Summary
MALDI-TOF kütle spektrometresi başarıyla protein kinaz Pak2 aktivasyon amid hidrojen / döteryum değişimini izlemek için kullanılmıştır.
Abstract
Kütle spektrometresi ile birlikte Amid hidrojen / döteryum değişimi (Y / D değişimi), yaygın olarak,, protein-protein etkileşimleri, protein konformasyonel değişiklikler, protein dinamiği ve protein-ligand etkileşimleri arayüz analiz etmek için kullanılır olmuştur. H / D değişimi omurga amid pozisyonları, kütle spektrometresi 1,2,3, bir protein mikro-bölgeler dötertumlanma oranlarını ölçmek için kullanılmıştır. Bu yöntemin çözünürlük normalde 3-20 artıkları aralığı peptidler ilgi döteryumlanmış protein pepsin sindirim bağlıdır. Çözünürlük kütle spektrometresi ile ölçülen H / D değişimi NMR, kütle spektrometresi H / D değişim ölçüm farkı çekirdekli Tek Kuantum Tutarlılık (HSQC) yöntemi ile ölçülen tek kalıntı çözünürlüğü daha düşük olmasına rağmen boyutu ile sınırlı değildir protein 4. H / D değişimi protein konformasyonu korur sulu bir çözelti içinde yürütülmektedir. Biz bir yöntem sağlamak olduğunu utilHPLC / ESI (elektrosprey iyonizasyon)-MS sistemi 5,6 yerine 2 için algılama MALDI-TOF, izes. MALDI-TOF bu durumda protein kinaz Pak2 (γ-Pak da denir), sindirilmiş protein peptidler için doğru kütle yoğunluğu verileri sağlar. Pak 2 Proteoliz bir çevrimdışı pepsinin sindirim gerçekleştirilir. Kullanıcı erişim, kütle spektrometresi bağlı bir HPLC ve pepsin sütun veya HPLC pepsin sütununda, örneğin ağır disülfit gümrüklü salgılanan Fosfolipaz A 2, optimal bir sindirim harita sonucu değildir bulunmamış Bu alternatif bir yöntem, (SPLA 2). Bu yöntemi kullanarak, başarılı kaspaz 3 bölünme ve otofosforilasyon 7,8,9 Pak2 aktivasyonu sırasında dötertumlanma düzeyinde değişiklikler izlenir.
Protocol
1. Pak2 Etkinleştirme
- 12 mg / ml Pak2 'lik 20 ul tampon kaspaz 3 uygun önceden test edilmiş bir miktar ekleyin (pH 7.5, 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl ve 2 mM DTT) ve 34 inkübe ° C 30 dakika tam tutunmaya ve etkinleştirmek Pak2.
- SDS-PAGE (% 10) ve Coommassie mavi boyama parçalanma ürünleri analiz edin.
- 20 ul 10 mg / ml Pak2 'lik bir nihai konsantrasyonu, pH 7.5 (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 15 mM MgCl 2, 10 mM ATP) aktivasyon tampon B bölünmüş Pak2 ekleyin ve 34 inkübe ° C'de 30 dakika süreyle tam 8 siteleri otofosforilasyon tarafından Pak2 etkinleştirmek için.
- SDS-PAGE 10 tarafından belirlenen P34 ve p27 parçaları göç Pak2 tam bölünme onaylayın. Otofosforilasyon koşullarının uygun doğrulama phosphopeptides tespit etmek (32 P) ATP veya kütle spektrometresi kullanarak ayrı bir deney otoradyografi yoluyla yapılır.
2. KimlikPak2, Pepsin-özet Fragments
- Önce agaroz boncuk kullanımı için iki kez yıkamak için pH 2.5% 0.1 Trifluroacetic Asit (TFA) 1 ml ekleyin. Sonra, boncuk kaldırmak için 15 sn 2.000 xg'de örnekleri santrifüj.
- % 0.1 TFA 100 ul Pak2 (150 mM NaCl 2 ul içinde 20 mg, pH 7.5, 50 mM Tris-HCl ve 2 mM DTT) ekleyin ve 5 dakika boyunca örnek pepsinojenin konjuge agaroz boncuk 30 ul inkübe .
