Summary
El procedimiento muestra la metodología de la elastografía por resonancia magnética para supervisar el desenlace de ingeniería de tejido adiposo y las construcciones de ingeniería tisular a través de osteogénicas evaluación no invasiva local de las propiedades mecánicas mediante la elastografía por resonancia magnética microscópica (μMRE).
Abstract
Ensayos mecánicos tradicionales a menudo da como resultado la destrucción de la muestra, y en el caso de los tejidos a largo plazo diseñado construir estudios, el uso de la evaluación destructiva no es aceptable. Una alternativa propuesta es el uso de un proceso de imagen llamado elastografía por resonancia magnética. La elastografía es un método no destructivo para determinar el resultado de ingeniería mediante la medición de los valores locales de propiedad mecánica (es decir, complejo módulo de corte), que son esenciales para la identificación de marcadores de la estructura y funcionalidad de un tejido. Como un medio no invasivo para la evaluación, el seguimiento de las construcciones de ingeniería con técnicas de imagen como la resonancia magnética (RM) se ha visto un creciente interés en la última década 1. Por ejemplo, los de resonancia magnética (RM) las técnicas de difusión y relaxometría han sido capaces de caracterizar los cambios en las propiedades químicas y físicas durante el desarrollo de ingeniería tisular 2. El método propuesto enel protocolo siguiente, se utiliza elastografía microscópico resonancia magnética (μMRE) como una técnica no invasiva MR basado para medir las propiedades mecánicas de los tejidos blandos pequeñas 3. MRE se consigue mediante el acoplamiento de un actuador mecánico sónica con el tejido de interés y el registro de la propagación de la onda de cizallamiento con un escáner de RM 4. Recientemente, μMRE ha sido aplicada en la ingeniería de tejidos para adquirir información de crecimiento esencial que tradicionalmente se midió utilizando técnicas mecánicas destructivas macroscópicas 5. En el procedimiento siguiente, elastografía se logra mediante la formación de imágenes de construcciones de ingeniería con una modificación Hahn spin-eco secuencia junto con un actuador mecánico. Como se muestra en la Figura 1, la secuencia modificada de adquisición de imágenes se sincroniza con la transmisión de ondas de corte exteriores; posteriormente, el movimiento es sensibilizado a través del uso de la oscilación de los pares bipolares. Tras la recogida de las imágenes con movimiento positivo y negativo sensibilización, compleja división de los datos se encuentra una imagen de onda de corte. Entonces, la imagen se evaluó utilizando un algoritmo de inversión para generar un mapa rigidez cortante 6. Las mediciones resultantes en cada voxel se ha demostrado una correlación significativa (R 2> 0,9914) con los datos recolectados a través de un análisis mecánico dinámico 7. En este estudio, la elastografía se integra en el proceso de desarrollo de los tejidos para el control de células madre mesenquimales humanas (h MSC) la diferenciación en las construcciones y adipogenic osteogénico, como se muestra en la Figura 2.
Protocol
1. Preparación de tejidos Construct
El tejido de la construcción de proceso de preparación consta de tres etapas principales: la expansión de la población de células, la siembra de células en un andamio biomaterial, y la diferenciación a través del uso de químicos moléculas de señalización. El procedimiento para la preparación de constructo se basa en métodos realizados por Dennis et al., Hong et al., Y Marion y Mao 8,9,10.
- Después de la cultura y la expansión de la línea celular, las semillas de las células madre mesenquimales humanas (h MSC) sobre una esponja de gelatina (4 mm de diámetro, 3,5 mm de espesor) a una densidad de 1x10 6 células / ml para los huesos y 3x10 6 células / ml adiposo formación.
- Para la diferenciación de las MSCs h en adiposo, se aplican los medios de inducción formados por adiposas dexametasona mM 1, 0,5 mM isobutil-metilxantina, 10 ug / ml de insulina humana recombinante, y 200 mM indometacina en medio celular expansiónvez que las células parecen confluir en el cadalso. Después de tres días, reemplazar los medios con 10 mg / ml de insulina humana recombinante en los medios de expansión para 24 horas y luego volver a los medios de inducción. Repetir el ciclo tres veces y luego cambiar sólo en los medios de mantenimiento cada dos días.
- Para inducir la osteogénesis, preparar los medios de inducción osteogénicas haciendo una concentración final de dexametasona de 0,1 micras, 50 M de ácido L-ascórbico-2phosphate, y 10 mM de β-glicerofosfato medio celular en expansión. Vuelva a colocar los medios de comunicación con nuevas osteogénicas cada dos días.
