Summary
La procédure démontre la méthodologie de l'élastographie par résonance magnétique pour le suivi des résultats d'ingénierie du tissu adipeux et les constructions de tissus ostéogéniques d'ingénierie grâce à une évaluation non invasive locale des propriétés mécaniques en utilisant microscopique élastographie par résonance magnétique (μMRE).
Abstract
Traditionnel essais mécaniques se traduit souvent par la destruction de l'échantillon, et dans le cas de tissu à long terme conçu de construire des études, l'utilisation de l'évaluation destructrice n'est pas acceptable. Une alternative proposée est l'utilisation d'un procédé d'imagerie appelée élastographie par résonance magnétique. L'élastographie est une méthode non destructive pour déterminer le résultat d'ingénierie en mesurant les valeurs locales des propriétés mécaniques (c.-à-module complexe de cisaillement), qui sont des marqueurs essentiels pour identifier la structure et la fonctionnalité d'un tissu. Comme un moyen non invasif d'évaluation, le suivi des constructions d'ingénierie avec des modalités d'imagerie telles que l'imagerie par résonance magnétique (IRM) a vu un intérêt croissant dans la dernière décennie 1. Par exemple, les par résonance magnétique (MR) des techniques de diffusion et de relaxométrie ont été en mesure de caractériser les changements dans les propriétés chimiques et physiques au cours du développement de l'ingénierie tissulaire 2. La méthode proposée dansle protocole suivant utilise microscopique élastographie par résonance magnétique (μMRE) en tant que technique MR non invasive permettant de mesurer les propriétés mécaniques de petite tissus mous 3. MRE est réalisé en couplant un actionneur mécanique sonore avec le tissu d'intérêt et l'enregistrement de la propagation des ondes de cisaillement avec un scanner MR 4. Récemment, μMRE a été appliqué dans l'ingénierie tissulaire pour acquérir des informations essentiel de la croissance qui est traditionnellement mesurée à l'aide des techniques macroscopiques mécaniques destructeurs 5. Dans la procédure suivante, l'élastographie est obtenue par l'imagerie de constructions d'ingénierie avec une version modifiée de Hahn spin-séquence d'écho associée à un actionneur mécanique. Comme le montre la figure 1, la séquence modifiée se synchronise avec l'acquisition de l'image de transmission des ondes de cisaillement extérieures; ultérieurement, le mouvement est sensibilisée par l'utilisation de paires oscillant bipolaires. Après la collecte d'images avec un mouvement positif et négatif sensitization, la division complexe des données de produire une image d'onde de cisaillement. Puis, l'image est évaluée en utilisant un algorithme d'inversion pour générer une carte rigidité au cisaillement 6. Les résultats des mesures à chaque voxel a été démontré fortement corrélés (R 2> 0.9914) avec les données recueillies à l'aide l'analyse mécanique dynamique 7. Dans cette étude, l'élastographie est intégré dans le processus de développement du tissu pour le suivi des lignées de cellules souches mésenchymateuses (CSM h) la différenciation dans des constructions adipogéniques et ostéogénique comme le montre la figure 2.
Protocol
1. Préparation Construct tissus
Le tissu de construire processus de préparation se compose de trois étapes principales: l'expansion de la population de la cellule, l'ensemencement de cellules sur un échafaudage biomatériau, et la différenciation par l'utilisation de molécules de signalisation chimiques. La procédure pour la préparation construction est basée sur des méthodes menées par Dennis et al., Hong et al., Et Marion et Mao 8,9,10.
- Après la culture et l'expansion de la lignée cellulaire, des semences, les cellules souches mésenchymateuses humaines (h MSC) sur une éponge de gélatine (4 mm de diamètre, 3,5 mm d'épaisseur) à une densité de 1x10 6 cellules / ml pour les os et 3x10 6 cellules / ml pour formation de tissu adipeux.
- Pour la différenciation des cellules souches mésenchymateuses h dans adipeux, appliquer les médias induction adipeux constitués de 1 uM de dexaméthasone, 0,5 uM isobutyl-méthylxanthine, 10 pg / ml d'insuline humaine recombinante-, et 200 uM indométhacine dans un milieu à l'expansion cellulaireUne fois les cellules confluentes apparaissent sur l'échafaud. Après trois jours, de remplacer les médias avec 10 pg / ml de l'insuline humaine recombinante-dans les médias d'extension pour 24 heures, puis revenir à des médias à induction. Répétez le cycle trois fois et ensuite échanger seulement dans les médias d'entretien tous les deux jours.
