Summary
وقد استخدمت بنجاح MALDI - TOF الطيف الكتلي لرصد الهيدروجين أميد / الديوتيريوم الصرف في بروتين كيناز Pak2 التنشيط.
Abstract
وقد أميد الهيدروجين / تبادل الديوتيريوم (H / تبادل D) مقرونا المستخدمة على نطاق واسع الطيف الكتلي لتحليل واجهة من البروتين البروتين التفاعلات والتغيرات متعلق بتكوين البروتين ، وديناميات البروتين وتفاعلات البروتين يجند. وقد استخدمت H / D على تبادل المناصب أميد العمود الفقري لقياس معدلات معالجة بالديوتريوم من المناطق الصغيرة في بروتين بواسطة الطيف الكتلي 1،2،3. حل هذا الأسلوب يعتمد على الهضم من البروتين البيبسين deuterated الفائدة في الببتيدات التي تتراوح عادة 3-20 المخلفات. على الرغم من أن القرار من H / D تبادل يقاس الطيف الكتلي هو أقل من واحد بقايا القرار تقاس Heteronuclear الكم طريقة واحدة (HSQC) تماسك الرنين المغناطيسي ، وقياس الطيف الكتلي في H / D الصرف ليس مقيدا حجم 4 البروتين. ويتم H / D الصرف في محلول مائي التي تحافظ على التشكل من البروتين. نحن نقدم طريقة التي UTILizes في MALDI - TOF للكشف 2 ، بدلا من نظام MS - HPLC / ESI (التأين electrospray) 5،6. و- TOF MALDI توفر بيانات دقيقة عن كثافة الشامل للالببتيدات من البروتين المهضوم ، في هذه الحالة بروتين كيناز Pak2 (وتسمى أيضا γ باك). ويتم التحلل البروتيني من باك 2 من أصل في هضم الببسين حاليا. هذه الطريقة البديلة ، وعندما يقوم المستخدم ليس الوصول إلى عمود HPLC والبيبسين متصلة مطياف الكتلة ، أو عندما يكون العمود البيبسين على HPLC لا ينتج مخطط الهضم الأمثل ، وعلى سبيل المثال ، بشدة ثاني كبريتيد العبودي يفرز فسفوليباز A 2 (الجيش الشعبي 2). باستخدام هذا الأسلوب ، ونحن بنجاح رصد التغيرات في مستوى معالجة بالديوتريوم خلال تفعيل Pak2 التي تشطر 3 caspase وautophosphorylation 7،8،9.
Protocol
1. Pak2 التنشيط
- إضافة المناسبة قبل اختبار كمية caspase 3-20 ميكرولتر من Pak2 ملغ / مل في 12 ألف والعازلة (50 ملي ملي تريس DTT - حمض الهيدروكلوريك وكلوريد الصوديوم 150 ملم ، و 2 في درجة الحموضة 7.5) في احتضان لمدة 30 دقيقة 34 درجة مئوية ليلتصق تماما وPak2 تنشيط.
- تحليل المنتجات التي تشطر SDS - PAGE (10 ٪) ، وتلطيخ Coommassie زرقاء.
- إضافة إلى تفعيل Pak2 المشقوق العازلة ب (50 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك وكلوريد الصوديوم 150 ملم ، 15 ملم MgCl 2 و 10 ملي ATP) عند pH 7.5 ، في 20 ميكروليتر إلى التركيز النهائي للPak2 ملغ / مل 10 و 34 في احتضان درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتنشيط تماما Pak2 بواسطة autophosphorylation في 8 مواقع.
- تأكيد الانقسام الكامل Pak2 من جراء الهجرة من شظايا p34 P27 وعلى النحو الذي يحدده SDS - PAGE 10. يتم التحقق من الشروط المناسبة autophosphorylation عبر تصوير الإشعاع الذاتي في تجربة منفصلة باستخدام (32 ف) للاعبي التنس المحترفين أو قياس الطيف الكتلي لكشف phosphopeptides.
2. تحديدمن البيبسين - إستفتاء Pak2 شظايا
- إضافة 1 مل من حمض Trifluroacetic 0.1 ٪ (TFA) في درجة الحموضة 2.5 لغسل حبات agarose مرتين قبل استخدامها. ثم الطرد المركزي العينات لمدة 15 ثانية في 2000 لإزالة XG الخرز.
- إضافة Pak2 (20 ميكروغرام في 2 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم 150 مم ، 50 ملي ملي تريس DTT - 2 في حمض الهيدروكلوريك ودرجة الحموضة 7.5) إلى 100 ميكرولتر من TFA 0.1 ٪ ، واحتضان العينة لمدة 5 دقائق مع 30 ميكرولتر من الخرز agarose البيبسين ، مترافق .
