Summary
Et stort hinder i dagens stilk cellen terapi er å bestemme den mest effektive metoden for å levere disse cellene til verten vev. Her beskriver vi en kitosan-basert levering metode som er effektiv og enkel i tilnærmingen, samtidig som adipose-avledet stilk celler for å opprettholde sin multipotency.
Abstract
Multipotent stamceller har vist seg å være svært nyttig innen regenerativ medisin 1-3. Men for å bruke disse cellene effektivt for vev gjenfødelse, må en rekke variabler tas hensyn til. Disse variablene er: det totale volum og areal av implantasjonsstedet, de mekaniske egenskapene til vevet og vevet mikromiljøet, som inkluderer beløpet av vascularization og komponentene i ekstracellulær matrix. Derfor må de materialene som brukes til å levere disse cellene være biokompatibelt med en definert kjemisk sammensetning og samtidig opprettholde en mekanisk styrke som etterligner verten vev. Disse materialene må også være gjennomtrengelig for oksygen og næringsstoffer for å gi en gunstig mikromiljøet for celler å feste og sprer. Chitosan, en kationisk polysakkarid med vevsvennligheten, kan lett kjemisk modifisert og har høy affinitet til å binde med in vivo macromolecules 4-5. Chitosan etterligner glycosaminoglycan delen av ekstracellulær matrix, slik at det å fungere som et substrat for celle adhesjon, migrasjon og spredning. I denne studien bruker vi kitosan i form av mikrosfærer å levere adipose-avledet stilk celler (ASC) til en kollagen basert tredimensjonalt stillas 6. En ideell celle-til-mikrosfære ratio ble bestemt med hensyn til inkubasjonstid og celle tetthet for å oppnå maksimalt antall celler som kan lastes. Når ASC er seedet på kitosan mikrosfærer (CSM), de er forankret i en kollagen stillas og kan opprettholdes i kulturen i lengre perioder. Oppsummert gir denne studien en metode for å gi nøyaktig stamceller innenfor en tredimensjonal biomateriale stillaset.
Protocol
1. Isolere adipose-avledet stilk celler (ASC)
Merk: Alle prosedyrer ble utført ved romtemperatur hvis ikke annet er angitt.
- Isoler rotte perirenal og epididymal adipose og vask med sterilt Hank bufret salt-løsning (HBSS) inneholder 1% fosterets storfe serum (FBS) som tidligere beskrevet seks.
- Finhakk vev og overføre 1-2 g til 25 ml HBSS inneholder 1% FBS inn en 50 ml tube og sentrifuger ved 500 gr i 8 min ved romtemperatur.
- Samle frittflytende fettvev lag og overføring til 125 mL erlenmeyerkolbe og behandle med 25 mL collagenase type II (200 U / ml) i HBSS for 45 min ved 37 ° C på en orbital shaker (125 rpm).
- Fjern forsiktig væskefraksjon (under olje-og adipose lag) og filtrere sekvensielt gjennom et 100-mikrometer og 70-mikrometer nylon mesh filter. Sentrifuger filtratet ved 500 gr i 10 min ved romtemperatur, aspirer det supernatant og vaske pellet to ganger med 25 ml HBSS.
- Resuspender cellen pellet i 50 ml vekst medium (MesenPRO RS Basal Medium) supplert med MesenPRO RS Vekst Supplement, antibiotika-antimykotiske (100 U / ml av penicillin G, 100 mikrogram / ml streptomycin sulfat, og 0,25 mikrogram / ml amfotericin B) , og 2 mm L-glutamin og pipette celler i 2 T75 kolber (25 ml / kolbe).
- Kultur i ASC i en 5% CO 2 fuktet inkubator ved 37 ° C (Passage 2-4 ASC er brukt i alle eksperimenter).
2. Forberede Chitosan Mikrokuler (CSM)
Merk: Alle prosedyrer ble utført ved romtemperatur hvis ikke annet er angitt.
