Metodologia Elastografia por Ressonância Magnética para a Avaliação de engenharia de tecidos Crescimento Construct

Summary

O procedimento demonstra a metodologia de elastografia de ressonância magnética para monitorar o resultado de engenharia de tecidos adiposo e construções osteogénicas engenharia através da avaliação não invasiva locais das propriedades mecânicas, utilizando elastografia ressonância magnética microscópica (μMRE).

Abstract

Testes mecânicos tradicional muitas vezes resulta na destruição da amostra, e, no caso do tecido de longo prazo de engenharia construir estudos, o uso de avaliação destrutiva não é aceitável. Uma alternativa proposta é a utilização de um processo de imagem chamado elastografia por ressonância magnética. Elastografia é um método não destrutivo para determinar o resultado de engenharia medindo locais valores de propriedades mecânicas (isto é, complexo módulo de cisalhamento), que são marcadores essenciais para identificar a estrutura ea funcionalidade de um tecido. Como um meio não-invasivos para avaliação, o acompanhamento de construções de engenharia, com modalidades de imagem, como ressonância magnética (RM) tem visto um interesse crescente na última década ^1. Por exemplo, os ressonância magnética (MR) técnicas de difusão e relaxometry têm sido capazes de caracterizar as alterações na química e as propriedades físicas durante o desenvolvimento da engenharia de tecidos ^2. O método proposto nao seguinte protocolo utiliza elastografia ressonância magnética microscópica (μMRE) como uma técnica não invasiva MR base para a medição das propriedades mecânicas de pequenas tecidos moles ^3. MRE é conseguida por acoplamento de um actuador sónica mecânica com o tecido de interesse e de registo da propagação da onda de cisalhamento com um scanner de ressonância magnética ^4. Recentemente, μMRE tem sido aplicada em engenharia de tecidos para adquirir a informação essencial para o crescimento que é tradicionalmente medida utilizando técnicas mecânicas destrutivas macroscópicas ^5. No procedimento a seguir, elastografia é conseguida através da criação de imagens de construções artificiais, com uma sequência modificada Hahn spin echo-acoplado com um actuador mecânico. Como mostrado na Figura 1, a sequência modificada sincroniza a aquisição da imagem com a transmissão de ondas de cisalhamento externos e, posteriormente, o movimento é sensibilizado por meio do uso de oscilar pares bipolares. Após recolha de imagens com movimento positivo e negativo sensitizadivisão ção, complexa dos dados produzir uma imagem de onda de cisalhamento. Em seguida, a imagem é avaliada usando um algoritmo de inversão para gerar um mapa de rigidez de cisalhamento ^6. As medições resultantes em cada voxel têm sido mostrados para correlacionar fortemente (R ^2> 0,9914) com os dados recolhidos usando análise mecânica dinâmica ^7. Neste estudo, elastografia é integrado no processo de desenvolvimento de tecido para a monitorização de células estaminais mesenquimais humanas (h MSC) diferenciação em construções adipogénicos e osteogénico como mostrado na Figura 2.

Protocol

1. Preparação Construct tecido

O tecido construir processo de preparação consiste em três etapas principais: expansão da população de células, semeando de células sobre um andaime biomaterial, e diferenciação através da utilização de moléculas químicas de sinalização. O procedimento para a preparação de construção baseia-se métodos conduzidos por Dennis et al., Et Hong ai., E Marion e Mao ^8,9,10.

1. Após o cultivo e expansão da linha de células, as sementes das células estaminais mesenquimais humanas (h MSCs) sobre uma esponja de gelatina (4 mm de diâmetro, 3,5 mm de espessura) com uma densidade de 1x10 ⁶ células / ml para o osso e 3x10 ⁶ células / ml para formação adiposo.
2. Para a diferenciação de h MSCs em adiposo, aplicam-se os meios de comunicação adiposos de indução que consistem em 1 a dexametasona uM, 0,5 uM isobutil-metilxantina, 10 ug / ml de insulina humana recombinante, e 200 uM de indometacina em meio de expansão celularuma vez que as células aparecem confluente no cadafalso. Após três dias, substituir o meio com 10 ug / ml de insulina humana recombinante em meios de dilatação para 24 horas depois voltar para meios de indução. Repetir o ciclo de três vezes e, em seguida, trocar apenas em meio de manutenção de dois em dois dias.
3. Para induzir a osteogénese, preparar meios de indução osteogénicas fazendo uma concentração final de 0,1 mM a dexametasona, 50 mM de ácido L-ascórbico 2phosphate-, e 10 mM de β-glicerofosfato em meio de expansão celular. Substituir por novos meios de comunicação osteogênicas a cada dois dias.