- يوازن عكس العمود هبلك المرحلة C18 مع النظام الأساسي للمذيب TFA 0.1 ٪ عند pH 2.5. الخلاصة هي eluted البيبسين (50 ميكرولتر) باستخدام خطي 100 دقيقة من الانحدار 0-80 ٪ أسيتونتريل تحتوي TFA 0.1 ٪ في معدل التدفق من 0.2 مل / دقيقة. يتم جمع الكسور كل دقيقة 2.
- تجفيف الكسور HPLC مع بطالة السرعة (3 ح) و resuspend العينات في حل أسيتونتريل (5 ميكرولتر) وTFA 0.1 ٪ (5 ميكرولتر) عند pH 2.5.
- في البداية ، يتم فحص كل جزء لالببتيدات باستخدام - TOF MALDI PerSeptive النظم البيولوجية STR DE فويجر (PE بيosystems ، فوستر سيتي ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة).
- التي يتعرض لها الكسور التي تحتوي على 16 الببتيدات لمطياف الكتلة جنبا إلى جنب باستخدام مطياف الكتلة Q - TOF وXL QSTAR oMALDI MS / MS لتحديد الأجزاء.
- يتم التحقق من تسلسل من كل من أيونات الببتيد المنتجات التي تم إنشاؤها بواسطة مطياف الكتلة جنبا إلى جنب مع نسب م / ض النظرية القائمة على التسلسل الرئيسي للPak2 باستخدام بروتين موقع المنقب ( http://prospector.ucsf.edu/ ) 11.
3. قياس صرف H / D الأميد
- يعقد كل الحلول والكواشف اللازمة لH / D الصرف عند 25 درجة مئوية في حمام مائي. يذوب في الماء ATP ، ويتم تعديل الرقم الهيدروجيني إلى 7.0 قبل الاستخدام. الإضافية 4mM ATP في المنطقة العازلة D O 2 هو لمنع فصلها عن ATP Pak2 بعد التخفيف.
- بدء H / D تبادل باضافة 18 ميكرولتر من مخزنة O 2 D (50 درجة الحموضة 6.98 ملي اجتماعات الأطراف ، 125 ملي مول كلوريد الصوديوم) إلى 2 ميكروليتر (20 ميكروغرام) من Pak2 في العازلة التي تحتوي على كلوريد الصوديوم 150 ملم ، 50 ملم DTT ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك (7.5 درجة الحموضة) و 2 ، مما أدى إلى مستوى Pak2 من 10 ملغ / مل ، ودرجة الحموضة من 7.0 في 0 درجة مئوية.
- احتضان العينات في ثلاث نسخ في تبادل H / D ل0.5 ، 0 ، 1 ، 3 ، 5 و 10 دقيقة ، أو 24 ساعة.
- إخماد عملية التبادل H / D بإضافة 180 ميكروليتر من الجليد الباردة TFA 0.1 ٪ عند pH 2.2 ، مما يجعل الرقم الهيدروجيني إلى 2.5 في الحجم النهائي من 200 ميكروليتر. للعينات التي تحتوي على ATP ، 180 ميكروليتر من الجليد الباردة TFA 0.11 ٪ عند pH 2.2 يستخدم للحفاظ على درجة الحموضة عند 2.5 في حالة مروي.
- إضافة قسامة (100 ميكرولتر) لكل عينة من مروي إلى 30 ميكرولتر من الخرز تنشيط agarose البيبسين ، مترافق. ولا يسمح للهضم الببسين والمضي قدما على الجليد لمدة خمس دقائق وvortexed العينات كل 30 ثانية.
- إنهاء عملية الهضم بواسطة الطرد المركزي للعينة لمدة 15 ثانية في 5000 XG عند 4 درجة مئوية لإزالة البيبسين.
- تجميد بسرعة في عينات السائل N 2 وتخزينها في -80 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن 2قبل MALDI - TOF تحليل أيام.
- مصفوفة لMALDI هو 5 ملغ / مل من α - cyano - 4 - hydroxycinnamic حمض (CHCA) الذائب في محلول (01:01:01) من الإيثانول ، وأسيتونتريل TFA 0.1 ٪ عند pH 2.5 والذي عقد في 0 درجة مئوية.
- تحسن جزئيا كل عينة بسرعة ومزيج 1 ميكرولتر من كل عينة مع 1 ميكرولتر من المصفوفة والبقعة على 4 درجات مئوية لوحة الهدف MALDI.
- تطبيق فراغ معتدلة الى لوحة لتجفيف بقع في 30 ثانية قبل MALDI - TOF التحليل. الوقت بين ذوبان العينة واسترجاع الطيف حوالي 3 دقائق.
