תהודה מגנטית elastography מתודולוגיה להערכת של רקמות מהונדסות צמיחה Construct

Summary

הליך מדגים את המתודולוגיה של elastography תהודה מגנטית לניטור התוצאה מהונדסים של השומן ואת בונה רקמות osteogenic מהונדסים באמצעות הערכה מקומית לא פולשנית של תכונות מכניות באמצעות תהודה מגנטית elastography מיקרוסקופיים (μMRE).

Abstract

בדיקה מכנית מסורתית לעיתים קרובות התוצאה היא הרס של המדגם, ובמקרה של רקמת לטווח ארוך מהונדסים לבנות מחקרים, שימוש הרסני הערכה אינה מקובלת. החלופה המוצעת היא שימוש בתהליך שנקרא elastography הדמיה באמצעות תהודה מגנטית. Elastography היא שיטה הורסות לקביעת התוצאה מהונדסים על ידי מדידת ערך הנכסים המקומיים מכני (כלומר, מורכב מודול גזירה), שהם סמנים חיוניים לזיהוי המבנה ואת התפקוד של הרקמות. כאמצעי פולשניות להערכה, ניטור של מבנים מהונדסים עם שיטות הדמיה כגון הדמיה בתהודה מגנטית (MRI) יש לראות עניין גובר בעשור האחרון ^1. לדוגמה, מגנטי (MR) תהודה טכניקות של דיפוזיה relaxometry הצליחו לאפיין את השינויים כימי ותכונות פיזיקליות במהלך התפתחות רקמות מהונדסות ^2. השיטה המוצעתהפרוטוקול הבא משתמש תהודה מגנטית elastography מיקרוסקופיים (μMRE) כטכניקה MR לא פולשנית המבוססת על מדידת תכונות מכניות של הרקמות הרכות קטנות ^3. MRE מושג על ידי צימוד מפעיל מכונות סוניק עם רקמת עניין ורישום גל הפצה גזירה עם סורק MR ^4. לאחרונה, μMRE הוחל בהנדסת רקמות להשיג מידע חיוני לצמיחה נמדדת באופן מסורתי באמצעות טכניקות הרסניות מאקרוסקופיים מכניים ^5. בהליך הבא, elastography מושגת באמצעות הדמיה של מבנים מהונדסים עם רצף האן ספין הד שונה יחד עם מפעיל מכונות. כפי שניתן לראות בתרשים 1, את רצף שונה מסנכרן רכישת התמונה עם שידור של גלי גזירה חיצוניים, לאחר מכן, תנועה רגיש היא באמצעות נדנוד זוגות דו קוטבית. בעקבות אוסף של תמונות בתנועה sensitiza חיובי ושלילי, tion חלוקה מורכבת של הנתונים להפיק תמונה גל גזירה. לאחר מכן, התמונה הוערכה באמצעות אלגוריתם היפוך כדי ליצור מפה קשיחות גזירה ^6. המדידות הנובעים בכל voxel כל הוכחו מאוד לתאם (R ^2> 0.9914) עם נתונים שנאספו באמצעות ניתוח מכני דינמי ^7. במחקר זה, elastography משתלבת בתהליך התפתחות רקמת לניטור גזע אנושיים תא mesenchymal (ח MSC) בידול לתוך מבנים adipogenic ו osteogenic כפי שמוצג באיור 2.

Protocol

1. Construct רקמות הכנה

רקמת לבנות תהליך הכנה מורכב משלושה שלבים עיקריים: הרחבת אוכלוסיית תאים, זריעה של תאים על גבי פיגום ביולוגי, והבחנה באמצעות מולקולות איתות כימיים. הליך להכנת מבנה מבוסס על שיטות שנערכו על ידי דניס et al., הונג et al., ומריון ומאו ^8,9,10.

