Summary
हम अत्यधिक एक फीडर glial सेल परत के उपयोग के बिना शुद्ध जन्म के पूर्व का माउस दिमाग से hippocampal न्यूरॉन्स की संस्कृति के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं.
Abstract
चूहा और murine hippocampal न्यूरॉन्स के प्राथमिक संस्कृतियों का व्यापक रूप से तंत्रिका जीव विज्ञान में सेलुलर तंत्र प्रकट करने के लिए उपयोग किया जाता है. अलग और बढ़ व्यक्तिगत न्यूरॉन्स द्वारा, शोधकर्ताओं सेलुलर तस्करी, सेलुलर संरचना और व्यक्ति प्रोटीन की जैव रासायनिक तकनीकों का एक किस्म का उपयोग स्थानीयकरण से संबंधित गुणों का विश्लेषण कर रहे हैं. ऐसे प्रयोगों के परिणाम से याददाश्त और सीखने के तंत्रिका आधार संबोधित सिद्धांतों के परीक्षण के लिए महत्वपूर्ण हैं. हालांकि, प्रयोगों के इन रूपों से स्पष्ट परिणाम के लिए अन्य मस्तिष्क कोशिका प्रकार के द्वारा न्यूनतम संदूषण के साथ neuronal संस्कृतियों को विकसित करने की क्षमता पर predicated हैं. इस प्रोटोकॉल में, हम विशिष्ट न्यूरॉन और hippocampal ऊतक भ्रूण सावधान विच्छेदन के विकास के लिए डिजाइन के लिए स्वस्थ न्यूरॉन्स के विकास का अनुकूलन जबकि contaminating के सेल प्रकार (यानी astrocytes) कम से कम मीडिया का उपयोग करें. भ्रूण माउस hippocampal ऊतक समान कृंतक di के लिए नमूने के आकार के कारण के ऊतकों की तुलना में अलग करने के लिए मुश्किल हो सकता हैssection. हम भ्रूण 19 दिन (E19) माउस पिल्ले से हिप्पोकैम्पस की विस्तृत विच्छेदन तकनीक बताते हैं. एक बार hippocampal ऊतक अलग है, neuronal कोशिकाओं के कोमल हदबंदी trypsin और यांत्रिक विघटन संयोजी ऊतक से अलग कोशिकाओं के लिए डिज़ाइन की एक कमजोर एकाग्रता के साथ हासिल की है जबकि कम से कम व्यक्ति की कोशिकाओं को नुकसान प्रदान. Pipettes कैसे तैयार करने के विघटन में इस्तेमाल किया जा के एक विस्तृत विवरण शामिल है. इष्टतम चढ़ाना घनत्व इम्युनो - प्रतिदीप्ति सफल सेल संस्कृति को अधिकतम करने के प्रोटोकॉल के लिए प्रदान की जाती हैं. प्रोटोकॉल माउस hippocampal ऊतक से neuronal कोशिकाओं की संस्कृति के लिए एक (लगभग 2 घंटा) तेजी से और कुशल तकनीक प्रदान करता है.
Protocol
1. सेट अप करने के लिए जल का संग्रहण पहले
- के न्यूरॉन फसल के लिए जन्म के पूर्व का पिल्ले उत्पन्न वयस्क चूहे के बीच प्रजनन न्यूरॉन अलगाव के दिन के लिए 19 दिन पूर्व अनुसूची. (C57BL / 6 चूहों की उम्र 2-8 महीने इस प्रोटोकॉल के विकास के प्रयोजनों के लिए matings में इस्तेमाल किया गया है) सफल संभोग गर्भावस्था की पुष्टि महिला घबराहट, या दृश्य में एक योनि प्लग का पता लगाने के द्वारा पुष्टि की जा सकती है.
- न्यूरॉन अलगाव से पहले दिन:
- Immunofluorescence अनुप्रयोगों, कोट 03:01 1 कोलेजन, चूहा पूँछ के एक प्रकाश कोटिंग के साथ एक 24 - अच्छी तरह से थाली में कांच coverslips: पाली - डी Lysine समाधान.
- सेल संस्कृति अनुप्रयोगों के लिए, 03:01 1 कोलेजन, चूहा पूँछ के एक प्रकाश कोटिंग के साथ कोट उचित आकार टिशू कल्चर प्लास्टिक के बर्तन: पाली - डी Lysine समाधान.