- اكتساب - TOF MALDI أطياف الشامل مع النظم البيولوجية STR PerSeptive DE فوياجر. الحصول على البيانات بمعدل أخذ العينات 2 غيغاهيرتز في قنوات البيانات 100000 ، مع الجهد 20000 - V المتسارع ، والجهد الشبكة 65 ٪ باستخدام تأخر استخراج مع تأخير النبض 180 نانوثانية. وبلغ متوسط مائة بمسح في 2 دقيقة. لا يقتصر هذا الصك MALDI - TOF إلى أي علامة تجارية أو أي برنامج معين.
- استخدام الكمبيوتر البيانات إكسبلورر 4.0 برنامج لcalculتناولوا معالجة بالديوتريوم كل جزء.
- احتساب الصرف مرة أخرى على أساس نسبة من العدد الفعلي دوتيرون أدرجت في 24 ساعة من H / D تبادل مقسوما على جميع المواقع المحتملة للتبديل ، والتي هي العمود الفقري الأميدات باستثناء أميد N - محطة (الشكل 1).
4. ممثل النتائج :
يتم التحقق من الانقسام وcaspase autophosphorylation بواسطة تلطيخ Commassie SDS - PAGE. Pak2 الخاملة هي فرقة واحدة من 58 كيلو دالتون. Caspase تشطر من Pak2 كاملة ، وينتج اثنين الشظايا ، p34 P27 والتي تهاجر بشكل منفصل. هجرة يبين P27 وp34 autophosphorylated تداخل على هلام بسبب الهجرة من المتخلفين جزء فسفرته P27 بالكامل (الشكل 2).
وتنفذ H / D تبادل التجارب خارج عدة مرات بين 0 و 10 دقيقة (الشكل 3). كمثال على ذلك ، فإن دوام التأسيس الديوتيريوم في م / ZPوتتألف من eak 1697.85 Pak2 نشط من النظائر قمم متعددة كما هو مبين في التحول من المغلف الشامل مع مرور الوقت.
الشكل 1. المعادلات لحساب معالجة بالديوتريوم.
الشكل 2. Autophosphorylation والانقسام caspase من Pak2. وقد تم تحليل كاسباس المشقوق Pak2 (حارة اليسار) ، Pak2 نشط سليمة (وسط حارة) وكاسباس المشقوق Pak2 autophosphorylated (حارة اليمين) بواسطة SDS - PAGE وCoommassie تلطيخ زرقاء. مقتبس من هسو ، وآخرون YH 2.
الشكل 3. الطيف كتلة من دورة الوقت التأسيس لالديوتيريوم Pak2 الخاملة. تعرض Pak2 الخاملة إلى H / D exchaنجى ل00-10 دقيقة وتحليلها بواسطة MALDI - TOF. ويرد مثال على توزيع النظائر الموسع - TOF MALDI ذروة م / ض 1697.85 خلال وقت H / D الصرف. الخط الأحمر المنقط يشير متوسط المغلف الشامل والتحول من المغلف الشامل يبين معالجة بالديوتريوم من الببتيد.
Discussion
التعرف على أجزاء البيبسين - إستفتاء هو خطوة حاسمة لتبادل التجربة H / D. ويمكن تحديد صحيح لالببتيد تؤدي إلى استنتاج خاطئ. هو eluted Pak2 البيبسين هضم من خلال عمود المرحلة HPLC عكس C18 للحصول على خلفية نظيفة. في تجاربنا ، تم جمع ما مجموعه 40 وتعرض لكسور MALDI - TOF. ويمكن تحديد الببتيد متعددة في كل من الكسور. تعرضت الببتيدات إلى جنب الطيف الكتلي (Q - TOF MS / MS وoMALDI MS / MS) لتحديد تسلسل الخاصة بهم. ينبغي للأطياف MS / MS من الببتيد والأيونات المنتج لا يقل عن ثلاثة لتأكيد هوية من الببتيد.