2. Caracterización del actuador
Caracterización del actuador es un paso vital para el experimento de la ERM. ERM se basa en la propagación de ondas mecánicas de cizallamiento para evaluar los valores locales de las propiedades mecánicas, por lo tanto, estas vibraciones mecánicas necesitan ser generado y caracterizado dentro del tejido de interés utilizando un actuador piezoeléctrico. Un exa ilustradaMPLE del proceso de caracterización se muestra en la Figura 3. El objetivo de este procedimiento es el de optimizar el movimiento del actuador con el fin de generar inofensivas ondas de corte con amplitudes significativas (~ 250 micras).
- Antes del experimento, se aplican 0,5% en gel de agarosa para encerrar el constructo en un tubo de ensayo de 10 mm. La temperatura del gel debe ser de aproximadamente 37 ° C para minimizar el daño a la construcción.
- Después de permitir que los gel de agarosa cinco minutos para fijar a la temperatura ambiente, insertar la punta del motor piezoeléctrico de flexión en la superficie del gel.
- Una el tubo que contiene la muestra y el actuador a un soporte rígido, y orientar el haz de láser Doppler la Vibrómetro hacia la punta del actuador mecánico. Ajustar el posicionamiento del sistema para optimizar la señal reflejada, utilice cinta reflectante si es necesario.
- En base a la frecuencia de resonancia esperada del actuador mecánico, ajustar el generador de funciones para barrer el dgama de frecuencias eseado (es decir, 20 a 2000 Hz en este experimento) utilizando un voltaje de funcionamiento de 20 Vpp con una señal de ruido blanco.
- Ver el espectro se caracteriza en el programa de Polytec Vibrosoft para identificar la frecuencia de resonancia del sistema y configurar el programa para la FFT y la velocidad como el eje y.
- Para la medición de desplazamiento, ajuste el actuador para entregar una sinusoide continua en la frecuencia de resonancia indicado utilizando un voltaje de operación de 200 Vpp, y observar el desplazamiento generado se entrega a la superficie del gel. Establecer Vibrosoft para mostrar la FFT con el desplazamiento como el eje y.
3. Adquisición de imágenes
- Después de completar la caracterización del actuador, poner la muestra y el actuador en el centro del escáner de RMN. Para los experimentos de constructos de tejido, utilizar una bobina de RF pequeño y más sensible (es decir, 10 mm en este experimento) para la transmisión y recepción de la señal RF. (El procedimiento se muestra utiliza una T 9,4imán taladro vertical equipado con gradientes de triple eje, 100 g / cm).
- Adquirir una imagen de explorador para la identificación de la ubicación de construcción.
- Establecer los parámetros para la adquisición. Un típico in vitro sagital exploración tendrá un tiempo de repetición de 1000 ms, tiempo de eco de 20-40 ms, grosor de corte de 0.5-1.0 mm, y campo de visión de 12x10 mm 2 con un tamaño de la matriz de 128x128 pixels.
- Para los parámetros elastografía, ajustar la frecuencia de actuador para el valor determinado por la calificación vibrómetro láser Doppler. En el presente estudio, un par bipolar se necesitaba con una amplitud gradiente de 50 g / cm. Otros parámetros para ajustar incluyen el retraso que se debe establecer en cero milisegundos para la adquisición inicial.
- Cambiar el generador de funciones a modo de ráfaga y ajustar los parámetros del generador de funciones para que coincida con los de los parámetros de adquisición de elastografía incluyendo la frecuencia y el número de ciclos. Además, establece la funciónción generador para ser disparado externamente.
- Para obtener una imagen sagital, establezca la sensibilización de movimiento para estar en la dirección de corte positivo y comenzar la búsqueda. Tras la adquisición, comprobar la imagen y cambiar la sensibilización a la dirección de corte negativo.
- Ejecutar el programa MATLAB que llevará a cabo la división complejo para la generación de la imagen de onda de corte.
- Evaluar la imagen de la presencia de ondas de corte y objetos posibles, tales como ajuste de fase.
- Si no hay ajustes a la imagen es necesario, ajustar el tamaño del parámetro de la matriz de ocho valores igualmente espaciados que van desde cero segundos para un periodo completo de la frecuencia de resonancia caracteriza.
- Adquirir una exploración en ambas las orientaciones rebanada positivos y negativos.
