Summary
MALDI-TOF spectrométrie de masse a été utilisé avec succès pour contrôler l'amide d'hydrogène / deutérium de change dans la protéine kinase PAK2 activation.
Abstract
Amide hydrogène / deutérium échange (échange H / D) couplée à la spectrométrie de masse a été largement utilisée pour analyser l'interface des interactions protéine-protéine, protéine de conformation change, la dynamique des protéines et des interactions protéine-ligand. Échange H / D sur les positions amide épine dorsale a été utilisé pour mesurer le taux de deutération des micro-régions dans une protéine par spectrométrie de masse 1,2,3. La résolution de cette méthode dépend de digestion par la pepsine de la protéine deutérée d'intérêt en peptides qui varient normalement de 3 à 20 résidus. Bien que la résolution de l'échange H / D mesurée par spectrométrie de masse est inférieure à la résolution seul résidu mesuré par le simple hétéronucléaire cohérence quantique (HSQC) méthode de RMN, la spectrométrie de masse en mesure échange H / D n'est pas limité par la taille de la protéines 4. Échange H / D est réalisé dans une solution aqueuse qui maintient la conformation des protéines. Nous fournissons une méthode qui utilIZES l'MALDI-TOF pour la détection de deux, au lieu d'un système HPLC / ESI (ionisation par électrospray)-MS 5,6. Le MALDI-TOF fournit des données précises sur l'intensité de masse pour les peptides de la protéine digérée, dans ce cas la protéine kinase PAK2 (aussi appelée γ-Pak). Protéolyse de Pak 2 est réalisée en une digestion par la pepsine déconnecté. Cette méthode alternative, lorsque l'utilisateur n'a pas accès à une colonne de CLHP et la pepsine connecté à la spectrométrie de masse, ou lorsque la colonne de pepsine sur HPLC ne résulte pas en une carte de digestion optimale, par exemple, le disulfure fortement lié phospholipase A 2 sécrétée (SPLA 2). Utilisant cette méthode, nous avons réussi à surveiller l'évolution du niveau lors de l'activation de la deutération PAK2 par la caspase 3 clivage et l'autophosphorylation 7,8,9.
Protocol
1. PAK2 activation
- Ajouter la pré-testés appropriée le montant de la caspase 3 à 20 ul de 12 mg / ml dans le tampon A PAK2 et (50 mM DTT mM Tris-HCl, 150 mM de NaCl, et 2 à pH 7,5) incuber à 34 ° C pendant 30 min pleinement cliver et activer PAK2.
- Analyser les produits de clivage par SDS-PAGE (10%) et Coommassie coloration au bleu.
- Ajouter le PAK2 clivé pour l'activation de tampon B (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 15 mM MgCl2, 10 mM ATP) à pH 7,5, dans 20 ul d'une concentration finale de 10 mg / ml PAK2, et incuber à 34 ° C pendant 30 min pour activer complètement PAK2 par autophosphorylation sur 8 sites.
- Confirmer le clivage complet de PAK2 par la migration de l'p34 et p27 fragments tel que déterminé par SDS-PAGE 10. Vérification adéquate des conditions autophosphorylation se fait via autoradiographie dans une expérience séparée en utilisant (32 P) l'ATP ou la spectrométrie de masse pour détecter phosphopeptides.
2. Identificationde la pepsine à digérer PAK2 Fragments
- Ajouter 1 ml d'acide trifluoroacétique à 0,1% (TFA) à pH 2,5 à laver les billes d'agarose deux fois avant d'utiliser. Puis, centrifuger les échantillons pendant 15 s à 2000 xg pour éliminer les bourrelets.
- Ajouter PAK2 (20 pg dans 2 pi de NaCl 150 mM, DTT 50 mM Tris-HCl et 2 à pH 7,5) à 100 ul de 0,1% de TFA, et incuber l'échantillon pendant 5 min avec 30 ul de billes d'agarose pepsine conjugués .
- Equilibrer une HPLC en phase inverse C18 avec un système de solvant primaire de TFA 0,1% à pH 2,5. La digestion par la pepsine (50 pi) est élue en utilisant un linéaire de 100 min gradient de 0 - 80% d'acétonitrile contenant 0,1% de TFA à un débit de 0,2 ml / min. Les fractions sont collectées toutes les 2 min.
- Sécher les fractions HPLC avec un speed-vac (3 h) et remettre en suspension les échantillons dans une solution d'acétonitrile (5 pi) et de 0,1% de TFA (5 pi) à pH 2,5.
