Summary
在目前的干细胞疗法的一个主要障碍是确定最有效的方法来提供这些宿主组织细胞。在这里，我们描述了一个基于壳聚糖的交付方法，该方法是有效的方法简单，同时让脂肪干细胞维持其多能。
Abstract
多能干细胞已被证明是非常有用的在再生医学领域的1-3。然而，为了有效使用这些细胞的组织再生，变量的数目必须考虑。这些变量包括：植入网站的总体积和表面面积，该组织的力学性能和组织的微环境，其中包括血管的数量和细胞外基质的组成部分。因此，被用来传递这些细胞的材料必须与定义的化学成分的生物相容性，同时保持了机械强度，模仿宿主组织。这些材料还必须渗透到细胞附着和增殖提供了有利的微环境的氧气和营养物质。壳聚糖阳离子多糖，具有优良的生物相容性，可以很容易地化学改性，并具有较高的亲和力体内 MAC绑定romolecules 4-5。壳聚糖模仿外基质糖胺部分，使其能够正常细胞黏附，迁移和增殖的基质。在这项研究中，我们利用壳聚糖微球的形式提供基于胶原蛋白的三维支架6脂肪干细胞（ASC）。一个理想的细胞微球比确定培养时间和细胞密度达到最大数量的细胞可以加载。一旦升序接种到壳聚糖微球（CSM），它们被嵌入在胶原支架和可长时间保持文化。总之，这项研究提供了一种方法，准确地提供三维生物材料支架内的干细胞。
Protocol
1。分离脂肪干细胞（ASC）
注：所有的程序，在室温下进行，除非另有说明。
- 分离大鼠肾周和附睾脂肪用无菌汉克的缓冲盐溶液，含1％胎牛血清（FBS），如先前所述6（HBSS中）。
- 百果组织和转移到25毫升管离心8分钟在室温和500克50毫升含1％胎牛血清的HBSS 1-2克。
- 收集的自由浮动的脂肪层，并转移到125毫升三角瓶和治疗II型胶原酶（200 U / ml的）25毫升在45分钟的HBSS 37°，轨道摇床（125转）
- 小心地取出液体部分（油和脂肪层以下），并依次通过100μm和70μm的尼龙网过滤器过滤。离心滤液在500克，在室温下10分钟，吸出supernatant和25毫升的HBSS洗两次沉淀。
- 悬浮细胞沉淀在50毫升的培养基中补充MesenPRO RS生长添加物，抗生素，抗霉菌（100单位/毫升100微克/毫升硫酸链霉素，青霉素G，和0.25微克/毫升两性霉素B）（MesenPRO RS基础培养基） ，2毫米到2的T75瓶（25毫升/瓶）L-谷氨酰胺和吸管细胞。
- 文化ASC在37°C（使用2-4升序所有实验）在5％CO 2培养箱孵化器。
2。制备壳聚糖微球（CSM）
注：所有的程序，在室温下进行，除非另有说明。
- CSM的准备由水油乳化过程中，随着离子的凝聚技术，用我们以前的协议6。乳化在油相混合的豆浆100毫升的壳聚糖水溶液（6毫升3％W / V壳聚糖在0.5 M醋酸）油，正辛醇（1:2 V / V）和5％山梨醇单油酸酯（跨度80）乳化剂，使用开销（1700转）和磁力搅拌（1000转）同时在相反的方向。这种混合确保早期形成之前，在交联胶束可以留在溶液中，并没有解决的底部双方法。此外，磁力搅拌棒的艾滋病在聚合过程中胶束的形成和刚化壳聚糖。
- 不断搅拌约1小时，直到获得一个稳定的中水乳化油的混合物。离子交联开始增加1.5毫升1％W / V正辛醇15分钟，每4小时（共24毫升）的氢氧化钾。
- 交联反应完成后，慢慢地倾倒出油的混合物含有的CSM阶段，马上加入100 mL丙酮球。用丙酮清洗球，直到完全除去油相。
- 干燥在真空干燥器和肛门恢复领域YZE没有进一步的处理。使用粒度分析仪测定平均CSM粒径，表面积每毫克和单位立方体体积。
- 对于随后的实验中，用无菌水的CSM三次，以除去残留的盐和无水酒精消毒。
3。在CSM数确定的游离氨基酸组
注：所有的程序，在室温下进行，除非另有说明。
- 免费使用的硝基苯磺酸（TNBS）的Bubins和Ofner 7的酸法目前CSM的离子交联后的氨基酸组确定的数量。用1 mL 0.5％三硝基苯磺酸溶液50毫升的玻璃试管中4小时在40°C孵育5毫克的微球，并在60°C 3毫升6N盐酸水解时间为2h。
- 样品冷却至室温，加入5毫升的去离子水和10毫升乙酸乙酯提取免费硝基苯磺酸乙醚。
- 5毫升的水相等分预热至40°C的水浴蒸发冷却至室温，任何残余的乙醚，15分钟和15毫升水稀释。
- 与壳聚糖不使用三硝基苯磺酸溶液作为空白和壳聚糖为CSM准备用于确定氨基酸组总数分光光度计在345 nm处测量吸光度。估计CSM的相对壳聚糖的游离氨基酸组的数量。
4。在CSM加载升序
注：所有的程序，在室温下进行，除非另有说明。
- 平衡在一夜之间无菌的HBSS 2.5节从5毫克和消毒的CSM添加到8微米孔径的膜培养板插入（24孔板）。
- 后落户到膜的CSM，小心吸的HBSS中，添加300μL培养基中生长介质的插入和700微升内的THE境外插入。
- 升序重悬在适当的浓度（1×10 4 4×10 4）200μL生长介质和种子在培养板内插入的CSM。 ，播种后，内插入的文化语言的最终体积为500μL。
- CSM升序种子孵育24小时在5％CO 2培养箱孵化器在37°C。