- Una vez que las imágenes se adquieren, utilizan un programa en MATLAB diseñada para la generación de los datos de ondas de corte de una serie de imágenes.
4. Experimento ERM Procesamiento de Imágenes
- Thpaso e final de la ERM es calcular la rigidez a cortante de las imágenes de ondas de corte. Colocar los datos en el programa de MATLAB que se evaluará el conjunto de datos en tres dimensiones (2 espacial, un temporal).
Nota: Al asumir una onda transversal plana, las ecuaciones de movimiento que permite desacoplar la estimación de los módulo complejo con valores de cizalladura como una función del desplazamiento y su Laplaciano. El algoritmo se aproxima segundas derivadas espaciales con diferencias finitas y calcula el módulo de cizallamiento sobre una base pixel por pixel. A partir de este número complejo, muchos parámetros mecánicos se puede deducir tales como la velocidad de onda de corte, atenuación de la onda, la rigidez de cizallamiento, la elasticidad de cizallamiento, la viscosidad de cizallamiento, etc El algoritmo también permite la selección de las regiones de interés para los que la desviación media y estándar de cada parámetro se calcula.
- Los parámetros de imagen deben ser especificado al comienzo del programa. Además, ªlímite superior de la electrónica elastograma se puede ajustar para optimizar el contraste en la muestra.
Nota: El programa ofrece los resultados intermedios (la onda después de filtros de paso bajo, ola tras el filtrado de dirección, temporal, FFT, perfiles de línea, etc) que ayudan al usuario calcular la fidelidad de la recuperación.
- Algunos parámetros se pueden ajustar sobre la base de esta información, tales como los niveles de filtros de paso bajo, la frecuencia temporal del movimiento, la dirección de propagación de la onda, etc La desviación estándar de un parámetro en una región específica de interés es también un indicador de la calidad del cálculo.
5. Los resultados representativos
Figura 4 notas el cambio en las propiedades mecánicas a lo largo de cuatro semanas de desarrollo y construcción osteogénico adipogénica. ERM se realizó en 730 a 820 Hz. Mientras tanto las esponjas sembradas comenzó aproximadamente a las 3 kPa, osteogenic tejidos dirigidos dado lugar a una rigidez de 22 kPa, mientras que, los tejidos adiposos dirigido disminución de la rigidez a 1 kPa. Por otra parte, las construcciones osteogénicas mostró una notable disminución en el tamaño en comparación de principio a fin del estudio. Las propiedades adicionales derivadas de estudio elastografía se muestran en la Tabla 1.
Figura 1. El proceso de adquisición de imágenes para elastografía por resonancia magnética. Durante la adquisición de la imagen, una secuencia de impulsos (a) controla la sincronización (b) del generador de funciones con los pulsos gradientes bipolar del equipo de resonancia magnética. Después de la adquisición de los gradientes bipolar activarse en orientaciones positivas y negativas, (c) una imagen de onda de corte se produce utilizando compleja división.
Figura 2. Diagrama de flujo del proceso de ERM para el motor de los tejidosconstrucciones Nimrais. En primer lugar, las células (a) son primero crecido y ampliado para el tamaño de la población esencial para el proyecto diseñado. Entonces las células se siembran (b) en un andamio biomaterial y reactivos químicos se aplican a la señal de diferenciación. Los andamios se caracterizan con MRE, cuya primera etapa (c) es la determinación de la frecuencia de resonancia del actuador acoplado a la construcción. Imágenes siguientes, MRI (d) son adquiridos para generar una imagen de onda de corte (e). Finalmente, un algoritmo se aplica para dar un elastograma (f) que los mapas de la rigidez de la construcción. Al mismo tiempo, las construcciones son seccionadas para la evaluación histológica (g) con el fin de validar la diferenciación.
Figura 3. Procedimiento actuador caracterización. El andamio gelatina está encerrada por un 0,5% en gel de agarosa. Para caracterizar el movimiento se transfiere a la muestra un ruido blanco se envía primero en el sistema(1a) y el movimiento resultante se detecta usando un láser Doppler Vibrómetro (1b). Una vez que la frecuencia de resonancia está determinada, una señal continua sinusoide a la resonancia (2a) se envía para determinar el desplazamiento (2b) transferido al medio ambiente gelatina.