2. Caracterização do atuador

Caracterização do atuador é um passo vital para o experimento MRE. MRE baseia-se na propagação de ondas mecânicas de cisalhamento para avaliar os valores locais de propriedades mecânicas e, portanto, estas vibrações mecânicas precisam de ser gerado e caracterizado no tecido de interesse usando um actuador piezoeléctrico. Um exa ilustradomple no processo de caracterização é mostrado na Figura 3. O objectivo deste procedimento é a de optimizar o movimento do actuador, a fim de gerar uma onda de cisalhamento inofensivos com amplitudes significativas (~ 250 micra).

1. Antes do experimento, aplicar 0,5% de gel de agarose para delimitar o construto num tubo de ensaio de 10 mm. A temperatura do gel deverá ser de aproximadamente 37 ° C para minimizar os danos ao construir.
2. Depois de permitir que as de gel de agarose cinco minutos para definir a temperatura ambiente, introduzir a ponta do motor piezoeléctrico de flexão para dentro da superfície do gel.
3. Ligar o tubo contendo a amostra e para o actuador de um suporte rígido, e orientar o feixe do laser Doppler Vibrometer para a ponta do actuador mecânico. Ajustar o posicionamento do sistema para optimizar o sinal reflectido, utilizar fita reflectora, se necessário.
4. Com base na frequência de ressonância esperada do actuador mecânico, definir o gerador de função para varrer o dgama de frequências esired (isto é, 20 a 2000 Hz nesta experiência), utilizando uma voltagem de funcionamento de 20 Vpp com um sinal de ruído branco.
5. Ver o espectro caracterizado sobre o programa de Vibrosoft Polytec para identificar a frequência de ressonância do sistema e definir o programa para FFT e velocidade como o eixo y.
6. Para a medição do deslocamento, definir o actuador para entregar uma sinusóide contínua na frequência de ressonância indicado utilizando uma tensão de funcionamento de 200 Vpp, e observe o deslocamento gerado a ser entregue à superfície do gel. Definir Vibrosoft para exibir a FFT com deslocamento como o eixo y.

3. Aquisição de Imagem

1. Depois de completar a caracterização do actuador, colocar a amostra eo actuador no centro do aparelho de ressonância magnética. Para as experiências de estrutura de tecido, utilizar um pequeno e mais sensível bobina RF (isto é, 10 mm nesta experiência) para a transmissão e recepção do sinal de RF. (O procedimento mostrado usa um T 9,4ímã furo vertical, equipado com gradientes de eixo triplo, 100 g / cm).
2. Adquirir uma imagem batedor para a identificação do local de construção.
3. Defina os parâmetros para a aquisição. Um típico in vitro sagital scan terá um tempo de repetição de 1000 ms, tempo de eco de ms 20-40, a espessura da fatia de 0,5-1,0 mm, eo campo de visão de 12x10 mm ² com um tamanho de matriz de 128x128 pixels.
4. Para os parâmetros elastografia, ajustar a frequência do actuador ao valor determinado pela caracterização Vibrometer laser Doppler. No presente estudo, um par bipolar foi necessário com uma amplitude de gradiente de 50 g / cm. Outros parâmetros para ajustar incluem o atraso que deve ser ajustado para zero milissegundos para a aquisição inicial.
5. Alterar o gerador de função de modo a romper e ajustar os parâmetros do gerador de função para que correspondam aos parâmetros de aquisição de elastografia incluindo a frequência eo número de ciclos. Além disso, defina a funçãogerador ção para ser externamente disparado.
6. Para uma imagem sagital, defina a sensibilização movimento para a direção fatia positivo e iniciar a digitalização. Após a aquisição, verificar a imagem e mudar a sensibilização para a direção fatia negativo.
7. Executar o programa MATLAB que irá executar a divisão complexo para geração de imagem de onda de cisalhamento.
8. Avaliar a imagem para a presença de ondas de cisalhamento e artefactos possíveis, tais como moldagem de fase.
9. Se não houver ajustes na imagem são necessárias, ajustar o tamanho da matriz de parâmetro para oito valores igualmente espaçados que variam de zero segundos a um período completo da freqüência de ressonância caracterizada.
10. Adquirir uma verificação em ambas as orientações de fatia positivos e negativos.
11. Uma vez adquiridas as imagens, use um programa MATLAB projetado para gerar os dados de ondas de cisalhamento de um conjunto de imagens.