- Initialement, chaque fraction est projeté pour les peptides à l'aide du MALDI-TOF Voyager DE PerSeptive Biosystems STR (PE biosystems, Foster City, Californie, Etats-Unis).
- Les 16 fractions contenant les peptides sont soumis à une spectrométrie de masse en tandem en utilisant un spectromètre de masse Q-TOF et un QSTAR XL oMALDI MS / MS pour identifier les fragments.
- La séquence de chaque peptide est vérifiée par les ions produits générés par la spectrométrie de masse tandem avec l'théoriques m / z ratios basés sur la séquence primaire de PAK2 utilisant le site Web de protéines Prospector ( http://prospector.ucsf.edu/ ) 11.
3. Mesure de l'amide échange H / D
- Tenir toutes les solutions et les réactifs nécessaires pour échange H / D à 25 ° C dans un bain d'eau. L'ATP est dissous dans l'eau et le pH est ajusté à 7,0 avant utilisation. L'ATP 4 mM supplémentaires dans le tampon D 2 O est de prévenir l'ATP dissociée de PAK2 après dilution.
- Initier échange H / D par addition de 18 pl d'tamponné D 2 O (50 mM MOPS pH 6,98, 125 mM de NaCl) à 2 ul (20 pg) De PAK2 dans un tampon contenant 150 mM de NaCl, 50 mM DTT mM Tris-HCl (pH 7,5) et 2, résultant en un niveau PAK2 de 10 mg / ml et un pH de 7,0 à 0 ° C.
- Incuber les échantillons en trois exemplaires, l'échange H / D de 0, 0,5, 1, 3, 5 et 10 min, ou 24 h.
- Quench le processus échange H / D en ajoutant 180 pl d'glacée TFA 0,1% à pH 2,2, ce qui amène le pH à 2,5 dans un volume final de 200 pl. Pour les échantillons contenant de l'ATP, 180 pl d'glacée TFA 0,11% à pH 2,2 est utilisé pour maintenir le pH à 2,5 à l'état trempé.
- Ajouter une aliquote (100 pi) de chaque échantillon trempé à 30 ul de billes d'agarose activé la pepsine-conjugué. La digestion par la pepsine est autorisé à procéder sur la glace pendant cinq minutes et les échantillons sont vortexés toutes les 30 secondes.
- Mettre fin à la digestion par centrifugation de l'échantillon pendant 15 s à 5000 xg à 4 ° C pour éliminer la pepsine.
- Rapidement congeler les échantillons dans l'azote liquide 2 et conserver à -80 ° C pendant plus de 2jours avant analyse MALDI-TOF.
- La matrice pour MALDI est de 5 mg / ml d'α-cyano-4-hydroxycinnamique (ACSSD) dissous dans une solution (1:1:1) de l'acétonitrile, l'éthanol et 0,1% de TFA à pH 2,5 et maintenue à 0 ° C.
- Décongeler partiellement chaque échantillon rapidement et mélanger 1 ul de chaque échantillon avec 1 pl de matrice et place sur une plaque à 4 ° C cible MALDI.
- Appliquer un vide modéré à la plaque à sécher les taches en 30 secondes avant analyse MALDI-TOF. Le temps écoulé entre la décongélation de l'échantillon et extraction du spectre est d'environ 3 min.
- Acquérir des spectres de masse MALDI-TOF avec un STR PerSeptive Biosystems Voyager DE. Acquérir des données à un taux d'échantillonnage de 2 GHz à 100 000 canaux de données, avec une tension de 20.000 V accélération, et une tension de grille de 65% en utilisant l'extraction retardée avec un retard d'impulsion de 180 ns. Une centaine de scans sont en moyenne en 2 min. L'instrument MALDI-TOF n'est pas limité à n'importe quelle marque ou tout autre logiciel particulier.
- Utilisez le programme Data Explorer 4.0 à l'ordinateur Calculmangé la deutération de chaque fragment.
- Calculer l'échange de retour basée sur le ratio du nombre deutéron incorporé réel à 24 heures de échange H / D divisé par tous les sites possibles échangeables, qui sont les amides épine dorsale, sauf l'amide N-terminale (figure 1).
4. Les résultats représentatifs:
Le clivage des caspases et l'autophosphorylation sont vérifiées par SDS-PAGE coloration Commassie. PAK2 inactif est une seule bande de 58 kDa. Le clivage de la caspase PAK2 est complet, et produit deux fragments, p27 et p34 qui migrent séparément. La migration de p27 et p34 autophosphorylée montre un chevauchement sur le gel en raison de la migration de l'retardé totalement phosphorylés p27 fragment (Figure 2).