Figura 4. Construir mapa de desarrollo a lo largo período de cuatro semanas. Adipogenic (A) y osteogénico (O) constructos se muestran de izquierda a derecha con una magnitud correspondiente y las imágenes de cizallamiento de onda, elastograma, y la rigidez cortante promedio. El mapa de colores para los elastograma corresponde con el esquema de colores del gráfico de barras y barras de error representan la desviación estándar dentro de la región cada constructo de interés.
Tabla 1. Propiedades mecánicas de los constructos adiposo y osteo durante un período de cuatro semanas de crecimiento.
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Discussion
En este procedimiento, el proceso de ERM para construcciones de ingeniería tisular se demuestra de preparación de células para la generación de una elastograma. Mediante la aplicación de un método no destructivo evaluación mecánica a la tubería ingeniería de tejidos, ahora es posible evaluar los cambios en las construcciones de ingeniería a lo largo de múltiples etapas de desarrollo. Además, ERM complementa otros métodos de resonancia magnética para el tejido de vigilancia construcciones de ingeniería tales como la difusión, la transferencia de magnetización, y el análisis químico cambio 1.
Al realizar experimentos de ERM, algunas limitaciones deben tenerse en cuenta. La evaluación de las muestras en un estudio in vitro es sensible al tiempo. Por lo tanto, se recomienda que los estudios no debe durar más de una hora de modo que cualquier daño potencial a la construcción del tejido se reduce al mínimo. Además, la recuperación de los fieles de la hoja de la rigidez puede estar comprometida debido a las construcciones que son demasiado pequeños o rígido 6. Ensolución e posible a este problema es para funcionar a una frecuencia más alta (> 2,5 kHz), como la longitud de onda es inversamente proporcional a la frecuencia. Actuadores piezoeléctricos pila impulsados por los amplificadores de alta tensión son capaces de ofrecer suficiente movimiento en tales frecuencias para producir una longitud de onda de corte completo en la muestra. Otra posible modificación del protocolo es el uso de secuencias más rápidas, como spin-eco rápido y eco imagen planar 11, 12.
Más allá de las posibilidades de ERM para construcciones de ingeniería tisular in vitro, el siguiente paso de la pre-clínica consistirá en evaluar el desarrollo de los tejidos implantados en un sistema vivo. La aplicación de la ERM a los estudios del ratón daría otra oportunidad para evaluar el desarrollo de forma no destructiva con los tejidos. Extensión de la elastografía para el tratamiento de hueso o cartílago defectos podría potencialmente proporcionar una mejor comprensión de cómo producir más duradera f implantes funcionaleso el uso en medicina regenerativa. Elastografía por resonancia magnética tiene el potencial de desempeñar un papel creciente en la validación de las construcciones de ingeniería, tanto in vitro como in vivo.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses a revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue financiada en parte por el NIH-SR3 EB007299-02 y NSF Premio EPSCoR Primera.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| MSCGM-Bullet Kit | Reagent | Lonza Inc. | PT-3001 | Store at 4°C |
| 1X DPBS | Reagent | Invitrogen | 21600-010 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-054 | Store at -20°C |
| Dexamethasone | Reagent | Sigma-Aldrich | D2915 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Reagent | Sigma-Aldrich | I5879 | Store at -20°C |
| Insulin-bovine pancreas | Reagent | Sigma-Aldrich | I6634 | Store at -20°C |
| Indomethacin | Reagent | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Β-Glycerophosphate | Reagent | Sigma-Aldrich | G9891 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Reagent | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Gelfoam | Scaffold | Pharmacia Corporation (Pfizer) | 09-0315-08 | |
| Human mesenchymal stem cells | Cell Line | Lonza Inc. | PT-2501 | |
| 9.4T MR Scanner | Equipment | Agilent Technologies | 400MHz WB | |
| 10mm Litz Coil | Equipment | Doty Scientific | ||
| Laser Doppler Vibrometer | Equipment | Polytec | PDV-100 | |
| Vibrosoft (20) | Software | Polytec | ||
| Function generator | Equipment | Agilent Technologies | AFG 3022B | |
| Amplifier | Equipment | Piezo Inc. | EPA-104-115 | |
| Piezo Bending motor | Equipment | Piezo Inc. | T234-A4Cl-203X | |
| Computer-Linux | Equipment | Intel | Processor: Intel Core 2 Duo E8400, Memory: 2G | |
| Computer-Windows | Equipment | Intel | Processor: Intel Core 2 Duo E8400, Memory: 2G | |
| MATLAB | Software | Mathworks | 2009b |
References
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