Summary
の手順では、微細な磁気共鳴エラストグラフィ（μMRE）を使用して機械的特性の非侵襲的局所評価を通して脂肪と骨組織設計構造物の設計された結果を監視するための磁気共鳴エラストグラフィの方法論を示しています。
Abstract
従来の機械的試験は、しばしば、サンプルの破壊、その結果、長期的組織設計構造の研究の場合には、破壊的なアセスメントの使用は認められません。提案された代替手段は、磁気共鳴エラストグラフィと呼ばれるイメージングプロセスを使用することである。エラストグラフィは、組織の構造と機能を識別するための不可欠なマーカーである地元の機械的特性値（すなわち、複雑なせん断弾性係数）を測定することによって設計された結果を決定するための非破壊法である。評価のための非侵襲的な手段として、磁気共鳴画像法（MRI）など画像診断法と人工構造物のモニタリングは、過去10年間1への関心の高まりを見ている。例えば、拡散とrelaxometryの磁気共鳴（MR）技術は、人工組織の開発2の間の化学的及び物理的性質の変化を特徴づけることができました。で提案する方法次のプロトコルは、小さな軟部組織3の機械的特性を測定するための非侵襲性のMRベースの手法として、微細な磁気共鳴エラストグラフィ（μMRE）を使用します。 MREは、関心のある組織と超音波の機械的アクチュエータを結合し、MRスキャナ4とせん断波の伝播を記録することによって達成されます。最近、μMREは伝統的に破壊的な機械的な巨視的な技術5を使用して測定される本質的な成長の情報を取得する組織工学に応用されている。次の手順では、エラストグラフィは機械アクチュエータと相まって修正ハーンスピンエコーシーケンスで設計された構造体のイメージングによって達成される。図1に示すように、修飾された配列は、外部せん断波の送信で画像取得を同期させます。その後、動きが振動バイポーラのペアを使用することにより感作されています。正と負の運動感作とのイメージのコレクションを次のる、せん断波の画像を生成するデータの複雑な分裂。そして、画像はせん断剛性マップ6を生成するために反転アルゴリズムを用いて評価されています。各ボクセルにおける結果の測定値は、データが動的機械分析7を使用して収集して（R 2> 0.9914）強く相関することが示されています。本研究では、エラストグラフィは、図2に示すように、脂肪細胞と骨の構造にヒト間葉系幹細胞（H MSC）の分化を監視するための組織の開発プロセスに統合されています。
Protocol
1。組織構築の準備
細胞集団の拡大、生体材料足場に細胞を播種し、化学シグナル伝達分子の使用による差別化：準備プロセスを構築する組織は、次の3つの主要ステージで構成されています。コンストラクトを調製するための手順は。Hong ら 、デニスらが行った方法に基づいており、マリオンと毛沢東8,9,10されています。
- 文化とセルラインの拡大、種子骨と3×10 6細胞/ mlの1×10 6細胞/ mlの密度でゼラチンスポンジの上にヒト間葉系幹細胞（MSCsのH）（直径4 mm、3.5 mm厚）の後脂肪形成。
- 脂肪にHのMSCの分化、細胞増殖培地に、0.5μMイソブチル-メチルキサンチン、10μg/ mlのヒト組換えインスリン、および200μMのインドメタシンを1μMのデキサメタゾンからなる脂肪誘導培地を適用する一度細胞が足場上でコンフルエントに表示されます。三日後、その後誘導培地に戻り、24時間の拡張メディアのヒト組換えインスリンの10μg/ mlのでメディアを交換してください。サイクルを3回繰り返し、その後の各2日間の保守メディアでのみ交換します。
- 骨形成を誘導するために、0.1μMのデキサメタゾン、L-アスコルビン酸2phosphateの50μM、および細胞増殖培地中の10mMβ-グリセロリン酸の最終濃度にすることによって骨形成誘導培地を準備します。新鮮な骨メディアごとに二日で置き換えます。
2。アクチュエータの特性評価
アクチュエータの特性は、MRE実験のために不可欠なステップです。 MREは、機械的性質のローカル値を評価するために、機械的せん断波の伝播に依存しているため、これらの機械的振動は、圧電アクチュエータを使用して目的の組織内で生成され、特徴付けする必要があります。図示したエクサ特性評価プロセスのmpleは、図3に示されています。この手順の目的は、有意な振幅（〜250ミクロン）で無害な横波を生成するために、アクチュエータの動きを最適化することである。
- 実験に先立ち、10 mmの試験管にコンストラクトを囲むように0.5％アガロースゲルを適用します。ゲルの温度は、構造へのダメージを最小限に抑えるために約37°Cなければなりません。
- アガロースゲル5分室温に設定することができた後、ゲルの表面に圧電曲げモータの先端を挿入します。
- リジッドサポートにサンプルとアクチュエータを含むチューブを取り付け、東洋機械的なアクチュエータの先端に向かってレーザードップラー振動計のビーム。必要に応じて反射信号を最適化するためのシステムの位置を調整し、反射テープを使用しています。
- 機械的なアクチュエータの期待共振周波数に基づいて、dを掃引するように、ファンクション·ジェネレータを設定するホワイトノイズ信号を20 Vppの動作電圧を使用してesired周波数範囲（すなわち、この実験では20から2000 Hz）です。
- システムの共振周波数を識別し、y軸として、FFTと速度にプログラムを設定するには、ポリテックVibrosoftプログラムに特徴スペクトルを表示します。
- 変位測定のために、200 Vppの動作電圧を使用して、示された共振周波数で連続的な正弦波を実現するアクチュエータを設定し、ゲルの表面に配信されて生成された変位に注意してください。 y軸として変位とFFTを表示するには、Vibrosoftを設定します。
3。画像収集