1. אחרי התרבות והרחבת קו התא, זרע תאים אנושיים גזע mesenchymal (H MSCs) על גבי ספוג ג'לטין (4 מ"מ קוטר, 3.5 מ"מ עובי) בצפיפות של 1x10 ⁶ תאים למ"ל של העצם 3x10 ⁶ תאים / מ"ל עבור היווצרות שומן.
2. על בידול של H MSCs לתוך השומן, החל את גיוס שומן התקשורת בהיקף של dexamethasone 1 מיקרומטר, 0.5 מיקרומטר isobutyl-methylxanthine, 10 מיקרוגרם / מ"ל האנושי אינסולין רקומביננטי, ו 200 מיקרומטר indomethacin במדיום הרחבת התאפעם התאים מופיעים confluent על הפיגום. אחרי שלושה ימים, להחליף את התקשורת עם 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​של אינסולין רקומביננטי אנושי בתקשורת הרחבה של 24 שעות ואז לחזור התקשורת אינדוקציה. חזור על מחזור שלוש פעמים, ואז להחליף רק בתקשורת תחזוקה כל יומיים.
3. כדי לגרום osteogenesis, להכין התקשורת אינדוקציה osteogenic בכך הריכוז הסופי של dexamethasone 0.1 מיקרומטר, 50 מיקרומטר של 2phosphate חומצה אסקורבית-L, ו - 10 mM β-glycerophosphate במדיום הרחבת התא. החלף התקשורת osteogenic טריים כל יומיים.

2. מפעיל אפיון

אפיון מפעיל היא צעד חיוני הניסוי MRE. MRE מסתמך על התפשטות של גלי גזירה מכניים כדי להעריך את הערכים המקומיים של תכונות מכניות, לכן אלה רעידות מכאניות צורך שנוצר מאופיין בתוך הרקמה של עניין באמצעות מפעיל פיזואלקטריים. מאויר example של תהליך אפיון מוצגת באיור 3. מטרת נוהל זה היא לייעל את התנועה של מפעיל כדי ליצור גלי גזירה מזיקים עם אמפליטודות משמעותיים (~ 250 מיקרון).

1. לפני הניסוי, חלה 0.5% agarose ג'ל כדי לתחום את מבנה במבחנה 10 מ"מ. הטמפרטורה של הג'ל צריך להיות כ 37 ° C כדי למזער את הנזק לבנות.
2. לאחר שנתן ג 'ל agarose חמש דקות כדי לקבוע בטמפרטורת החדר, להכניס את קצה המנוע כיפוף פיזואלקטריים לתוך השטח של ג'ל.
3. חבר את צינור המכיל מדגם מפעיל לתמיכה נוקשה, ואת המזרח קרן Vibrometer לייזר דופלר לכיוון קצה מפעיל מכונות. להתאים את המיקום של המערכת כדי לייעל את האות לידי ביטוי, השתמש קלטת משקף במידת הצורך.
4. בהתבסס על תדר התהודה הצפויה של מפעיל מכונות, קבע את הגנרטור פונקציה לטאטא דטווח תדרים esired (כלומר 20-2000 הרץ בניסוי זה) באמצעות מתח הפעלה של 20 Vpp עם אות רעש לבן.
5. הצג את הספקטרום מאופיינת על תוכנית Polytec Vibrosoft לזהות את תדר התהודה של המערכת ולהגדיר את תוכנית FFT ומהירות כמו ציר ה-Y.
6. למדידת תזוזה, קבע את מפעיל לספק sinusoid רציף בתדר תהודה המצוין באמצעות מתח הפעלה של 200 Vpp, וציין את העקירה שנוצר להיות מועברת אל פני השטח של ג'ל. הגדר Vibrosoft כדי להציג את FFT עם תזוזה כמו ציר ה-Y.