5。在CSM确定ASC的装载和细胞活力的百分比
注：所有的程序，在室温下进行，除非另有说明。
- 孵化后，收集，而不会干扰细胞已迁移到插入膜ASC装在无菌的1.5 ml离心管的CSM。
- 去除残留的培养基，并添加250μL新鲜生长培养基管。
- 每管加入25微升MTT法[3 - （4,5 - dimethylthiozole -2 - 基）-2,5 - 二苯基溴化]解决方案（5毫克/毫升）和5％CO 2培养箱孵化器孵化为4小时，在37°C。
- 孵化后，取出介质，添加250μL二甲基亚砜，涡2-5分钟，以溶解甲臜的复杂混合物。
- 在2700 xĞCSM的离心5分钟，并确定在570作为参考使用630纳米的纳米测量上清液的吸光度。
- 确定细胞数量与CSM的相对吸光度值获得从可行升序知名的关联。
6。表征的ASC-CSM-嵌入式胶原蛋白凝胶
注：所有的程序，在室温下进行，除非另有说明。
- 混合ASC装CSM（含5毫克≈2×10 4细胞）1型从鼠尾腱胶原蛋白的提取，使用2列印氢氧化钠调节pH值至6.8后，根据伯恩斯坦8和fibrillate方法（7.5毫克/毫升）。 纤胶原蛋白ASC-CSM的混合物加入12孔板，孵育30分钟在5％CO 2培养箱孵化器在37°C。
- 完成后房颤，在5％CO 2培养箱孵化至14天孵化，在37°C胶原蛋白ASC-CSM的凝胶
- 使用标准的显微镜技术观察从CSM的细胞到凝胶的释放和迁移。
7。代表结果
在本研究中，我们已经开发提供成胶原蛋白凝胶支架壳聚糖微球（CSM）的干细胞在体外战略。大小均匀（直径在175-225微米）和组成的多孔CSM的准备，并作为细胞载体（ 图2）。孵化与CSM的ASC，细胞附着在一个2×10 4 CSM的cells/5mg的浓度。这些细胞能在微蔓延，同时延长丝状伪足微多孔缝隙（ 图3）。一旦细胞加载的CSM与胶原凝胶混合，细胞立刻开始迁移到凝胶（ 图4）。
表1。在干细胞输送系统使用壳聚糖和胶原蛋白的生物优势。
图1。示意图描绘两用的ASC-CSM装胶原支架的整体战略。 图2，3，4内的示意图，以帮助解释图像注释。
图2示意图描绘的干细胞接种于壳聚糖微球的过程。在proc的ESS涉及共培养与CSM在8升序 - 微米孔径的膜培养板插入。 24小时后，球从插入删除，并嵌入到生物材料的基体的准备。
图3。CSM的加载与ASC的形态特征。 A组描绘了一个ASC装的CSM光显微镜，而B组显示了同一领域的共聚焦荧光显微镜获得的图像叠加的观点。升序预装了钙黄绿素AM（绿色）。 C组描绘了一个卸载微球的SEM图像的图像，而面板D显示加载到微（星号）的细胞。 TEM图像显示在面板E卸载微球的截面。众多的孔隙和裂缝遍布微球。 F显示面板的连接并延伸到综合招聘考试的丝状伪足与细胞的横截面微球（箭头）恶习。原放大倍率：A和B = 70X，C = 500X，丁= 2000×，E及F = 2,500 X。
图4。迁移到三维胶原支架的CSM的ASC。板A和B细胞迁移从微球和胶原基质进入第3天（一个箭头）描绘的CSM。后12天，B组显示一个类似的文化。透射电子显微镜（TEM）影像描绘在C，D和E在C和D星号显示，一直与细胞迁移从微球（箭头）的横截面的微球。描述了更高的放大倍率，面板D面板E，并显示出细胞伪足的胶原纤维（插图）。原放大倍率：＆，B = 100X，C＆D = 6000 X;Ë= 20000，插图= 150,000 X。
图5。示意图描绘的CSM在再生医学和药物输送广阔的用途。
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Discussion
干细胞为基础的治疗的一个主要障碍是细胞运送到指定维修地区发展的有效方法。由于病人到病人的变异，组织类型，损伤的大小和深度;提供干细胞的方法，必须逐案的基础上确定。虽然嵌入矩阵内的干细胞，并提供他们的伤口，似乎是组织工程的下一个合乎逻辑的做法，一些技术上的障碍仍然存在。这包括嵌入细胞的能力附加到基体，并提供周围的生物相容性，可以附加在细胞增殖和失巢凋亡的9-10前，重新建立一个合适的微环境。这个过程需要细胞上调基质重塑机械，这个过程可能需要数天前完成所需的干细胞的增殖，迁移和分化的细胞过程。为了规避这些问题，我们Ĥ大道到壳聚糖微球的的预紧干细胞嵌入到一个合适的基质，修复受损组织之前开发出一种方法。利用我们独特的离子交联的方法来制备微球，该协议是能够准备> 90％的微球，直径在175-225微米，从而产生良好的微型细胞的载体。更重要的是，交联后，微球保持正电，这是非常有利于细胞附着。这些微球的特性，使干细胞附着到CSM迅速。一旦连接，这些干细胞微球是稳定的，能够实现空间内支架的安排，如胶原蛋白凝胶，模仿受伤的组织。总之，这个协议提供了一种新的方法来加载ASC上的CSM和说明，对微球的细胞可以迁移，同时保留自己的干细胞表型。多孔CSM的描述提供了一个优秀的微升序附件，仍然允许细胞迁移到周围基质。
摘要：
关键步骤