- アクチュエータの特性評価を完了した後、MRIスキャナの中央にあるサンプルとアクチュエータを配置します。組織構造実験のために、RF信号の送信および受信のために小さく、より高感度のRFコイル（この実験では、すなわち10ミリメートル）を使用します。 （図の手順では、9.4 Tを使用していますトリプル軸勾配を備えた垂直ボア磁石、100 G / cm）です。
- 構造物の位置を識別するためのスカウト画像を取得します。
- 取得のためのパラメータを設定します。 in vitroで矢状スキャンの典型的には1000ミリ秒、20〜40 msのエコー時間0.5〜1.0 mmのスライス厚と、128x128ピクセルのマトリクスサイズは12x10 mm 2の視野の繰り返し時間を持ちます。
- エラストグラフィのパラメータについては、レーザードップラー振動計の特性によって決定される値にアクチュエータの周波数を設定します。現在の研究では、1つのバイポーラのペアは、50 G / cmの勾配振幅が必要でした。調整する他のパラメータは最初の取得のための0ミリ秒に設定する必要があり、遅延が含まれています。
- バーストモードとサイクルの頻度と回数を含むエラスト取得パラメータに一致するようにファンクション·ジェネレータのパラメータを調整するようにファンクション·ジェネレータを変更します。また、funcを設定するる·ジェネレータは、外部トリガすることができます。
- サジタル像については、正のスライス方向になり、スキャンを開始するための運動感を設定します。買収後、画像を確認し、負のスライス方向に感作を変更します。
- せん断波の画像を生成するための複雑な除算を実行するMATLABプログラムを実行します。
- せん断波と、位相の折り返しを、可能な限り人工物の存在のイメージを評価します。
- 画像への調整が必要ない場合は、ゼロ秒から特徴づけ、共振周波数の全期間に至るまで8等間隔の値にパラメータ配列のサイズを調整します。
- 正と負の両方のスライス方向のスキャンを取得します。
- 画像が取得されると、画像の配列からせん断波データを生成するために設計され、MATLABプログラムを使用します。
4。 MRE実験画像処理
- 番目のMREのe最後のステップでは、せん断波画像からせん断剛性を計算することです。三次元データ（2の空間、1時間）を評価し、MATLABのプログラムにデータを置く。
注 ：平面せん断波、変位とそのラプラシアンの関数として複素数値のせん断弾性係数の推定を可能にする運動デカップリング方程式を仮定すること。アルゴリズムは、有限差分で空間2次微分を近似し、ピクセルごとにせん断弾性係数を計算します。このような複雑な番号から、多くの機械的なパラメータはこのようなせん断波速度、波の減衰、せん断剛性、せん断弾性、せん断粘度、等のような推論することができるアルゴリズムはまた、の平均値と標準偏差の関心領域を選択することができます各パラメータが計算されます。
- 撮像パラメータは、プログラムの先頭で指定する必要があります。さらに、目elastogramの電子上限は、試料のコントラストを最適化するように調整することができます。
注 ：プログラムは、ユーザーが回復の忠実さを見積もるため、中間結果を（ローパスフィルタ、方向性フィルタリング後の波形は、時間FFT、ラインプロファイル、などの後の波）を提供します。
- いくつかのパラメータは、関心のある特定の領域内のパラメータの標準偏差である運動の時間周波数、波の伝播方向、等など、低域通過フィルタのレベルとして、この情報に基づいて調整することができますまた、計算の品質の指標。
5。代表的な結果
骨と脂肪細胞構造の開発の4週間にわたって、図4ノートの機械的性質の変化を。 MREは730から820 Hzで行った。両方シードスポンジosteogeni、約3 kPaで始めながら、C向けの組織は、22 kPaの剛性をもたらし、脂肪組織の指示が1 kPaに剛性に減少し、一方。さらに、骨の構造は、研究の最初から最後まで比較して大きさの顕著な減少を示した。エラストグラフィの研究から派生した追加のプロパティを表1に示す。
図1磁気共鳴エラストグラフィのための画像取得プロセス。画像取得時に、パルスシーケンス（a）は（b）はMRIスキャナのバイポーラ勾配パルスでファンクション·ジェネレータの同期を制御します。正と負の方向で切り替えるバイポーラ勾配の買収に続いて、（c）はせん断波のイメージは複雑な除算を使用して生成されます。
組織エンジンのMREの プロセスの図2のフロー図パワードコンストラクト。最初に、細胞は（）は最初の設計プロジェクトに不可欠な人口の大きさに成長し、展開されます。その後、細胞は生体材料足場と化学試薬に播種（b）は分化を信号に適用されています。足場は、その最初の一歩（c）の構造に結合されたアクチュエータの共振周波数を決定することであるMRE、と特徴付けられる。次に、MRI画像（d）はせん断波画像（e）を生成するために取得されます。最後に、アルゴリズムは構成要素のマップの剛性をそのelastogram（f）を得るために適用されます。同時に、構造体は、分化を検証するために組織学的評価（g）を区画されている。
図3アクチュエータの特性評価手順。ゼラチン足場は、0.5％アガロースゲルで囲まれている。サンプルに転送される運動を特徴づけるために、ホワイトノイズは、最初のシステムに送信されます。（1A）、その結果運動はレーザードップラー振動計（1b）を用いて検出される。共振周波数が決定されると、共鳴（2A）で連続正弦波信号は、ゼラチン環境に転送変位（2b）を決定するために送信されます。
図4は、4週間の期間にわたって開発マップを作成します。脂肪細胞（）と骨（O）の構造は、対応する大きさとせん断波画像、elastogram、平均せん断剛性と左から右に表示されます。棒グラフとエラーバーの配色とelastogramに対応するためのカラーマップは、関心のある各構造物の地域内の標準偏差を表しています。