3. תמונה רכישה

1. לאחר סיום אפיון מפעיל, הצב את המדגם מפעיל במרכז סורק ה-MRI. על הניסויים * המבנה רקמות, השתמש סליל קטן יותר רגיש RF (כלומר 10 מ"מ בניסוי זה) לשידור וקליטה של ​​אות ה-RF. (הליך הראו משתמש 9.4 Tמגנט משעמם אנכי מצויד הדרגתיים ציר משולש, 100 ז / cm).
2. לרכישת התמונה הצופים זיהוי מיקום המבנה.
3. להגדיר את הפרמטרים עבור הרכישה. טיפוסי במבחנה sagittal סריקה יהיה הזמן חזרה על 1000 שניה, הפעם הד MS 20-40, עובי פרוסת 0.5-1.0 מ"מ, שדה הראיה של 12x10 מ"מ ² עם גודל המטריצה ​​של 128x128 פיקסלים.
4. עבור הפרמטרים elastography, קבע את תדר מפעיל ערך נקבע על פי אפיון Vibrometer לייזר דופלר. במחקר הנוכחי, זוג אחד היה צורך דו קוטבית עם אמפליטודה שיפוע של 50 גרם / ס"מ. פרמטרים אחרים כדי להתאים כוללים עיכוב אשר אמור להיות מוגדר אפס מילישניות עבור הרכישה הראשונית.
5. לשנות את הגנרטור פונקציה לפרוץ מצב ולהתאים את הפרמטרים של הגנרטור פונקציה כדי להתאים לאלה של רכישת פרמטרים elastography כולל תדירות ומספר מחזורי. כמו כן, קבע את funcגנרטור tion להיות מופעלות כלפי חוץ.
6. לתמונה sagittal, להגדיר את רגישות התנועה להיות בכיוון פרוסת חיובית להתחיל בסריקה. בעקבות הרכישה, לבדוק את התמונה ולשנות את רגישות לכיוון פרוסת שלילית.
7. לבצע את תוכנית MATLAB אשר יבצע את החלוקה מורכבת עבור הדור של התמונה גל גזירה.
8. להעריך את התמונה לנוכחות של גלי גזירה וחפצי האפשריות כגון גלישת שלב.
9. אם אין התאמות התמונה יש צורך, להתאים את מערך בגודל פרמטר שמונה ערכים ברווח לא פחות, החל אפס שניות לתקופה מלאה של תהודה בתדירות שאפיינה.
10. לרכוש סריקה הן נטיות פרוסה חיוביות ושליליות.
11. אחת התמונות נרכשים, השתמש בתוכנית MATLAB נועד להפקת הנתונים גלי גזירה ממערך של תמונות.

4. תמונה MRE ניסוי עיבוד

1. הדואר השלב האחרון של MRE היא לחשב קשיחות גזירה מהתמונות גל גזירה. הצבת את הנתונים לתוך תוכנית MATLAB אשר להעריך את בסיס הנתונים מימדי 3 (2 מרחבית, 1 הזמני).

הערה: אם נניח גל גזירה מישוריים, את המשוואות של תנועה המאפשר לנתק הערכת המורכב ערכים מודולוס גזירה כפונקציה של תזוזה ו Laplacian שלה. אלגוריתם קירוב נגזרים השני מרחביים עם הפרשים סופיים ומחשב את מודול גזירה על בסיס פיקסל אחר פיקסל. מתוך מספר זה מורכב, פרמטרים מכניים רבים ניתן להסיק כגון מהירות גל גזירה, הנחתה גל, קשיחות גזירה, גמישות גזירה, צמיגות גזירה וכו 'האלגוריתם מאפשר גם בחירה של אזורים בעלי עניין עבורו סטיית תקן ממוצעת של כל פרמטר מחושב.

2. הפרמטרים הדמיה צריך לציין בתחילת התוכנית. בנוסף, הדואר הגבול העליון של elastogram יכול להיות מותאם כדי לייעל לעומת זאת במדגם.