- 使用统一大小的微球直径的变化直接影响微球为每毫克细胞附着的表面积。
- 均匀的微球床内插入的文化准备以最佳的细胞均匀附着在CSM。
- 确保媒体的体积增加外以及细胞培养插入是高于内以及半月板。通常情况下，内，外体积比：1:2是合适的，因为这有利于细胞附着的微球。
- 加载内支架微球均匀分布的细胞。如果ASC - CSM的分布过于密集，细胞不会从他们的微迁移。
- CSM和分发所需的数量bution密度取决于应用程序和受伤的组织面积。
限制
- 此方法仅限于微球总面积。如果需要较高的细胞数，需要更多的球，以增加表面积。
- 过程使细胞接种于预制微，不拟对细胞封装的目的。
- 在这个过程中开发的壳聚糖微球可以支持锚地依赖性细胞，但没有其他的细胞类型。
- 由于壳聚糖微球的研制使用0.5M的醋酸溶液，乳化油的混合物（豆油：正辛醇）和恢复使用有机溶剂，不积极治疗基易受上述条件。
- CSM的主要目的，以提供细胞/持续时间短（5-10天）的药物，由于其降解速度更快率，不同于那些旨在持续时间长的可用性。
可能的修改和多功能性（ 图5）
- 微球的大小可能会修改，以改变总面积。例如，微球的大小可能会减少，增加的表面积/毫克氯磺化聚乙烯，这反过来又会增加总表面积和可以连接到微球的细胞数，每增加细胞微球负载。
- 壳聚糖微球可作为载体，加载其他类型的细胞（内皮细胞，周细胞，成纤维细胞等）。
- 细胞装领域（无论是单一或多种细胞类型）可以嵌入在特定地点的支架。这一战略将有助于在多细胞组织再生的组织工程支架的建设。
- 除了提供细胞，球也可以被用来提供治疗药物（也就是说，生长因子，分化诱导，和/或抗生素）。这些药物微球内支架也可用于增强愈合和再生过程中结合细胞微球。
故障排除
- CSM的准备，如果发生在规模较大的变化，那么一些项目可以调整，以产生所需的CSM大小11。
- 壳聚糖溶液的粘度。新鲜配制的股票是首选的解决方案，从批次，批次准备下保持恒定粘度
- 调整量的表面活性剂（跨度80）用于准备乳液。
- 确保架空搅拌器的速度在整个过程中保持不变（速度可能会随电源波动
- 在搅拌传授大气可能造成动荡和大小的变化（这可以通过柯避免EP的液体石激起千层浪，在刚过的开销搅拌器叶片搅拌形成。
- 微球，以确保最佳细胞负荷，量热MTT法可以执行。这将给每毫克微球装入一个可行的细胞数目估计。
- 防止悬浮在细胞培养基体积小如胶原凝胶内支架前混合细胞微球聚集。
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Disclosures
没有竞争的金融利益存在。
免责声明
所载的意见或主张是作者的私人意见，是不被理解为官方或反映国防部或美国政府部门的意见。作者是美国政府的雇员，以及作为其执行公务的一部分准备工作。所有的工作是由美国陆军医学研究和装备司令部的支持。这项研究是根据美国陆军医学研究和装备司令部机构审查委员会，并按照批准的协议，审查和批准了一项协议。
Acknowledgments
DOZ的日内瓦基金会颁发的赠款支持。支持博士后奖学金资助从匹兹堡组织工程倡议的SN。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks BalancedSalt Solution (HBSS) | GIBCO, by Life Technologies | 14175 | Consumable |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | Consumable |
| Collagenase Type II | Sigma-Aldrich | C6685 | Consumable |
| 70-μm nylon mesh filter | BD Biosciences | 352350 | Consumable |
| 100-μm nylon mesh filter | BD Biosciences | 352360 | Consumable |
| MesenPRO Growth Medium System | Invitrogen | 12746-012 | Consumable |
| L-glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | Consumable |
| T75 Tissue Culture Flask | BD Biosciences | 137787 | Consumable |
| Chitosan | Sigma-Aldrich | 448869 | Consumable |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Consumable |
| N-Octanol | Acros Organics | 150630025 | Consumable |
| Sorbitan-Mono-oleate | Sigma-Aldrich | S6760 | Consumable |