表1。成長の4週間にわたって脂肪と骨関節の構造の機械的性質。
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Discussion
この手順では、組織工学的構造物のためのMREのプロセスは、細胞調製物からelastogramの生成に示されている。組織工学のパイプラインに機械的な非破壊評価手法を適用することによって、それが開発の複数の段階を通じて設計された構成要素の変化を評価することが可能になりました。さらに、MREは、設計組織が そのような拡散、磁化移動、化学シフト解析1として構成し監視するために他のMRのメソッドを補完します。
MREの実験を行う際には、いくつかの制限に注意する必要があります。 のin vitro標本での評価は、時間に敏感な研究である。したがって、組織の構造体への潜在的な損傷が最小化されるように研究は以上1時間以内を持続することをお勧めします。さらに、剛性マップの忠実な回復は、6のどちらか小さすぎるか、硬いという構造体のために妥協することができます。上の波長は周波数に反比例するようにこの問題への電子の可能な解決策は、より高い周波数（> 2.5 kHzの）で動作するようになります。高電圧アンプによって駆動される圧電スタックアクチュエータは、試料中の完全なせん断波長を生成するような周波数で十分な動きを実現することができます。プロトコルへのもう一つの可能性改正は、このようなスピンエコー迅速かつエコープラナーイメージング11、12などの高速なシーケンスを使用することです。
in vitroでの組織設計構造物のためのMREの 可能性を超えて、前臨床評価の次のステップは、生体に移植し組織の発達を評価することです。マウスでの研究にMREのアプリケーションでは、非破壊的に開発組織の構造を評価するために、別の機会を提供するであろう。骨や軟骨欠損の治療のためのエラストグラフィの拡張子は潜在的に長持ちする機能的なインプラントfを生成する方法の理解を提供するであろうまたは再生医療で使用されます。磁気共鳴エラストグラフィは 、in vitro および in vivo の両方で設計された構文の検証に大きな役割を果たす可能性を秘めています。
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Disclosures
著者らは、開示する利害の衝突はありません。
Acknowledgments
この研究は、NIH RO3-EB007299-02およびNSF EPSCoR最初の賞によって部分的にサポートされていました。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| MSCGM-Bullet Kit | Reagent | Lonza Inc. | PT-3001 | Store at 4°C |
| 1X DPBS | Reagent | Invitrogen | 21600-010 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-054 | Store at -20°C |
| Dexamethasone | Reagent | Sigma-Aldrich | D2915 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Reagent | Sigma-Aldrich | I5879 | Store at -20°C |
| Insulin-bovine pancreas | Reagent | Sigma-Aldrich | I6634 | Store at -20°C |
| Indomethacin | Reagent | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Β-Glycerophosphate | Reagent | Sigma-Aldrich | G9891 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Reagent | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Gelfoam | Scaffold | Pharmacia Corporation (Pfizer) | 09-0315-08 | |
| Human mesenchymal stem cells | Cell Line | Lonza Inc. | PT-2501 | |
| 9.4T MR Scanner | Equipment | Agilent Technologies | 400MHz WB | |
| 10mm Litz Coil | Equipment | Doty Scientific | ||
| Laser Doppler Vibrometer | Equipment | Polytec | PDV-100 | |
| Vibrosoft (20) | Software | Polytec | ||
| Function generator | Equipment | Agilent Technologies | AFG 3022B | |
| Amplifier | Equipment | Piezo Inc. | EPA-104-115 | |
| Piezo Bending motor | Equipment | Piezo Inc. | T234-A4Cl-203X | |
| Computer-Linux | Equipment | Intel | Processor: Intel Core 2 Duo E8400, Memory: 2G | |