- एक यूवी प्रकाश के तहत एक टिशू कल्चर हुड में खुला प्लेटें रात भर आराम करें.
- बाँझ हांक बैलेंस नमक समाधान (HbSS) के साथ प्लेटों से पहले धोउपयोग करने के लिए. लेपित प्लेटें HbSS से भरा जा सकता है और एक सप्ताह तक अंधेरे में 4 ° सी में संग्रहीत.
2. ऊतक हार्वेस्ट
- बाँझपन हमेशा एक कारक है जब प्राथमिक सेल संस्कृतियों बढ़ रही है और इस तरह के रूप में, सबसे बड़ी सावधानी सबसे बाँझ पर्यावरण संभव सुनिश्चित करने के लिए प्रयोग किया जाना चाहिए. बाँझ तकनीक के लिए सावधान ध्यान के साथ, प्रारंभिक विच्छेदन और तंत्रिका ऊतक के इस प्रोटोकॉल के लिए फसल संदूषण के न्यूनतम जोखिम के साथ एक लामिना का प्रवाह हुड के बाहर पूरा किया जा सकता है. प्रारंभिक फसल के बाद, बाद के सभी चरणों का एक सेल संस्कृति के लिए मूल्यांकन किया हुड के भीतर अधिकतम बाँझ शर्तों के तहत आयोजित किया जाना चाहिए.
- लगभग 19 दिन बाद निषेचन में शिरच्छेद द्वारा एक गर्भवती माउस Euthanize के. संज्ञाहरण का उपयोग करने के लिए गर्भवती महिला euthanize संज्ञाहरण मस्तिष्क कोशिका मृत्यु का कारण (Stratmann, एट अल., 2010) के लिए जाना जाता है की सिफारिश नहीं है. बाँझ विदारक कैंची और संदंश का प्रयोग, मध्य - उदर के पक्ष में एक खोलने बनानेमाउस पूरी तरह से शरीर गुहा को प्रकट करने के लिए. उपकरण शराब और एक खुला लौ का उपयोग निष्फल किया जा सकता है.
- जन्म के पूर्व का पिल्ले माउस शरीर गुहा के पीछे की ओर स्थित हो जाएगा और आसानी से गर्भाशय में दिखाई जानी चाहिए. Autoclaved बाँझ संदंश के साथ, गर्भाशय खुला और पिल्ले को हटा दें. ताजा बाँझ कैंची और एक विदारक खुर्दबीन के नीचे जगह हटाया सिर बाँझ धुंध के साथ पिल्ले का सिर काटना. बाँझ, autoclaved उपकरणों लौ शराब और एक खुला लौ पूर्व का उपयोग कर साफ किया और प्रयोग के दौरान हो सकता है.
- बाँझ कैंची या स्केलपेल, गर्दन के पीछे से पिल्ला के खुले नाक को कपाल का उपयोग करना. यह प्रक्रिया आम तौर पर कशेरुका रंध्र में कैंची की एक टिप डालने और फिर पूर्व से आगे बढ़ने से पूरा किया जा सकता है. ध्यान से संदंश साथ पूरे मस्तिष्क को हटा दें. बाँझ धुंध पर मस्तिष्क रखें. एक बाँझ स्केलपेल का उपयोग, सेरिबैलम हटाने और मस्तिष्क के midline काटकर अलग कर देना यह दोनों गोलार्द्धों (चित्रा 1) में अलग है .
- बाँझ संदंश साथ हिप्पोकैम्पस के आसपास के meninges की एक छोटी सी खंड समझ और यह धीरे दूर खींच. हालांकि यह कड़ाई से हिप्पोकैम्पस अलग से पहले तानिका हटाने के लिए आवश्यक नहीं है, meninges की उपस्थिति अधिक झिल्ली की क्रूरता के कारण मुश्किल हिप्पोकैम्पस के विच्छेदन कर सकते हैं. या तो मामले में, हिप्पोकैम्पस और अधिक स्पष्ट रूप से दिखाई तानिका के बाद हटा दिया गया है हो जाएगा. हिप्पोकैम्पस एक घुमावदार संरचना है कि गोलार्द्ध और पेट के बल झुकता है (चित्रा 2) के बाहर का भाग में शुरू होता है. भीतर, अवतल पक्ष (लांगुलिय) के रूप में एक निलय का सामना करना पड़ रहा है, यह पहले से ही मुक्त है. इसलिए, हिप्पोकैम्पस अलग, एक उत्तल बाहरी पक्ष के साथ कटौती की जरूरत है. विच्छेदन के बाद, धीरे बाँझ ऊतक संदंश और हस्तांतरण के साथ गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) एक सेल संस्कृति के हुड के नीचे HbSS के साथ एक छोटे से टिशू कल्चर पकवान में प्रत्येक hippocampi उठा. मस्तिष्क के ऊतकों के कई पिल्ले से जोड़ा जा सकता है.