4. MRE Processamento de Imagem Experiment

1. The passo final de MRE é para calcular a rigidez de cisalhamento a partir das imagens de onda de cisalhamento. Colocar os dados no programa MATLAB que irá avaliar o conjunto de dados tridimensional (2 espacial, 1 temporal).

Nota: Por assumindo uma onda de cisalhamento planar, as equações de dissociar o movimento permitindo a estimativa dos módulo complexo com valor de cisalhamento em função do deslocamento ea sua Laplaciano. O algoritmo de aproxima espaciais derivadas segundas com a diferença finita e calcula o módulo de cisalhamento numa base pixel-a-pixel. A partir deste número complexo, muitos parâmetros mecânicos podem ser deduzidas, tais como a velocidade da onda de cisalhamento, a atenuação das ondas, a rigidez de cisalhamento, a elasticidade de cisalhamento, a viscosidade de cisalhamento, etc O algoritmo também permite a selecção de regiões de interesse para o qual a média eo desvio padrão de cada parâmetro é calculado.

2. Os parâmetros de imagem precisa ser especificado no início do programa. Além disso th,e limite superior da elastograma pode ser ajustado para optimizar contraste na amostra.

Nota: O programa fornece resultados intermediários (onda após filtros passa-baixa, onda após filtragem direcional, FFT temporais, perfis de linha, etc) que ajudam o usuário a estimar a fidelidade da recuperação.

3. Alguns parâmetros podem ser ajustados com base nesta informação, tais como os níveis de filtros passa-baixa, a frequência temporal do movimento, a direcção de propagação da onda, etc O desvio padrão de um parâmetro de uma região específica de interesse é também um indicador da qualidade do cálculo.

5. Os resultados representativos

Figura 4 observa a mudança nas propriedades mecânicas ao longo de quatro semanas de desenvolvimento construção osteogênica e adipogênica. MRE foi realizado em 730-820 Hz. Embora ambas as esponjas semeadas começou a cerca de 3 kPa, osteogenitecidos c dirigidas resultou em uma rigidez de 22 kPa, e que, adiposo dirigido tecidos diminuição na rigidez de 1 kPa. Além disso, as construções de osteogénicas mostraram uma diminuição notável em tamanho, em comparação do início ao fim do estudo. As propriedades adicionais derivadas de estudo elastografia são mostrados na Tabela 1.

Figura 1. O processo de aquisição de imagem para a elastografia por ressonância magnética. Durante a aquisição de imagem, uma sequência de impulsos (a) controla a sincronização (b) do gerador de função com a gradientes bipolar pulsos do aparelho de ressonância magnética. Após a aquisição de bipolar gradientes alternado em orientações positivos e negativos, (c) uma imagem de onda de cisalhamento é produzido usando a divisão complexo.

Figura Diagrama 2. Do processo de MRE para o motor de tecidoderados construções. Primeiro, as células (uma) são primeiro cultivadas e expandidas para o tamanho da população essencial para o projecto concebido. Em seguida, as células são semeadas (b) para um andaime biomaterial e de reagentes químicos são aplicados para sinalizar a diferenciação. Andaimes são caracterizados com MRE, cujo primeiro passo (c) é a determinação da frequência de ressonância do actuador acoplado ao construto. Em seguida, imagens de ressonância magnética (d) são adquiridos para gerar uma imagem onda de cisalhamento (e). Finalmente, um algoritmo é aplicado para se obter um elastograma (f) que mapeia a rigidez do construto. Ao mesmo tempo, as construções são seccionados para avaliação histológica (g), a fim de validar diferenciação.

Figura 3. Procedimento caracterização do atuador. O andaime gelatina é delimitada por um gel de agarose a 0,5%. Para caracterizar o movimento sendo transferido para a amostra um ruído branco é primeiramente enviado para o sistema(1a) eo movimento resultante é detectado usando um laser Doppler Vibrometer (1b). Uma vez que a frequência de ressonância é determinada, um sinal contínuo de sinusóide em ressonância (2a) é enviada para determinar o deslocamento (2b) transferidos para o meio ambiente de gelatina.