- Pour induire l'ostéogenèse, préparer des milieux d'induction ostéogéniques en faisant une concentration finale de 0,1 uM de dexaméthasone, 50 uM de L-ascorbique-2phosphate, et 10 mM β-glycérophosphate dans le milieu de l'expansion des cellules. Remplacez-le par Fresh Media ostéogéniques tous les deux jours.
2. Caractérisation actionneur
Caractérisation de l'actionneur est une étape essentielle pour l'expérience des MRE. MRE repose sur la propagation des ondes de cisaillement mécaniques afin d'évaluer les valeurs locales de propriétés mécaniques et, par conséquent, ces vibrations mécaniques doivent être générés et caractérisés dans le tissu d'intérêt en utilisant un actionneur piézoélectrique. Un exa illustréemple du processus de caractérisation est représenté sur la figure 3. L'objectif de cette procédure est d'optimiser le mouvement de l'actionneur afin de générer des ondes de cisaillement inoffensifs avec des amplitudes importantes (~ 250 microns).
- Avant l'expérience, appliquer de 0,5% sur gel d'agarose à enfermer la construction dans un tube à essai de 10 mm. La température du gel soit d'environ 37 ° C à minimiser les dommages à la construction.
- Après avoir laissé les agarose gel cinq minutes pour durcir à température ambiante, insérer la pointe du moteur piézo-électrique de flexion dans la surface du gel.
- Fixer le tube contenant l'échantillon et l'actionneur à un support rigide, et orienter le faisceau de la vibromètre laser à effet Doppler vers la pointe de l'actionneur mécanique. Ajuster le positionnement du système pour optimiser le signal réfléchi, utiliser un ruban réfléchissant si nécessaire.
- Basé sur la fréquence de résonance attendue de l'actionneur mécanique, réglez le générateur de fonction pour balayer la dgamme de fréquences esired (soit 20 à 2000 Hz dans cette expérience) en utilisant une tension de fonctionnement de 20 Vcc avec un signal de bruit blanc.
- Afficher le spectre caractérisé sur le programme Polytec Vibrosoft pour identifier la fréquence de résonance du système et mettre le programme d'FFT et la vitesse de l'axe des y.
- Pour la mesure de déplacement, définir l'actionneur pour fournir une sinusoïde en continu à la fréquence de résonance indiquée en utilisant une tension de fonctionnement de 200 Vpp, et noter le déplacement généré étant délivrée à la surface du gel. Définir Vibrosoft pour afficher la FFT avec le déplacement de l'axe des y.
3. Acquisition d'image
- Après avoir terminé la caractérisation d'actionnement, mettre l'échantillon et l'actionneur dans le centre de l'appareil d'IRM. Pour les expériences construct tissus, utilisation d'une bobine petite et plus sensible RF (10 mm de cette expérience) pour la transmission et la réception du signal RF. (La procédure indiquée utilise un T 9,4verticale aimant alésage équipés avec des gradients de trois axes, 100 g / cm).
- Acquérir une image éclaireur pour l'identification de l'emplacement construction.
- Définissez les paramètres pour l'acquisition. Un type in vitro sagittale balayage ont un temps de répétition de 1000 ms, de temps d'écho de 20-40 ms, épaisseur de tranche de 0,5-1,0 mm, et le champ de vision de 12x10 mm 2 avec une taille de matrice de 128x128 pixels.
- Pour les paramètres d'élastographie, régler la fréquence actionneur à la valeur déterminée par la caractérisation laser Doppler Vibromètre. Dans l'étude actuelle, une paire bipolaire a été nécessaire avec une amplitude de gradient de 50 g / cm. Autres paramètres à ajuster comprennent le retard qui devrait être fixé à zéro millisecondes pour l'acquisition initiale.
- Changer le générateur de fonction pour mode rafale et d'ajuster les paramètres du générateur de fonction pour correspondre à ceux dans les paramètres d'acquisition élastographie, y compris la fréquence et le nombre de cycles. En outre, définir la fonctionGénérateur tion à l'extérieur déclenché.
- Pour une image sagittale, mis en mouvement la sensibilisation à faire dans le sens positif et tranche lancer le scan. Suite à l'acquisition, vérifier l'image et de changer la sensibilisation à la direction tranche négative.
- Exécutez le programme MATLAB qui effectuera la division complexe pour la génération de l'image de l'onde de cisaillement.
- Évaluer l'image pour la présence d'ondes de cisaillement et des artefacts possibles comme l'emballage de phase.
- Si aucun ajustement à l'image sont nécessaires, ajuster la taille de tableau de paramètres à huit valeurs équidistantes allant de zéro secondes pour une période complète de la fréquence de résonance caractérisé.