- एक 100 मिमी टिशू कल्चर पकवान में बाँझ HbSS 3 मिलीलीटर में एक बाँझ स्केलपेल, धीरे क़ीमा मस्तिष्क के ऊतकों का उपयोग करना.
- एक 15 मिलीलीटर चोटीदार ट्यूब के लिए कीमा बनाया हुआ ऊतक और HbSS स्थानांतरण. HbSS के 1.5 मिलीग्राम और 0.25% trypsin 5 मिलीग्राम की कुल मात्रा के समाधान के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें.
- कैप और धीरे ट्यूब मिश्रण करने के लिए 4-5 बार पलटना. बुलबुले उत्पादन से बचने के है पचा ऊतक से जारी डीएनए के रूप में बुलबुले का पालन करना और कीमा बनाया हुआ ऊतक के बजाय ट्यूब के नीचे (चित्रा 3) के लिए बसने के नाव का कारण होगा की कोशिश करो.
- 37 ° सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए hippocampal ऊतक, हर 5 मिनट के ऊपर के रूप में inverting ट्यूब सेते हैं.
- ऊतक ट्यूब के नीचे करने के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं.
- ध्यान से अतिरिक्त एक बाँझ पिपेट का उपयोग कर, ऊतक ट्यूब के नीचे undisturbed छोड़ने के समाधान निकालना.
- HbSS की 5 मिलीलीटर है ऊतक गोली के साथ 5 मिनट के लिए 37 ° C पर धो. कुल 3 बार दोहराएँ. ऊतक पूरी तरह से व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देंधोने के अगले कदम के लिए आगे बढ़ने से पहले हर बार ट्यूब के नीचे करने के लिए.
- ऊतक गोली से अंतिम धो निकालें और ताजा HbSS के 2 मिलीग्राम के साथ बदलें.
4. न्यूरॉन विचूर्णन
- विचूर्णन कदम शुरू करने से पहले आप को आग पॉलिश पाश्चर pipettes तैयार करने की जरूरत होगी. एक बुन्सन बर्नर का प्रयोग, विंदुक खोलने की व्यास आकार और विंदुक खोलने के किनारों में लगभग 0.5 मिमी है थोड़ा गोल (4b चित्रा) जब तक एक बाँझ 9 इंच लौ में पाश्चर विंदुक टिप (चित्र 4a) पकड़. विचूर्णन प्रक्रिया शुरू होने से पहले पूरी तरह से शांत करने के लिए पिपेट की अनुमति दें.
- एक सामान्य बाँझ 9 इंच पाश्चर विंदुक का प्रयोग, धीरे ऊतक कुल 7 बार की एक महीन चुर्ण बनाना. बड़ा ऊतक टुकड़े इस बिंदु पर सामान्य हो रहे हैं और ट्यूब के नीचे करने के लिए अगले चरण पर जाने से पहले बसने की अनुमति दी जानी चाहिए.
- एक ताजा बाँझ 50 मिलीलीटर चोटीदार ट्यूब के लिए स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला.
- शेष सभी बड़े ऊतक टुकड़े ट्यूब के नीचे करने के लिए व्यवस्थित करने के लिए और 4 मिलीलीटर अलग neuronal कोशिकाओं की कुल के लिए पिछले सतह पर तैरनेवाला के साथ सतह पर तैरनेवाला गठबंधन की अनुमति दें.
5. सेल चढ़ाना
- अलग एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं गिनती.
