмена представляет собой полный регионе дейтерирования. Включены дейтрона номер для каждого из пептидов представляет собой разницу между центром тяжести дейтерированных и не дейтерированного Pak2 пептидов язвенной. Наиболее дейтерированных пептида т / г 1105 был выбран для представления полной дейтерирования когда Pak2 был в 24 ч H / D обмена. Вернуться коэффициент обмена был рассчитан путем фактического включены дейтрона числа в 24 ч H / D обмена делится на всех возможных сменных сайтов на пептида т / г 1105.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа частично поддержана из Национального института здоровья Грант GM-26738 (к JAT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D2O | Aldrich | 7789-20-0 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma-Aldrich | 28166-41-8 | |
| MALDI-TOF | PE Biosystems | Voyager DE STR | |
| Q-TOF mass spectrometer | Q-TOF Ultima-Global | ||
| QSTAR XL oMALDI MS/MS | Applied Biosystems | ||
| Data Explorer 4.0 computer program | Applied Biosystems |
References
- Anand, G. S., Hughes, C. A., Jones, J. M., Taylor, S. S., Komives, E. A. Amide H/2H exchange reveals communication between the cAMP and catalytic subunit-binding sites in the R(I)alpha subunit of protein kinase. A. J. Mol. Biol. 323, 377-386 (2002).
- Hsu, Y. H., Johnson, D. A., Traugh, J. A. Analysis of conformational changes during activation of protein kinase Pak2 by amide hydrogen/deuterium exchange. J. Biol. Chem. 283, 36397-36405 (2008).
- Englander, S. W., Kallenbach, N. R. Hydrogen exchange and structural dynamics of proteins and nucleic acids. Q. Rev. Biophys. 16, 521-655 (1983).
- Katta, V., Chait, B. T. Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Commun. Mass. Spectrom. 5, 214-217 (1991).
- Dennis, E. A. Localizing the membrane binding region of Group VIA Ca2+-independent phospholipase A2 using peptide amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. J. Biol. Chem. 284, 23652-23661 (2009).
- Hsu, Y. H. Calcium binding rigidifies the C2 domain and the intradomain interaction of GIVA phospholipase A2 as revealed by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. J. Biol. Chem. 283, 9820-9827 (2008).
- Lee, N. Activation of hPAK65 by caspase cleavage induces some of the morphological and biochemical changes of apoptosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 13642-13647 (1997).
- Rudel, T., Bokoch, G. M. Membrane and morphological changes in apoptotic cells regulated by caspase-mediated activation of PAK2. Science. 276, 1571-1574 (1997).
- Roig, J., Traugh, J. A. Cytostatic p21 G protein-activated protein kinase gamma-PAK. Vitam. Horm. 62, 167-198 (2001).
- Walter, B. N. Cleavage and activation of p21-activated protein kinase gamma-PAK by CPP32 (caspase 3). Effects of autophosphorylation on activity. J. Biol. Chem. 273, 28733-28739 (1998).
- Clauser, K. R., Baker, P., Burlingame, A. L. Role of accurate mass measurement (+/- 10 ppm) in protein identification strategies employing MS or MS/MS and database searching. Anal. Chem. 71, 2871-2882 (1999).