| Computer-Windows | Equipment | Intel | Processor: Intel Core 2 Duo E8400, Memory: 2G | |
| MATLAB | Software | Mathworks | 2009b |
References
- Xu, H., Othman, S. F., Magin, R. L. Monitoring tissue engineering using magnetic resonance imaging. J. Biosci. Bioeng. 106, 515-527 (2008).
- Xu, H., Othman, S. F., Hong, L., Peptan, I. A., Magin, R. L. Magnetic resonance microscopy for monitoring osteogenesis in tissue-engineered construct in vitro. Phys. Med. Biol. 51, 719-732 (2006).
- Othman, S. F., Xu, H., Royston, T. J., Magin, R. L. Microscopic magnetic resonance elastography (microMRE. Magn. Reson. Med. 54, 605-615 (2005).
- Muthupillai, R., Lomas, D. J., Rossman, P. J., Greenleaf, J. F., Manduca, A., Ehman, R. L. Magnetic resonance elastography by direct visualization of propagating acoustic strain waves. Science. 269, 1854-1857 (1995).
- Othman, S. F., Curtis, E. T., Plautz, S. A., Pannier, A. P., Xu, H. Magnetic resonance elastography monitoring of tissue engineered constructs. NMR Biomed. , Forthcoming (2011).
- Oliphant, T. E., Manduca, A., Ehman, R. L., Greenleaf, J. F. Complex-valued stiffness reconstruction for magnetic resonance elastography by algebraic inversion of the differential equation. Magn. Reson. Med. 45, 299-310 (2001).
- Ringleb, S. I., Chen, Q., Lake, D. S., Manduca, A., Ehman, R. L., An, K. Quantitative shear wave: comparison to a dynamic shear material test. Magn. Reson. Med. 53, 1197-1201 (2005).
- Hong, L., Peptan, I., Clark, P., Mao, J. J. Ex vivo adipose tissue engineering by human marrow stromal cell seeded gelatin sponge. Ann. Biomed. Eng. 33, 511-517 (2005).
- Dennis, J. E., Haynesworth, S. E., Young, R. G., Caplan, A. I. Osteogenesis in marrow-derived mesenchymal cell porous ceramic composites transplanted subcutaneously: effect of fibronectin and laminin on cell retention and rate of osteogenic expression. Cell Transplant. 1, 23-32 (1992).
- Marion, N. W., Mao, J. J. Mesenchymal stem cells and tissue engineering. Methods Enzymol. 420, 339-361 (2006).
- Rydberg, J., Grimm, R., Kruse, S., Felmlee, J., McCracken, P., Ehman, R. L. Fast spin-echo magnetic resonance elastography of the brain. Proceedings of the International Society of Magnetic Resonance in Medicine, Glasgow, Scotland, , 1647-1647 (2001).
- Kruse, S. A., Grim, R. C., Lake, D. S., Manduca, A., Ehman, R. L. Fast EPI based 3D MR elastography of the brain. Proceedings of the International Society for Magnetic Resonance in Medicine, Seattle, Washington, , 3385-3385 (2006).