H / D des expériences de change sont effectuées plusieurs fois entre 0 et 10 min (figure 3). À titre d'exemple, le cours moment de l'incorporation de deutérium dans le m / zpEAK 1697.85 des PAK2 inactif est composé de plusieurs pics isotopiques comme le montre l'évolution de l'enveloppe de masse au cours du temps.
Figure 1. Équation pour le calcul de la deutération.
Figure 2. Autophosphorylation et le clivage des caspases d'PAK2. Caspase-clivé PAK2 (voie de gauche), intactes PAK2 inactifs (au milieu voies) et de la caspase-clivé PAK2 autophosphorylée (voie de droite) ont été analysés par SDS-PAGE et coloration au bleu de Coommassie. Adapté de Hsu, AJ et al 2.
Figure 3. Spectre de masse d'un cours moment de l'incorporation de deutérium pendant PAK2 inactif. PAK2 inactifs a été soumis à H / D ExchaESN pour les 0-10 min et analysés par MALDI-TOF. Un exemple de la distribution élargie isotopique de MALDI-TOF du pic m / z 1697,85 au cours du temps d'échange H / D est montrée. La ligne pointillée rouge indique la moyenne de l'enveloppe de masse et le déplacement de l'enveloppe de masse montre l'deutération d'un peptide.
Discussion
Identification de la pepsine fragments digérés est une étape critique de l'expérience échange H / D. Identification incorrecte du peptide peut conduire à une conclusion erronée. PAK2 pepsine-digérée est éluée à travers une colonne HPLC phase inverse C18 pour obtenir un fond propre. Dans nos expériences, un total de 40 fractions ont été recueillies et soumises à MALDI-TOF. Peptides multiples pourraient être identifiés dans chacune des fractions. Les peptides ont été soumis à la spectrométrie de masse (Q-TOF MS / MS et oMALDI MS / MS) pour identifier leurs séquences. Les spectres MS / MS d'un peptide devrait avoir au moins trois ions de produit pour confirmer l'identification du peptide.
Le programme Data Explorer 4.0 ordinateur (Applied Biosystems) effectue la correction de base initial et la filtration du bruit. Chaque spectre doit être étalonné sur deux pics séquencé. Nous calibrer notre spectre par la masse théorique de l'undeuterated m / z qui sont 923,45 et 1697,84. TIl précision de la masse après l'étalonnage peut atteindre 10 ppm. Après deutération, les mono-isotopique peut passer à un supérieur de masse. Augmentations d'échelon unitaire de ces rapports m / z donné les masses améliorée associée à deutération. Les intensités maximales de l'enveloppe de masse ne sera pas affecter le niveau de deutération. Toutefois, les intensités des pics des pics isotopiques dans une enveloppe de masse sont particulièrement critiques pour le calcul de la masse moyenne. La première étape du calcul de la deutéron est incorporé soustrayant la masse peptidique de l'échantillon des non-deutérés de l'échantillon deutérié. Trois autres facteurs, la D 2 O de dilution, les deutons résiduelle dans les chaînes latérales et l'échange dos, devra être examiné plus avant dans le calcul (figure 1). La dilution de D 2 O est le facteur de dilution de D 2 O après le mélange de l'échantillon et D 2 O buffer pour initier l'échange H / D. Le deuton résiduelle (4,5%) dans les chaînes latérales de la pepsine digérerpeptides éd doit être soustraite. L'arrière-échange est la perte inévitable de deutération dans tous les peptides deutérés et la pepsine-digérés dans le processus de mesure de masse.
Le peptide le plus accessible au solvant (m / z = 1105,60) après 24 heures d'échange H / D représente une région pleine de deutération. Le nombre deutéron constituée pour chacun des peptides est la différence entre le centroïde des peptides deutérés et non deutérés peptique PAK2. Le plus hautement deutéré peptide m / z 1105 a été choisie pour représenter deutération plein quand PAK2 était à 24 heures de échange H / D. Le ratio d'échange Retour a été calculé par le nombre deutéron incorporé réel à 24 heures de échange H / D divisé par tous les sites possibles échangeables à peptide m / z 1105.
Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Ce travail est soutenu en partie par le National Institutes of Health Grant GM-26738 (à la JAT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D2O | Aldrich | 7789-20-0 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma-Aldrich | 28166-41-8 | |
| MALDI-TOF | PE Biosystems | Voyager DE STR | |
| Q-TOF mass spectrometer | Q-TOF Ultima-Global | ||
| QSTAR XL oMALDI MS/MS | Applied Biosystems | ||
| Data Explorer 4.0 computer program | Applied Biosystems |
References
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