- CSM er utarbeidet av en vann-i-olje emulgering prosessen sammen med en ionisk coacervation teknikk ved hjelp av vår forrige protokoll 6. Emulsify en vandig løsning av kitosan (6 ml 3% w / v kitosan i 0,5 M eddiksyre) i en 100 mL en oljefasen blanding bestående av soyaolje, n-oktanol (1:2 v / v) og 5% sorbitan-mono-oleate (span 80) emulgator, bruke overhead (1700 rpm) og magnetiske røring (1000 rpm) samtidig, i motsatte retninger. Denne doble metoden for å blande sikrer at miceller dannet tidlig på før tverrbindinger forekommer kan forbli i løsning og ikke bosette til bunnen. Videre den magnetiske oppsikt baren hjelpemidler i de-aggregere kitosan under miceller formasjon og rigidization.
- Blandingen er kontinuerlig røres i ca 1 time til en stabil vann-i-olje emulsjon oppnås. Ionisk crosslinking innledes med tillegg av 1,5 ml med 1% w / v kaliumhydroksid i n-oktanol hvert 15 min for 4 t (24 ml totalt).
- Etter gjennomføringen av crosslinking reaksjonen, sakte dekanter oljefasen av blandingen inneholder CSM og umiddelbart legge kulene til 100 ml aceton. Vask kulene med aceton inntil oljefasen er helt fjernet.
- Tørk de gjenopprettede kuler i et vakuum eksikkator og analyze uten videre behandling. Den gjennomsnittlige CSM partikkelstørrelse, areal per milligram, og enheten kubiske volumet ble fastsatt ved hjelp partikkelstørrelse analysator.
- For etterfølgende forsøk, vaske CSM tre ganger med sterilt vann for å fjerne rester av salter og sterilisere med absolutt alkohol.
3. Bestemme antall Free aminogrupper i CSM
Merk: Alle prosedyrer ble utført ved romtemperatur hvis ikke annet er angitt.
- Bestem antall gratis aminogrupper stede i CSM etter ionisk crosslinking ved hjelp av trinitro benzenesulfonic (TNBS) syre analysen av Bubins og Ofner 7. Inkuber 5 mg mikrosfærer med 1 mL 0,5% TNBS løsning i en 50 ml glassrør for 4 timer ved 40 ° C og hydrolyserer med tillegg av 3 mL 6N HCl ved 60 º C for 2t.
- Kjøl prøvene til romtemperatur, og trekke ut de frie TNBS ved å tilsette 5 ml avionisert vann og 10 ml av ethyleter.
- Varm en 5 ml delmengde av den vandige fasen til 40 ° C i vannbad i 15 min å fordampe eventuelle gjenværende eter, avkjøles til romtemperatur, og fortynn med 15 ml vann.
- Mål absorbansen ved 345 nm med et spektrofotometer ved hjelp TNBS løsning uten kitosan som blank og kitosan brukes til CSM forberedelse for å fastslå det totale antallet aminogrupper. Anslå antall gratis aminogrupper av CSM forhold til kitosan.
4. Laster ASC i CSM
Merk: Alle prosedyrer ble utført ved romtemperatur hvis ikke annet er angitt.
- Stabilisere 5 mg sterilisert CSM fra § 2.5 i sterile HBSS natten og legge til en 8-mikrometer porestørrelse membran kultur plate innsatsen (24-brønns plate).
- Etter CSM har avgjort på membranen, nøye Aspirer HBSS og legge 300 mL av vekst medium til innsiden av innsatsen og 700 mL av vekstmedier til the utenfor innsatsen.
- Resuspender ASC på riktig konsentrasjon (1 x 4-4 oktober x 10 4) i 200 mL av vekstmedium og frø over CSM inne i kulturen plate innsatsen. Den endelige volum medium innenfor kulturen innsatsen, etter seeding, er 500 mL.
- Inkuber ASC seeded på CSM for 24 timer i en 5% CO 2 fuktet inkubator ved 37 ° C.
5. Bestemme Andel ASC Loading og celleviabilitet i CSM
Merk: Alle prosedyrer ble utført ved romtemperatur hvis ikke annet er angitt.
- Etter inkubasjon samle ASC-lastet CSM i et sterilt 1,5 ml mikrosentrifuge rør uten å forstyrre de cellene som har migrert inn innsatsen membranen.