- Acquérir une analyse dans les deux tranches les orientations positives et négatives.
- Une fois les images sont acquises, utilisez un programme MATLAB conçu pour générer des données d'ondes de cisaillement d'un tableau d'images.
4. Traitement d'image Expérience MRE
- Thétape e finale de l'EDM est de calculer la rigidité de cisaillement à partir des images des ondes de cisaillement. Placer les données dans le programme MATLAB qui permettra d'évaluer l'ensemble de données en trois dimensions (2 spatiale, 1 temporelle).
Note: en supposant par une onde de cisaillement plane, les équations de mouvement permettant de découpler l'estimation de la valeur-module complexe de cisaillement en fonction du déplacement et son laplacien. L'algorithme se rapproche spatiales dérivées secondes avec des différences finies et calcule le module de cisaillement sur une base pixel par pixel. De ce nombre complexe, de nombreux paramètres mécaniques peut être déduite comme la vitesse des ondes de cisaillement, l'atténuation des ondes, la rigidité en cisaillement, l'élasticité de cisaillement, la viscosité de cisaillement, etc L'algorithme permet également la sélection des régions d'intérêt pour lequel la moyenne et l'écart-type de chaque paramètre est calculée.
- Les paramètres d'imagerie doivent être précisés au début du programme. En outre, ee limite supérieure de la élastogramme peut être ajusté pour optimiser le contraste dans l'échantillon.
Remarque: Le programme donne des résultats intermédiaires (vague après filtres passe-bas, vague après filtrage directionnel, temporelle FFT, les profils en ligne, etc) qui aident l'utilisateur à évaluer la fidélité de la reprise.
- Certains paramètres peuvent être réglés sur la base de cette information, tels que les niveaux de filtres passe-bas, la fréquence temporelle de la requête, la direction de propagation de l'onde, etc écart-type d'un paramètre dans une région d'intérêt est également un indicateur de la qualité du calcul.
5. Les résultats représentatifs
Figure 4 notes du changement dans les propriétés mécaniques tout au long de quatre semaines de développement et de construction ostéogénique adipogénique. MRE a été réalisée à 730-820 Hz. Bien que les deux éponges ensemencées ont commencé à environ 3 kPa, osteogenic tissus dirigées donné lieu à une rigidité de 22 kPa, alors que, adipeux dirigé tissus a diminué dans la rigidité à 1 kPa. En outre, les constructions ostéogéniques ont montré une diminution notable de la taille en comparaison du début à la fin de l'étude. D'autres objets dérivés de l'étude de l'élastographie sont présentés dans le tableau 1.
Figure 1. Le processus d'acquisition d'image pour l'élastographie par résonance magnétique. Au cours d'acquisition d'image, une séquence d'impulsions (a) commande la synchronisation (b) du générateur de fonction avec le impulsions de gradients bipolaire de l'appareil d'IRM. Suite à l'acquisition des gradients bipolaire basculée dans des orientations positives et négatives, (c) une image d'onde de cisaillement est produit en utilisant la division complexe.
Schéma Figure 2. Du processus de MRE pour le moteur de tissusconstructions Luin. Tout d'abord, les cellules (a) sont d'abord développée et a étendu à la taille de la population essentielle pour le projet conçu. Puis les cellules sont ensemencées (b) sur un échafaudage bio-matériau et les réactifs chimiques sont appliqués au signal de différenciation. Échafaudages sont caractérisés avec MRE, dont la première étape (c) est la détermination de la fréquence de résonance de l'actionneur couplé à l'assemblage. Suivant, des images IRM (d) sont acquises pour générer une image d'onde de cisaillement (e). Enfin, un algorithme est appliqué pour obtenir une élastogramme (f) que les cartes de la rigidité de la construction. Parallèlement, les constructions sont sectionnés pour l'évaluation histologique (g) afin de valider la différenciation.
Figure 3. Procédure de caractérisation de l'actionneur. L'échafaudage gélatine est délimitée par un gel d'agarose à 0,5%. Pour caractériser le mouvement d'être transféré dans l'échantillon un bruit blanc est d'abord envoyé dans le système(1a) et le mouvement qui en résulte est détectée en utilisant un laser à effet Doppler Vibromètre (1b). Une fois la fréquence de résonance est déterminée, un signal continu sinusoïde à résonance (2a) est envoyé pour déterminer le déplacement (2b) transférée à l'environnement de la gélatine.