- PH 2.5,% 0.1 TFA birincil bir çözücü sistemi ile ters faz HPLC C18 kolon dengelenmesi. 0.2 ml / dak akış hızında% 80% 0.1 TFA içeren asetonitril - pepsin sindirimi (50 ul) 0 100 dk doğrusal bir degrade kullanarak kolonda sürüklenecektir. Kesirler her 2 dakikada toplanır.
- (3 saat) hızlı elektrikli süpürge ile HPLC kesirler Kuru ve asetonitril (5 ul) ve pH 2.5,% 0.1 TFA (5 ul) bir çözüm örnekleri tekrar süspansiyon haline getirin.
- Başlangıçta, her fraksiyon peptidler için MALDI-TOF PerSeptive Biyosistem Voyager DE STR (PE Bi kullanarak gösterildi.osystems, Foster City, CA, USA).
- Peptidler içeren 16 fraksiyonları tandem kütle spektrometresi parçaları belirlemek için Q-TOF kütle spektrometresi ve bir QSTAR XL oMALDI MS / MS kullanarak tabi tutulur.
- Her peptid dizisi Protein Prospector web sitesi (kullanarak Pak2 birincil dizisi dayalı teorik m / z oranları ile tandem kütle spektrometresi tarafından üretilen ürün iyonları tarafından doğrulanmadı http://prospector.ucsf.edu/ ) 11.
3. Amid H / D Exchange ölçümü
- 25 H / D değişimi için gerekli tüm çözümler ve reaktifler ° C su banyosunda tutun. ATP suda çözülür ve pH kullanmadan önce 7.0 'ye ayarlanır. D 2 O tampon ek 4mm ATP seyreltme sonra Pak2 ayrı ATP önlemek için.
- (20 mg 2 ul ile 18 ul tamponlu D 2 O (50 mM MOPS pH 6.98, 125 mM NaCl) eklenmesi ile H / D değişimi başlatın), 150 mM içeren bir tampon olarak Pak2 NaCl, 0 ile 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) ve 2 mM Pak2 seviyesi 10 mg / ml 'lik bir DTT ve pH 7.0 ° C
- H / D karşılığında üç nüsha olarak 0, 0.5, 1, 3, 5 ve 10 dakika ya da 24 saat için numunelerin inkübe
- H / D değişim süreci, pH 2.2, 200 ul nihai hacmi 2.5 pH getiriyor buz% 0.1 TFA 180 ul ekleyerek Quench. ATP, pH 2.2 buz 0.11% TFA 180 ul içeren numuneler için 2,5 pH söndürülür durumu korumak için kullanılır.
- 30 ul aktif pepsinojenin-konjuge agaroz boncuk her söndürülür örnek bir kısım (100 ul) ekleyin. Pepsin sindirim beş dakika süreyle buz üzerinde devam etmesine izin verilir ve örnekleri her 30 saniyede bir vortekslenmiş.
- 4 5.000 xg'de 15 sn için örnek santrifüj sindirim Terminate ° C pepsin kaldırmak için.
- Hızla en fazla 2, -80 ° C'de sıvı N 2 ve mağaza örnekleri dondurmakMALDI-TOF analizi önceki gün.
- MALDI için matris 5 mg / ml α-cyano-4-hydroxycinnamic asetonitril, etanol ve% 0.1 pH 2.5 TFA bir çözüm (01:01:01) çözülür ve 0 ° C'de yapılan asit (CHCA)
- Kısmen hızlı bir şekilde her bir örnek Çözülme ve her numunenin 1 ul ul 4 ° C MALDI hedef plakası matris ve spot 1 ile karıştırın.
- MALDI-TOF analizi için 30 sn önce lekeler kuru plaka ılımlı bir vakum uygulayın. Örnek ve spektrum alma çözülme arasındaki süre yaklaşık 3 dk.
- PerSeptive Biyosistem Voyager DE STR MALDI-TOF kütle spektrumları edinin. 20.000-V hızlandırma voltaj ve% 65 şebeke voltajı 180 ns darbe gecikme ile gecikmeli çıkarma kullanarak, 100.000 veri kanalları az 2 GHz örnekleme hızında veri edinin. 2 dakika içinde yüz taramaları ortalaması alınır. MALDI-TOF cihazı herhangi bir marka ya da herhangi bir özel yazılım ile sınırlı değildir.