- Fjern rester medium og tilsett 250 mL av frisk vekst medium til røret.
- Til hver tube legge 25 mL MTT [3 - (4,5-dimethylthiozole-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide]løsning (5 mg / ml) og inkuberes i 4 t i en 5% CO 2 fuktet inkubator ved 37 ° C.
- Etter inkubasjon fjerne medium, legge 250 mL av dimethyl sulfoxide, og vortex blandingen for 2-5 min til solubilize den formazanforbindelse komplekset.
- Sentrifuger CSM på 2700 x g for 5 min, og bestemme supernatanten absorbansen målt ved 570 nm med 630 nm som referanse.
- Bestem celle nummer knyttet til CSM forhold til absorbans verdi hentet fra kjente antall levedyktige ASC.
6. Karakterisere ASC-CSM-Embedded Collagen Gel
Merk: Alle prosedyrer ble utført ved romtemperatur hvis ikke annet er angitt.
- Mix ASC-loaded CSM (5 mg inneholder ≈ 2 x 10 4 celler) med type 1 kollagen (7,5 mg / ml) hentet fra rotte hale sene ifølge metoden for Bornstein 8 og fibrillate etter justering av pH til 6,8 med 2 N NaOH. Legg til fibrillated kollagen-ASC-CSM blandingen til en 12-brønns plate og Inkuber i 30 min ved i en 5% CO 2 fuktet inkubator ved 37 ° C.
- Etter fullført flimmer, Inkuber kollagen-ASC-CSM gels for inntil 14 dager i en 5% CO 2 fuktet inkubator ved 37 ° C.
- Release og migrasjon av celler fra CSM inn i gelen ble observert ved hjelp av standard mikroskopi teknikker.
7. Representative Resultater
I denne studien har vi utviklet en in vitro strategi for å levere stamceller fra kitosan mikrosfærer (CSM) i en kollagen gel stillas. Porøs CSM av uniform størrelse (175-225 mikrometer i diameter) og sammensetning ble utarbeidet og brukt som celle bærere (figur 2). Ved ruger ASC med CSM, cellene festet i en konsentrasjon på 2 x 10 4 cells/5mg av CSM. Cellene var i stand til å spre over mikrosfære, mens forlenge filopodiainn i porøse sprekker i mikrosfære (figur 3). Når celle-lastede CSM ble blandet med kollagen gel, cellene umiddelbart begynte å migrere inn i gels (figur 4).
Tabell 1. Biologiske fordeler for bruk av kitosan og kollagen i en stamcelle levering system.
Figur 1. Skjematisk viser den overordnede strategien for den doble bruken av ASC-CSM lastet kollagen stillaser. Figurene 2, 3 og 4 er kommentert i skjematisk å bistå med tolkning av bildene.
Figur 2. Skjematisk fremstilling som viser prosessen med seeding stamceller på kitosan mikrosfærer. Den procESS innebærer co-dyrkning ASC med CSM i en 8 - mikrometer porestørrelse membran kultur plate innsatsen. Etter 24 timer, er det mikrosfærer fjernet fra innsatsen og er klar for innebygging i et biomateriale matrise.
Figur 3. Morfologisk karakterisering av CSM-lastet med ASC. Panel A viser en lys micrograph av ASC-lastet CSM, mens panel B viser det samme synsfeltet overlagret med et bilde fremstilt ved confocal fluorescens mikroskopi. ASC ble forhåndslastet med calcein AM (grønn). Panel C skildrer et bilde av en SEM bilde av en ubelastet mikrosfære, mens panel D viser celler lastet inn på mikrosfære (stjerne). Den TEM bilde i panelet E viser et tverrsnitt av en ubelastet mikrosfære. Et mangfold av porer og sprekker er lokalisert over hele mikrosfære. Panel F viser en cross-seksjonert mikrosfære med celler (piler) festet og utvide filopodia inn i CRElaster. Original forstørrelser: A & B = 70x, C = 500x, D = 2000 x; E & F = 2500 x.