הערה: התוכנית מספקת תוצאות ביניים (גל אחר נמוך לעבור סינון, גל אחרי סינון כיוונית, FFT הזמני, פרופילים מקוונים וכו '), המסייעים למשתמש להעריך את נאמנותו של התאוששות.

3. פרמטרים מסוימים ניתן להתאים על סמך מידע זה, כמו למשל רמות נמוך לעבור סינון, תדירות הזמני של התנועה, כיוון התפשטות הגל וכו 'סטיית התקן של הפרמטר באזור מסוים של הריבית גם מדד לאיכות בחישוב.

5. נציג תוצאות

איור 4 הערות שינוי תכונות מכניות לאורך ארבעה שבועות של התפתחות מבנה osteogenic ו adipogenic. MRE נערך 730-820 הרץ. בעוד שני ספוגים זרע התחיל בערך בשעה 3 kPa, osteogeniג רקמות מכוונות הביא קשיחות של kPa 22, ואילו השומן מכוונת רקמות ירד נוקשות כדי kPa 1. יתר על כן, המבנים osteogenic נרשמה ירידה ניכרת בגודל בהשוואה מתחילתו ועד סופו של המחקר. מאפיינים נוספים הנגזרים מן המחקר elastography מוצגים בטבלה 1.

באיור 1. רכישת התמונה תהליך elastography תהודה מגנטית. במהלך רכישת התמונה, רצף הדופק (א) קובע את הסנכרון (ב) של הגנרטור לתפקד עם הדרגתיים דו קוטבית פולסים של סורק ה-MRI. בעקבות הרכישה של הפרעה דו הדרגתיים מתג השחרור של מגמות חיוביות ושליליות, (ג) על התמונה גל גזירה מופק באמצעות חלוקה מורכבת.

2. תרשים זרימה תרשים של תהליך MRE עבור מנוע רקמותered בונה. ראשית, תאים (א) גדלים 1 והרחיב לגודל האוכלוסייה חיוני הפרויקט תוכנן. לאחר מכן התאים seeded (ב) על גבי פיגום ביולוגי ריאגנטים כימיים מוחלים לאותת בידול. פיגומים מאופיינים עם MRE, אשר צעד 1 (ג) הוא קביעת תדר התהודה של מפעיל יחד לבנות. בשלב הבא, תמונות MRI (ד) נרכשים כדי ליצור תמונה גל גזירה (ה). בסופו של דבר, האלגוריתם מוחל להניב elastogram (ו) הממפה את הנוקשות של המבנה. במקביל, בונה הם מחולק להערכה היסטולוגית (ז) על מנת לאמת את הבידול.

איור 3. אפיון ההליך מפעיל. פיגום ג'לטין מוקף על ידי ג 'ל agarose 0.5%. כדי לאפיין את התנועה מועבר אל תוך המדגם רעש לבן 1 נשלח למערכת(1 א) ו - תנועה וכתוצאה מכך הוא זוהה באמצעות דופלר לייזר Vibrometer (1 ב). לאחר תדר התהודה נקבע, האות sinusoid רציפה תהודה (2 א) נשלח על מנת לקבוע את העקירה (2 ב) הועבר לסביבה ג'לטין.

איור 4. לבנות מפת הפיתוח במשך 4 שבועות. Adipogenic (א) ו osteogenic (O) בונה מוצגים משמאל לימין עם גודל המתאים ותמונות גלי גזירה, elastogram, וקשיחות גזירה הממוצע. מפת צבעים של מתאים elastogram עם הצבעים של התרשים בר ברים שגיאה מייצגים את סטיית התקן בתוך אזור של כל המבנה של עניין.

טבלה 1. תכונות מכניות של מבנים שומן ו osteo במשך ארבעה שבועות של צמיחה.