- Calcul için Data Explorer 4.0 bilgisayar programı kullanınher parçasının dötertumlanma yedik.
- Arka döviz omurga amidler N-terminal amid (Şekil 1) hariç tüm olası değiştirilebilir siteleri, bölünmüş H / D değişimi 24 saat gerçek dahil deuteron sayısı oranına göre hesaplayın.
4. Temsilcisi Sonuçlar:
Kaspaz bölünme ve otofosforilasyon SDS-PAGE Commassie boyama ile doğrulanır. İnaktif Pak2 58 kDa tek bir bant. Pak2, kaspaz bölünme tamamlandığında, ve ayrıca göç, p27 ve P34 iki parça üretir. Autophosphorylated p27 ve P34, tam fosforile p27 parçası (Şekil 2) geriliği göç nedeniyle jel bir örtüşme gösterir göç .
H / D döviz deneyler, 0 ile 10 dakika (Şekil 3) arasında birden çok kez yapılmaktadır . Bir örnek olarak, m / zp içine döteryum esas zamanlı kursinaktif Pak2 EAK 1697,85 zamanla kitlesel zarfın vardiya tarafından gösterildiği gibi birden fazla izotop zirvelerinden oluşmaktadır.
Şekil 1 dötertumlanma hesaplanması için denklemi.
Şekil 2 otofosforilasyon ve Pak2 kaspaz bölünme. Kaspaz-cleaved Pak2 (sol şerit), bozulmamış inaktif Pak2 (orta şerit) ve kaspaz-cleaved autophosphorylated Pak2 (sağ şeritte), SDS-PAGE ve Coommassie mavi boyama ile analiz edildi. Hsu, YH ve ark 2 'den uyarlanmıştır.
Şekil 3, inaktif Pak2 döteryum esas bir zaman dersin Mass Spektrum . İnaktif Pak2 H / D excha maruz kaldı0-10 dakika nge ve MALDI-TOF ile analiz. H / D değiş zaman seyri sırasında tepe m / z 1697,85 MALDI-TOF genişletilmiş izotop dağılımı bir örnek gösterilmiştir. Kırmızı noktalı çizgi, kitle zarfın ortalama kitle zarfın kayma gösterir ve bir peptid dötertumlanma gösterir.
Discussion
Pepsin özet Fragments Kimlik H / D değişim deney kritik bir adımdır. Peptid yanlış kimlik yanlış bir sonuca yol açabilir. Pepsin-sindirilmiş Pak2 temiz bir arka plan elde etmek için ters faz HPLC C18 kolon ile yıkandı,. Deneylerde, toplam 40 kesirler bir toplandı ve MALDI-TOF tabi. Çoklu peptidler kesirler her tespit olabilir. Peptidler dizileri tanımlamak için tandem kütle spektrometresi (Q-TOF MS / MS ve oMALDI MS / MS) tabi tutuldu. Bir peptit MS / MS spektrumları peptid kimlik doğrulamak için en az üç ürün iyonları olmalıdır.
Data Explorer 4.0 bilgisayar programı (Uygulamalı Biyosistem) ilk temel düzeltme ve gürültü filtreleme yapar. Her spektrumu iki sıralı tepeleri üzerinde göre kalibre edilmelidir. 923,45 ve 1697,84 undeuterated m / z ile teorik kütle spektrumu kalibre edin. To kitle doğruluğu kalibrasyon sonra 10 sayfaya ulaşabilirsiniz. Dötertumlanma üzerine, mono-izotop daha yüksek bir kitle kayabilir. Üniter adım bu m / z oranları artar dötertumlanma ile ilişkili gelişmiş kitlelerin vermiştir. Kitle zarfın pik şiddetleri dötertumlanma düzeyini etkilemez. Ancak, belirli bir kitle zarf içinde izotopik zirvelerinden pik şiddetleri ortalama kütlesinin hesaplanması için kritik öneme sahiptir. Dahil deuteron hesaplama ilk adım döteryumlanmış örneği olmayan döteryumlanmış bir örnek peptid kütle çıkartmaktır. Diğer üç faktör, D 2 O seyreltme, yan zincirleri ve arka döviz kalan deuterons, daha fazla (Şekil 1) hesaplanmasında dikkate alınması gerekir. D 2 O seyreltme sonra D 2 O örnek karıştırma ve D 2 O tampon H / D değişimi başlatmak için seyreltme faktörü. Pepsin-digest yan zincirleri artık deuteron (% 4.5)ed peptidler çıkarılır gerekir. Arka değişim kitle ölçüm sürecinin tüm döteryumlanmış ve pepsin-sindirilmiş peptidler dötertumlanma kaçınılmaz kaybı.