Figure 4. Construire la carte de développement sur une période de quatre semaines. Adipogéniques (A) et ostéogénique (O) des constructions sont indiqués de gauche à droite avec une amplitude correspondant et images des ondes de cisaillement, élastogramme, et la rigidité de cisaillement moyenne. La palette de couleurs pour les élastogramme correspond avec le schéma de couleurs du graphique à barres et barres d'erreur représentent l'écart-type au sein de la région chaque construction d'intérêt.
Tableau 1. Les propriétés mécaniques des constructions adipeux et ostéo sur une période de quatre semaines de croissance.
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Discussion
Dans cette procédure, le processus de MRE pour les constructions de l'ingénierie tissulaire est démontré, de la préparation cellulaire à la génération d'un élastogramme. En appliquant une méthode d'évaluation non destructive mécanique à la canalisation du génie tissulaire, il est maintenant possible d'évaluer les changements dans les constructions d'ingénierie tout au long de multiples étapes de développement. En outre, s'ajoute à d'autres méthodes d'ERM MR pour les tissus de surveillance conçu construit comme la diffusion, de transfert d'aimantation, et l'analyse des déplacements chimiques 1.
Lorsque la réalisation d'expériences d'ERM, quelques limitations sont à noter. L'évaluation des spécimens in vitro est une étude des temps sensible. Par conséquent, il est recommandé que les études ne devrait pas durer plus d'une heure de sorte que tout risque de dommage la construction des tissus est réduite au minimum. En outre, la récupération fidèle de la carte de rigidité peut être compromise en raison de constructions sont soit trop petits ou rigide 6. Sure solution à ce problème est de fonctionner à une fréquence plus élevée (> 2,5 kHz), que la longueur d'onde est inversement proportionnelle à la fréquence. Actionneurs piézoélectriques pile entraînés par des amplificateurs à haute tension sont en mesure de fournir de mouvement suffisante à de telles fréquences pour produire une longueur d'onde de cisaillement pleine dans l'échantillon. Une autre modification éventuelle du protocole est d'utiliser plus rapidement des séquences telles que fast spin écho et l'écho planar imaging 11, 12.
Au-delà des possibilités des MRE pour les constructions de l'ingénierie tissulaire in vitro, la prochaine étape de l'évaluation pré-clinique est d'évaluer le développement des tissus implantés dans un système vivant. L'application de MRE à études chez la souris serait une autre occasion de façon non destructive d'évaluer le développement des constructions de tissu. Extension de l'élastographie pour le traitement des os ou de cartilage défauts pourraient fournir une meilleure compréhension de la façon de produire de plus longue durée f fonctionnelle implantsou utiliser en médecine régénérative. Élastographie par résonance magnétique a le potentiel pour jouer un rôle croissant dans la validation des constructions d'ingénierie à la fois in vitro et in vivo.
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Disclosures
Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêts à déclarer.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée en partie par le NIH-RO3 EB007299-02 et NSF EPSCoR premier prix.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| MSCGM-Bullet Kit | Reagent | Lonza Inc. | PT-3001 | Store at 4°C |
| 1X DPBS | Reagent | Invitrogen | 21600-010 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-054 | Store at -20°C |
| Dexamethasone | Reagent | Sigma-Aldrich | D2915 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Reagent | Sigma-Aldrich | I5879 | Store at -20°C |
| Insulin-bovine pancreas | Reagent | Sigma-Aldrich | I6634 | Store at -20°C |
| Indomethacin | Reagent | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Β-Glycerophosphate | Reagent | Sigma-Aldrich | G9891 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Reagent | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Gelfoam | Scaffold | Pharmacia Corporation (Pfizer) | 09-0315-08 | |
| Human mesenchymal stem cells | Cell Line | Lonza Inc. | PT-2501 | |
| 9.4T MR Scanner | Equipment | Agilent Technologies | 400MHz WB | |
| 10mm Litz Coil | Equipment | Doty Scientific | ||
| Laser Doppler Vibrometer | Equipment | Polytec | PDV-100 | |
| Vibrosoft (20) | Software | Polytec | ||
| Function generator | Equipment | Agilent Technologies | AFG 3022B | |
| Amplifier | Equipment | Piezo Inc. | EPA-104-115 | |
| Piezo Bending motor | Equipment | Piezo Inc. | T234-A4Cl-203X | |
| Computer-Linux | Equipment | Intel | Processor: Intel Core 2 Duo E8400, Memory: 2G | |
| Computer-Windows | Equipment | Intel | Processor: Intel Core 2 Duo E8400, Memory: 2G | |
| MATLAB | Software | Mathworks | 2009b |
References
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