بيانات الكمبيوتر 4.0 مستكشف البرنامج (النظم البيولوجية التطبيقية) بتنفيذ تصحيح الأساس الأولي وترشيح الضوضاء. ويجب معايرة كل الطيف استنادا الى اثنين من قمم متتالية. نحن لدينا من قبل طيف ومعايرة الكتلة النظري للundeuterated م / ض والتي هي 923.45 1697.84. Tيستطيع دقة الشامل بعد معايرة تصل الى 10 جزءا في المليون. عند معالجة بالديوتريوم ، قد أحادي النظائر التحول إلى أعلى الشامل. حققت زيادات خطوة وحدوية لهذه النسب م / ض الجماهير تعزيز المرتبطة معالجة بالديوتريوم. فإن شدة ذروة المغلف الشامل لا تؤثر على مستوى معالجة بالديوتريوم. ومع ذلك ، فإن شدة ذروة الذرى النظائر في ظرف معين كتلة حرجة لحساب كتلة المتوسط. الخطوة الأولى من حساب دوتيرون أدرجت هو طرح كتلة الببتيد من العينة غير deuterated من العينة deuterated. وهناك ثلاثة عوامل أخرى ، في تخفيف D O 2 ، deuterons المتبقية في السلاسل الجانبية وتبادل الظهر ، الحاجة إلى مزيد من النظر في حساب (الشكل 1). التخفيف D O 2 هو عامل إضعاف D 2 O بعد خلط العينة وD O 2 العازلة للشروع في تبادل H / D. ودوتيرون المتبقية (4.5 ٪) في سلاسل جانب البيبسين هضمالببتيدات إد يجب أن يكون مطروح. الجزء الخلفي لتبادل هو خسارة حتمية لمعالجة بالديوتريوم في جميع الببتيدات deuterated وهضم الببسين في كتلة عملية القياس.
ومعظم المذيبات الببتيد الوصول (م / ض = 1105.60) بعد ساعة من H - 24 / D تبادل يمثل معالجة بالديوتريوم المنطقة بالكامل. عدد دوتيرون أدرجت لكل من الببتيدات هو الفرق بين النقطه الوسطى من الببتيدات Pak2 deuterated الهضمية وغير deuterated. تم اختيار معظم الببتيد deuterated جدا م / ض 1105 لتمثيل معالجة بالديوتريوم كامل عندما كان في Pak2 24 ساعة من H / D الصرف. تم احتساب نسبة صرف عودة من العدد الفعلي دوتيرون أدرجت في 24 ساعة من H / D تبادل مقسوما على جميع المواقع المحتملة للصرف في الببتيد م / ض 1105.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ويدعم هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة منح GM - 26738 (لجات).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D2O | Aldrich | 7789-20-0 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma-Aldrich | 28166-41-8 | |
| MALDI-TOF | PE Biosystems | Voyager DE STR | |
| Q-TOF mass spectrometer | Q-TOF Ultima-Global | ||
| QSTAR XL oMALDI MS/MS | Applied Biosystems | ||
| Data Explorer 4.0 computer program | Applied Biosystems |
References
- Anand, G. S., Hughes, C. A., Jones, J. M., Taylor, S. S., Komives, E. A. Amide H/2H exchange reveals communication between the cAMP and catalytic subunit-binding sites in the R(I)alpha subunit of protein kinase. A. J. Mol. Biol. 323, 377-386 (2002).
- Hsu, Y. H., Johnson, D. A., Traugh, J. A. Analysis of conformational changes during activation of protein kinase Pak2 by amide hydrogen/deuterium exchange. J. Biol. Chem. 283, 36397-36405 (2008).
- Englander, S. W., Kallenbach, N. R. Hydrogen exchange and structural dynamics of proteins and nucleic acids. Q. Rev. Biophys. 16, 521-655 (1983).
- Katta, V., Chait, B. T. Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Commun. Mass. Spectrom. 5, 214-217 (1991).
- Dennis, E. A. Localizing the membrane binding region of Group VIA Ca2+-independent phospholipase A2 using peptide amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. J. Biol. Chem. 284, 23652-23661 (2009).
- Hsu, Y. H. Calcium binding rigidifies the C2 domain and the intradomain interaction of GIVA phospholipase A2 as revealed by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. J. Biol. Chem. 283, 9820-9827 (2008).
- Lee, N. Activation of hPAK65 by caspase cleavage induces some of the morphological and biochemical changes of apoptosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 13642-13647 (1997).
- Rudel, T., Bokoch, G. M. Membrane and morphological changes in apoptotic cells regulated by caspase-mediated activation of PAK2. Science. 276, 1571-1574 (1997).
- Roig, J., Traugh, J. A. Cytostatic p21 G protein-activated protein kinase gamma-PAK. Vitam. Horm. 62, 167-198 (2001).
- Walter, B. N. Cleavage and activation of p21-activated protein kinase gamma-PAK by CPP32 (caspase 3). Effects of autophosphorylation on activity. J. Biol. Chem. 273, 28733-28739 (1998).
- Clauser, K. R., Baker, P., Burlingame, A. L. Role of accurate mass measurement (+/- 10 ppm) in protein identification strategies employing MS or MS/MS and database searching. Anal. Chem. 71, 2871-2882 (1999).