Figur 4. Migrasjon av ASC fra CSM inn i tredimensjonale kollagen stillaset. Paneler A og B skildrer CSM med celler migrere bort fra mikrosfære og inn i kollagen matrise på dag 3 (A, piler). Panel B viser en lignende kultur etter 12 dager. Transmisjonselektronmikroskopi (TEM) bilder er avbildet i C, D og E. asterisker i C og D viser en mikrosfære som har vært cross-seksjonert med celler migrere bort fra mikrosfære (piler). Høyere forstørrelse av panel D er avbildet i panelet E, og viser celle filopodia festet til kollagen fibriller (innfelt). Opprinnelig forstørrelse: A & B = 100x; C & D = 6000 x; E = 20000 x, innfelt = 150000 x.
Figur 5.Skjematisk skildrer de enorme bruk av CSM i regenerativ medisin og levering av legemidler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Et stort hinder i stamcelle-basert terapi er å utvikle effektive metoder for levering av celler til de angitte områder for reparasjon. På grunn av pasient til pasient variasjon, den vevstype, skade størrelse og dybde, må metodikken for å levere stamceller avgjøres fra sak til sak. Selv innebygging stamceller innenfor en matrise og levere dem til sårstedet synes å være en neste logiske tilnærming for tissue engineering, noen tekniske hindringer gjenstår. Dette inkluderer muligheten for innebygde cellene å feste til matrise og gi en biokompatibelt rundt der cellene kan feste, spre og gjenopprette en passende mikromiljøet før anoikis 9-10. Denne prosessen krever cellene til upregulate sin matrise remodeling maskiner, en prosess som kan ta dager å gjennomføre før de ønskede celleprosesser for spredning, migrasjon og differensiering av stamceller. For å omgå disse problemene, h viave utviklet en metode for å Forhåndslast stamceller inn på kitosan mikrosfærer før å bygge dem inn i en passende matrise til reparasjon av skadet vev. Ved å bruke vår unike ionisk tverrbindinger metoder for å forberede mikrosfærer, er protokollen kunne tilberede> 90% av mikrosfærer å være innenfor 175-225 mikrometer i diameter, og dermed generere en utmerket mikro-sized transportør for celler. Enda viktigere, etter tverrbindinger, den mikrosfærer forbli positivt ladet, noe som er svært bidrar til celle vedlegg. Disse mikrosfære egenskapene tillate stamceller til å feste raskt på CSM. Når festet, disse stamcelle ladd mikrosfærer er stabile og i stand til å oppnå romlige ordninger innenfor stillas, som for eksempel kollagen hydrogeler, for å etterligne den skadde vevet. I sum gir dette protokollen en ny metode for å laste ASC på CSM og illustrerer at cellene på mikrosfærer kan migrere og bevare sin egen stamcelleforskningen fenotype. Den porøse CSM beskrevet gir enutmerket mikromiljøet for ASC vedlegget og likevel tillate cellene til å migrere inn i omkringliggende matrise.
Oppsummering:
Kritiske trinn
- Bruk uniformt sized mikrosfærer siden variasjon i diameter direkte påvirker areal tilgjengelig for celle vedlegg per milligram av mikrosfærer.
- Utarbeide en enhetlig seng av mikrosfærer i kulturen innsatsen til optimal uniform feste celler til CSM.
- Sørg for at volumet av media lagt til ytre godt av cellekultur innsatsen er høyere enn menisken av den indre brønnen. Vanligvis en indre: er ytre volum ratio på 1:2 er aktuelt, da dette letter celler feste til mikrosfærer.
- Fordel cellen lastet mikrosfærer jevnt i stillaset. Dersom fordelingen av ASC-CSM er for tett, vil cellene ikke migrere fra deres mikrosfærer.
- Ønsket mengde CSM og distribusjonbusjon tetthet er avhengig av søknad og skadde vevet området.
Begrensninger
- Denne metoden er begrenset til det totale arealet tilgjengelig på mikrosfærer. Hvis en høyere celle nummer er ønskelig, er mer mikrosfærer nødvendig for å øke arealet.
- Prosessen tillater celler å bli seedet på den prefabrikkert mikrosfærer og er ikke ment for celle innkapsling formål.