Discussion

בהליך זה, בתהליך של MRE עבור בונה רקמות מהונדסות באה לידי ביטוי בין הכנת תא לדור של elastogram. על ידי יישום שיטת ההערכה הורסות מכני צינור הנדסת רקמות, ניתן כיום להעריך שינויים מבנים מהונדסים ברחבי בשלבים שונים של פיתוח. בנוסף, MRE משלים שיטות אחרות מר עבור ניטור רקמות הנדסה בונה כגון דיפוזיה, העברה המגנטיזציה, ואת שינוי כימי ניתוח ^1.

בעת ביצוע ניסויים MRE, כמה מגבלות יש לציין. הערכת בדגימות מבחנה הוא מחקר זמן רגיש. לכן, מומלץ כי מחקרים צריך להימשך לא יותר משעה, כך שכל נזק אפשרי לבנות רקמות ממוזער. בנוסף, שחזור נאמן של המפה הנוקשות יכולה להיות בסכנה בשל המבנים להיות או קטן מדי או נוקשה ^6. עלפתרון ה אפשרי לבעיה זו הוא לפעול בתדירות גבוהה יותר (> 2.5 kHz), כמו אורך הגל עומד ביחס הפוך לתדירות. מפעילים מחסנית פיזואלקטריים מונע על ידי מגברי מתח גבוה יכולים לספק תנועה מספקת בתדרים אלה כדי לייצר גל גזירה מלא במדגם. תיקון נוסף ניתן הפרוטוקול היא להשתמש ברצפים מהירים יותר כגון מהירות ספין הד הד מישורי הדמיה ^{11, 12.}

מעבר לאפשרויות של MRE עבור בונה רקמות מהונדסות במבחנה, הצעד הבא של הערכה קדם קליניים הוא להעריך את התפתחות הרקמות מושתלים לתוך מערכת חיה. היישום של MRE ללימודים עכבר יספק הזדמנות נוספת nondestructively להעריך את פיתוח המבנים רקמות. הארכת elastography לטיפול של עצם או סחוס פגמים היה פוטנציאל לספק הבנה טובה יותר של איך לייצר עוד F שתלים לאורך תפקודיתאו לשימוש ברפואה רגנרטיבית. Elastography תהודה מגנטית יש את הפוטנציאל לשחק תפקיד גדל והולך אימות של מבנים מהונדסים הן במבחנה in vivo.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
MSCGM-Bullet Kit	Reagent	Lonza Inc.	PT-3001	Store at 4°C
1X DPBS	Reagent	Invitrogen	21600-010
0.05% Trypsin-EDTA	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	25300-054	Store at -20°C
Dexamethasone	Reagent	Sigma-Aldrich	D2915
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Reagent	Sigma-Aldrich	I5879	Store at -20°C
Insulin-bovine pancreas	Reagent	Sigma-Aldrich	I6634	Store at -20°C
Indomethacin	Reagent	Sigma-Aldrich	I7378
Β-Glycerophosphate	Reagent	Sigma-Aldrich	G9891
L-Ascorbic Acid 2-phosphate	Reagent	Sigma-Aldrich	A8960
Gelfoam	Scaffold	Pharmacia Corporation (Pfizer)	09-0315-08
Human mesenchymal stem cells	Cell Line	Lonza Inc.	PT-2501
9.4T MR Scanner	Equipment	Agilent Technologies		400MHz WB
10mm Litz Coil	Equipment	Doty Scientific
Laser Doppler Vibrometer	Equipment	Polytec	PDV-100
Vibrosoft (20)	Software	Polytec
Function generator	Equipment	Agilent Technologies	AFG 3022B
Amplifier	Equipment	Piezo Inc.	EPA-104-115
Piezo Bending motor	Equipment	Piezo Inc.	T234-A4Cl-203X
Computer-Linux	Equipment	Intel		Processor: Intel Core 2 Duo E8400, Memory: 2G
Computer-Windows	Equipment	Intel		Processor: Intel Core 2 Duo E8400, Memory: 2G
MATLAB	Software	Mathworks		2009b