Figura 4. Construa o mapa de desenvolvimento ao longo de quatro semanas. Adipogénicos (A) e osteogénico (O) construções são mostrados da esquerda para a direita com grandeza, correspondente e as imagens de onda de cisalhamento, elastograma, e rigidez ao cisalhamento média. O mapa de cores para os elastograma corresponde com o esquema de cores do gráfico de barras e barras de erro representam o desvio padrão dentro de cada região constructo de interesse.

Tabela 1. As propriedades mecânicas de tecido adiposo e osteo construções ao longo de um período de quatro semanas de crescimento.

Discussion

Neste procedimento, o processo de MRE para construções da engenharia de tecidos é demonstrada a partir de preparação de células para a geração de um elastograma. Através da aplicação de um método de avaliação não destrutiva mecânica para o oleoduto engenharia de tecidos, é agora possível para avaliar alterações na construções de engenharia ao longo múltiplos estágios de desenvolvimento. Além disso, MRE complementa outros métodos de RM para o tecido de monitorização engenharia constrói tais como difusão, a transferência de magnetização, e análise química mudança ^1.

Quando a realização de experimentos de ERM, algumas limitações devem ser observadas. A avaliação em amostras in vitro é um estudo de tempo sensível. Portanto, recomenda-se que os estudos não deve durar mais do que uma hora de modo a que qualquer dano potencial para a construção do tecido é minimizado. Além disso, a recuperação fiel do mapa rigidez pode ser comprometida devido a construções que são demasiado pequenas ou dura ^6. Eme possível solução para este problema consiste em operar com maior frequência (> kHz 2,5), como o comprimento de onda é inversamente proporcional à frequência. Actuadores piezoeléctricos pilha conduzidos por amplificadores de alta tensão são capazes de entregar movimento suficiente a essas frequências para produzir um comprimento de onda de cisalhamento cheio na amostra. Outra alteração possível para o protocolo é usar sequências mais rápidos, como fast spin-eco e eco planar imaging ^{11, 12.}

Para além das possibilidades de MRE para construções da engenharia de tecidos in vitro, o próximo passo de pré-clínico avaliação é avaliar o desenvolvimento de tecidos implantados num sistema vivo. A aplicação do MRE para estudos com ratos seria proporcionar mais uma oportunidade de forma não destrutiva avaliar o desenvolvimento das construções de tecido. Extensão da elastografia para o tratamento de osso ou cartilagem defeitos poderia potencialmente proporcionar uma melhor compreensão de como produzir mais duradouro f implantes funcionalou usar em medicina regenerativa. Elastografia ressonância magnética tem o potencial para desempenhar um papel cada vez mais na validação de construções de engenharia tanto in vitro como in vivo.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
MSCGM-Bullet Kit	Reagent	Lonza Inc.	PT-3001	Store at 4°C
1X DPBS	Reagent	Invitrogen	21600-010
0.05% Trypsin-EDTA	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	25300-054	Store at -20°C
Dexamethasone	Reagent	Sigma-Aldrich	D2915
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Reagent	Sigma-Aldrich	I5879	Store at -20°C
Insulin-bovine pancreas	Reagent	Sigma-Aldrich	I6634	Store at -20°C
Indomethacin	Reagent	Sigma-Aldrich	I7378
Β-Glycerophosphate	Reagent	Sigma-Aldrich	G9891
L-Ascorbic Acid 2-phosphate	Reagent	Sigma-Aldrich	A8960
Gelfoam	Scaffold	Pharmacia Corporation (Pfizer)	09-0315-08
Human mesenchymal stem cells	Cell Line	Lonza Inc.	PT-2501
9.4T MR Scanner	Equipment	Agilent Technologies		400MHz WB
10mm Litz Coil	Equipment	Doty Scientific
Laser Doppler Vibrometer	Equipment	Polytec	PDV-100
Vibrosoft (20)	Software	Polytec
Function generator	Equipment	Agilent Technologies	AFG 3022B
Amplifier	Equipment	Piezo Inc.	EPA-104-115
Piezo Bending motor	Equipment	Piezo Inc.	T234-A4Cl-203X
Computer-Linux	Equipment	Intel		Processor: Intel Core 2 Duo E8400, Memory: 2G
Computer-Windows	Equipment	Intel		Processor: Intel Core 2 Duo E8400, Memory: 2G
MATLAB	Software	Mathworks		2009b