- Den kitosan mikrosfærer utviklet i denne prosessen kan støtte ankerplass-avhengige celler, men ikke andre celler typer.
- Siden kitosan mikrosfærer er utviklet ved hjelp en 0.5M eddiksyreløsning, emulgert i en olje blanding (soyaolje: n-oktanol) og utvinnes ved hjelp av organiske løsemidler den ikke tillater aktive terapeutiske moieties sårbare for ovennevnte tilstand.
- CSM er hovedsakelig ment å levere celler / medikamenter i kortere varighet (5-10 dager) på grunn av sin raskere nedbrytningrate, i motsetning til de beregnet for lang varighet tilgjengelighet.
Mulige Modifikasjoner og allsidighet (figur 5)
- Mikrosfære størrelse kan endres for å endre det totale areal. For eksempel kan mikrosfære størrelse reduseres for å øke arealet / mg CSM, som igjen vil øke det totale arealet og antall celler som kan festes til mikrosfærer, noe som resulterer i en økt celle belastning per mikrosfære.
- Chitosan mikrosfærer kan brukes som en transportør for å laste andre celletyper (endotelceller, pericytes, fibroblast osv.).
- Cell-lastet kuler (enten enkel-eller flere celletyper) kan bygges innenfor bestemte steder i stillasene. Denne strategien vil bidra i byggingen av flercellede vev-konstruerte stillaser for vev gjenfødelse.
- I tillegg til celle levering, kan mikrosfærer også brukes til å levere terapeutiske legemidler (dvs. vekstfaktorer, derivasjon indusere og / eller antibiotika). Disse narkotika-loaded mikrosfærer kan også brukes i kombinasjon med celle-lastet mikrosfærer innenfor et stillas for å forbedre healing og fornyelsesprosesser.
Feilsøking
- Ved utarbeidelsen av CSM, hvis en stor variasjon i størrelse inntreffer, da en rekke elementer som kan justeres for å gi ønsket CSM størrelse 11.
- Viskositet av kitosan løsning. Nylaget lager er å foretrekke å holde løsningen under konstant viskositet fra batch-til-batch forberedelse
- Juster volum av surfaktant (span 80) brukes til å forberede emulsjon.
- Sørg for hastigheten på overhead røreverket holder seg konstant gjennom hele prosessen (hastigheten kan variere med elektriske spenningsvariasjoner
- Under omrøring formidling atmosfærisk luft kan føre til turbulens og størrelse variasjon (dette kan unngås ved å keep væsken rippel, som danner under omrøring, litt over bladene på overhead vispen.
- For å sikre optimal celle lasting av mikrosfærer, kan en kalorimetriske MTT analysen skal utføres. Dette vil gi en estimert antall levedyktige celler lastet per milligram av mikrosfærer.
- Forhindre klumper av celle-lastet mikrosfærer ved å henge dem i et lite volum av cellekultur media før blande dem i et stillas som en kollagen hydrogel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen konkurrerende finansielle interesser eksisterer.
Forbehold
Meningene eller påstander som finnes her, er de private visninger av forfatterne og skal ikke oppfattes som offisiell eller reflekterer synspunktene til Department of Defense eller den amerikanske regjeringen. Forfatterne er ansatte i den amerikanske regjeringen, og dette arbeidet ble utarbeidet som en del av sine offisielle plikter. Alt arbeid ble støttet av US Army Medical Research og forsyningskommando Command. Denne studien ble gjennomført under en protokoll gjennomgått og godkjent av US Army Medical Research og forsyningskommando Command Institutional Review Board, og i samsvar med godkjent protokollen.