H / D değişimi 24 saat sonra en solvent erişilebilir peptid (m / z = 1105,60) tam bir dötertumlanma bölgede temsil eder. Peptidlerin her biri için dahil deuteron sayısı, döteryumlanmış ve non-döteryumlanmış Pak2 peptik peptidlerin ağırlık merkezi arasındaki farktır. En çok döteryumlanmış peptid m / z 1105 Pak2 H / D değişimi 24 saat iken dötertumlanma temsil etmek üzere seçildi. Geri Alım Satım Oranı peptid m / z 1105 tüm olası değiştirilebilir siteleri tarafından bölünmüş H / D değişimi 24 saat gerçek dahil deuteron sayısına göre hesaplandı.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Hibe GM-26.738 Enstitüleri (JAT) kısmen desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D2O | Aldrich | 7789-20-0 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma-Aldrich | 28166-41-8 | |
| MALDI-TOF | PE Biosystems | Voyager DE STR | |
| Q-TOF mass spectrometer | Q-TOF Ultima-Global | ||
| QSTAR XL oMALDI MS/MS | Applied Biosystems | ||
| Data Explorer 4.0 computer program | Applied Biosystems |
References
- Anand, G. S., Hughes, C. A., Jones, J. M., Taylor, S. S., Komives, E. A. Amide H/2H exchange reveals communication between the cAMP and catalytic subunit-binding sites in the R(I)alpha subunit of protein kinase. A. J. Mol. Biol. 323, 377-386 (2002).
- Hsu, Y. H., Johnson, D. A., Traugh, J. A. Analysis of conformational changes during activation of protein kinase Pak2 by amide hydrogen/deuterium exchange. J. Biol. Chem. 283, 36397-36405 (2008).
- Englander, S. W., Kallenbach, N. R. Hydrogen exchange and structural dynamics of proteins and nucleic acids. Q. Rev. Biophys. 16, 521-655 (1983).
- Katta, V., Chait, B. T. Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Commun. Mass. Spectrom. 5, 214-217 (1991).
- Dennis, E. A. Localizing the membrane binding region of Group VIA Ca2+-independent phospholipase A2 using peptide amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. J. Biol. Chem. 284, 23652-23661 (2009).
- Hsu, Y. H. Calcium binding rigidifies the C2 domain and the intradomain interaction of GIVA phospholipase A2 as revealed by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. J. Biol. Chem. 283, 9820-9827 (2008).
- Lee, N. Activation of hPAK65 by caspase cleavage induces some of the morphological and biochemical changes of apoptosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 13642-13647 (1997).
- Rudel, T., Bokoch, G. M. Membrane and morphological changes in apoptotic cells regulated by caspase-mediated activation of PAK2. Science. 276, 1571-1574 (1997).
- Roig, J., Traugh, J. A. Cytostatic p21 G protein-activated protein kinase gamma-PAK. Vitam. Horm. 62, 167-198 (2001).
- Walter, B. N. Cleavage and activation of p21-activated protein kinase gamma-PAK by CPP32 (caspase 3). Effects of autophosphorylation on activity. J. Biol. Chem. 273, 28733-28739 (1998).
- Clauser, K. R., Baker, P., Burlingame, A. L. Role of accurate mass measurement (+/- 10 ppm) in protein identification strategies employing MS or MS/MS and database searching. Anal. Chem. 71, 2871-2882 (1999).