| Potassium Hydroxide | Sigma-Aldrich | P1767 | Consumable |
| Acetone | Fisher Scientific | L-4859 | Consumable |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 270741 | Consumable |
| Trinitro Benzenesulfonic Acid | Sigma-Aldrich | P2297 | Consumable |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 320331 | Consumable |
| Ethyl Ether | Sigma-Aldrich | 472-484 | Consumable |
| 8-μm Tissue Culture Plate Inserts | BD Biosciences | 353097 | Consumable |
| 1.5-ml Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | Consumable |
| MTT Reagent | Invitrogen | M6494 | Consumable |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8779 | Consumable |
| Qtracker Cell Labeling Kit (Q tracker 655) | Molecular Probes, Life Technologies | Q2502PMP | Consumable |
| Type 1 Collagen | Travigen | 3447-020-01 | Consumable |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | Consumable |
| 12-Well Tissue Culture Plates | BD Biosciences | 353043 | Consumable |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | Equipment |
| Orbital Shaker | New Brunswick Scienctific | C24 | Equipment |
| Humidified Incubator with Air-5% CO2 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Model 370 | Equipment |
| Overhead Stirrer | IKA | Visc6000 | Equipment |
| Magnetic Stirrer | Corning | PC-210 | Equipment |
| Vacuum Desiccator | - | - | Equipment |
| Particle Size Analyzer | Malvern Instruments | STP2000 Spraytec | Equipment |
| Water Bath | Fisher Scientific | Isotemp210 | Equipment |
| Spectrophotometer | Beckman Coulter Inc. | Beckman Coulter DU800UV/Visible Spectrophotometer | Equipment |
| Vortex | Diagger | 3030a | Equipment |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax M2 | Equipment |
| Light/Fluorescence Microscope | Olympus Corporation | IX71 | Equipment |
| Confocal Microscope | Olympus Corporation | FV-500 Laser Scanning Confocal Microscope | Equipment |
| Scanning Electron Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Leo 435 VP | Equipment |
| Transmission Electron Microscope | JEOL | JEOL 1230 | Equipment |
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