Acknowledgments
Doz støttes av et stipend tildelt fra Genève Foundation. SN ble støttet av en postdoktorstilling Grant fra Pittsburgh Tissue Engineering Initiative.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks BalancedSalt Solution (HBSS) | GIBCO, by Life Technologies | 14175 | Consumable |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | Consumable |
| Collagenase Type II | Sigma-Aldrich | C6685 | Consumable |
| 70-μm nylon mesh filter | BD Biosciences | 352350 | Consumable |
| 100-μm nylon mesh filter | BD Biosciences | 352360 | Consumable |
| MesenPRO Growth Medium System | Invitrogen | 12746-012 | Consumable |
| L-glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | Consumable |
| T75 Tissue Culture Flask | BD Biosciences | 137787 | Consumable |
| Chitosan | Sigma-Aldrich | 448869 | Consumable |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Consumable |
| N-Octanol | Acros Organics | 150630025 | Consumable |
| Sorbitan-Mono-oleate | Sigma-Aldrich | S6760 | Consumable |
| Potassium Hydroxide | Sigma-Aldrich | P1767 | Consumable |
| Acetone | Fisher Scientific | L-4859 | Consumable |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 270741 | Consumable |
| Trinitro Benzenesulfonic Acid | Sigma-Aldrich | P2297 | Consumable |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 320331 | Consumable |
| Ethyl Ether | Sigma-Aldrich | 472-484 | Consumable |
| 8-μm Tissue Culture Plate Inserts | BD Biosciences | 353097 | Consumable |
| 1.5-ml Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | Consumable |
| MTT Reagent | Invitrogen | M6494 | Consumable |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8779 | Consumable |
| Qtracker Cell Labeling Kit (Q tracker 655) | Molecular Probes, Life Technologies | Q2502PMP | Consumable |
| Type 1 Collagen | Travigen | 3447-020-01 | Consumable |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | Consumable |
| 12-Well Tissue Culture Plates | BD Biosciences | 353043 | Consumable |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | Equipment |
| Orbital Shaker | New Brunswick Scienctific | C24 | Equipment |
| Humidified Incubator with Air-5% CO2 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Model 370 | Equipment |
| Overhead Stirrer | IKA | Visc6000 | Equipment |
| Magnetic Stirrer | Corning | PC-210 | Equipment |
| Vacuum Desiccator | - | - | Equipment |
| Particle Size Analyzer | Malvern Instruments | STP2000 Spraytec | Equipment |
| Water Bath | Fisher Scientific | Isotemp210 | Equipment |
| Spectrophotometer | Beckman Coulter Inc. | Beckman Coulter DU800UV/Visible Spectrophotometer | Equipment |
| Vortex | Diagger | 3030a | Equipment |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax M2 | Equipment |
| Light/Fluorescence Microscope | Olympus Corporation | IX71 | Equipment |
| Confocal Microscope | Olympus Corporation | FV-500 Laser Scanning Confocal Microscope | Equipment |
| Scanning Electron Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Leo 435 VP | Equipment |
| Transmission Electron Microscope | JEOL | JEOL 1230 | Equipment |
References
- Krampera, M. Mesenchymal stem cells for bone, cartilage, tendon and skeletal muscle repair. Bone. 39, 678-683 (2006).
- Patrick, C. W. Tissue engineering strategies for adipose tissue repair. Anat. Rec. 263, 361-366 (2001).
- Pountos, I., Giannoudis, P. V. Biology of mesenchymal stem cells. Injury. 36, Suppl 3. S8-S12 (2005).
- Kim, I. Y. Chitosan and its derivatives for tissue engineering applications. Biotechnol. Adv. 26, 1-21 (2008).
- Shi, C. Therapeutic potential of chitosan and its derivatives in regenerative medicine. J. Surg. Res. 133, 185-192 (2006).
- Natesan, S. Adipose-derived stem cell delivery into collagen gels using chitosan microspheres. Tissue Eng. Part. A. 16, 1369-1384 (2010).
- Bubnis, W. A., Ofner, C. M. 3rd The determination of epsilon-amino groups in soluble and poorly soluble proteinaceous materials by a spectrophotometric method using trinitrobenzenesulfonic acid. Anal. Biochem. 207, 129-133 (1992).
- Bornstein, M. B. Reconstituted rattail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes. Lab Invest. 7, 134-137 (1958).
- Benoit, D. S. Integrin-linked kinase production prevents anoikis in human mesenchymal stem cells. J. Biomed. Mater. Res. A. 81, 259-268 (2007).
- Nuttelman, C. R., Tripodi, M. C., Anseth, K. S. Synthetic hydrogel niches that promote hMSC viability. Matrix Biol. 24, 208-218 (2005).
- Shanmuganathan, S. Preparation and characterization of chitosan microspheres for doxycycline delivery. Carbohydr. Polym. 73, 201-211 (2008).
- Haque, T., Chen, H., Ouyang, W., Martoni, C., Lawuyi, B., Urbanska, A., Prakash, S. Investigation of a new microcapsule membrane combining alginate, chitosan, polyethylene glycol and poly-L-lysine for cell transplantation applications. Int. J. Artif. Organs. 28, 631-637 (2005).
- Goren, A., Dahan, N., Goren, E., Baruch, L., Machluf, M. Encapsulated human mesenchymal stem cells: a unique hypoimmunogenic platform for long-term cellular therapy. FASEB J. 24, 22-31 (2010).
- Zielinski, B. A., Aebischer, P. Chitosan as a matrix for mammalian cell encapsulation. Biomaterials. 15, 1049-1056 (1994).
- Girandon, L., Kregar-Velikonja, N., Božikov, K., Barliç, A. In vitro Models for Adipose Tissue Engineering with Adipose-Derived Stem Cells Using Different Scaffolds of Natural Origin. Folia Biol. (Praha). 57, 47-56 (2011).
- Baruch, L., Machluf, M. Alginate-chitosan complex coacervation for cell encapsulation: effect on mechanical properties and on long-term viability. Biopolymers. 82, 570-579 (2006).
- Wei, Y., Gong, K., Zheng, Z., Wang, A., Ao, Q., Gong, Y., Zhang, X. Chitosan/silk fibroin-based tissue-engineered graft seeded with adipose-derived stem cells enhances nerve regeneration in a rat model. J. Mater. Sci. Mater. Med. , (2011).
- Wang, Q., Jamal, S., Detamore, M. S., Berkland, C. PLGA-chitosan/PLGA-alginate nanoparticle blends as biodegradable colloidal gels for seeding human umbilical cord mesenchymal stem cells. J. Biomed. Mater. Res. A. 96, 520-527 (2011).
- Alves da Silva, M. L., Martins, A., Costa-Pinto, A. R., Correlo, V. M., Sol, P., Bhattacharya, M., Faria, S., Reis, R. L., Neves, N. M. Chondrogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells in chitosan-based scaffolds using a flow-perfusion bioreactor. J. Tissue Eng. Regen. Med. , (2010).
- Kang, Y. M., Lee, B. N., Ko, J. H., Kim, G. H., Kang, K. N., Kim da, Y., Kim, J. H., Park, Y. H., Chun, H. J., Kim, C. H., Kim, M. S. In vivo biocompatibility study of electrospun chitosan microfiber for tissue engineering. Int. J. Mol. Sci. 11, 4140-4148 (2010).
- Bozkurt, G., Mothe, A. J., Zahir, T., Kim, H., Shoichet, M. S., Tator, C. H. Chitosan channels containing spinal cord-derived stem/progenitor cells for repair of subacute spinal cord injury in the rat. Neurosurgery. 67, 1733-1744 (2010).
- Leipzig, N. D., Wylie, R. G., Kim, H., Shoichet, M. S. Differentiation of neural stem cells in three-dimensional growth factor-immobilized chitosan hydrogel scaffolds. Biomaterials. 32, 57-64 (2011).
- Altman, A. M., Gupta, V., RÃos, C. N., Alt, E. U., Mathur, A. B. Adhesion, migration and mechanics of human adipose-tissue-derived stem cells on silk fibroin-chitosan matrix. Acta Biomater. 6, 1388-1397 (2010).
- Altman, A. M., Yan, Y., Matthias, N., Bai, X., Rios, C., Mathur, A. B., Song, Y. H., Alt, E. U. IFATS collection: Human adipose-derived stem cells seeded on a silk fibroin-chitosan scaffold enhance wound repair in a murine soft tissue injury model. Stem Cells. 27, 250-258 (2009).
- Machado, C. B., Ventura, J. M., Lemos, A. F., Ferreira, J. M., Leite, M. F., Goes, A. M. 3D chitosan-gelatin-chondroitin porous scaffold improves osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Biomed. Mater. 2, 124-131 (2007).