- एक सामान्य नियम के रूप में, एक बार सेल नंबर निर्धारित किया गया है कि अंतिम संख्या से खाते में है कि चढ़ाना के बाद हो सकता है किसी भी कोशिका मृत्यु के लिए 20% घटाना.
- कोशिकाओं नीचे सिफारिशों का उपयोग कर मढ़वाया किया जा सकता है:
एक 24 अच्छी तरह से थाली में coverslips के लिए - 6 10 x 4 कोशिकाओं / अच्छी तरह से 0.5 मिलीग्राम
4 x 10 5 कोशिकाओं / 3 मिलीलीटर में प्लेट 60 मिमी टिशू कल्चर प्लेट
6 x 10 6 कोशिकाओं / 6 मिलीलीटर में थाली - 100 मिमी टिशू कल्चर प्लेटों के लिए - Neurobasal चढ़ाना मीडिया (Neurobasal का संकेत मात्रा के साथ उचित सेल नंबर का मिश्रणB27-अनुपूरक युक्त मीडिया [1 मिलीग्राम / 50 मिलीलीटर], 0.5 मिमी Glutamine समाधान, 25 माइक्रोन ग्लूटामेट (श्री 147.13 छ / mol), पेनिसिलीन (सौ सौ इकाइयों / मिलीलीटर) / स्ट्रेप्टोमाइसिन (10,000 μg / एमएल) [250 μl / 50 मिलीलीटर] , 1mm HEPES (श्री 238.3 छ / mol), 10% हीट निष्क्रिय दाता हार्स सीरम) और प्लेटों के लिए कोशिकाओं को जोड़ने के भंवर प्लेटें धीरे कोशिकाओं को समान रूप से वितरित करने के लिए. उच्च दाता हार्स सीरम में चढ़ाना मीडिया के लिए जोड़ा जाता है विकास के पहले 24 घंटे के दौरान कोशिकाओं समृद्ध है. कोशिकाओं बाद में सीरम से weaned रहे हैं और प्रत्येक मीडिया प्रतिस्थापन पर सीरम के धारावाहिक कमी से सीरम मुक्त वातावरण लौटे. यह भी कहा कि जबकि उच्च सांद्रता में ग्लूटामेट कम यहाँ जोड़ा सांद्रता में neuronal सेल संस्कृतियों के लिए विषाक्त है, यह गैर - neuronal 11 कोशिकाओं के लगाव को बाधित किया जाना चाहिए. लेकिन, यह केवल संस्कृति में पहले 24 घंटे के लिए चढ़ाना मीडिया को जोड़ा जाना चाहिए और बाद में किसी भी दूध पिलाने की मीडिया के बाहर छोड़ दिया कोशिकाओं के न्यूरोटॉक्सिटी को रोकने.
- पीएक 37 डिग्री सेल्सियस में न्यूरॉन्स, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर रातोंरात फीता.
- कोशिकाओं से मीडिया की आधी मात्रा निकालें और जगह Neurobasal दूध पिलाने की मीडिया की एक ही मात्रा (Neurobasal मीडिया B27-अनुपूरक युक्त [1 मिलीग्राम / 50 मिलीलीटर], 0.5 मिमी Glutamine समाधान, पेनिसिलीन (सौ सौ इकाइयों / मिलीलीटर) / स्ट्रेप्टोमाइसिन (10,000 μg / मिलीलीटर) [250 μl / 50 मिलीलीटर], 1 मिमी HEPES (श्री 238.3 छ / mol).
- न्यूरॉन्स हर 4 दिन पुराने मीडिया के आधे से हटाने और यह ताजा Neurobasal दूध पिलाने की मीडिया का एक ही मात्रा के साथ की जगह द्वारा खिलाया जाना चाहिए. Neuronal प्रक्रियाओं 1 दिन (चित्रा 5a) पर दिखाई और 10 दिन (चित्रा 5 ब) द्वारा प्रचलित हो जाते हैं शुरू करना चाहिए.
6. प्रतिनिधि परिणाम
बढ़ने और संस्कृति प्राथमिक neuronal कोशिकाओं की क्षमता तंत्रिका विज्ञान के एक अनिवार्य हिस्सा बन गया है. प्राथमिक संस्कृतियों शोधकर्ता विशिष्ट सेलुलर रास्ते का विश्लेषण करने के लिए अनुमति देते हैं, रासायनिक संशोधन और उपचार, लक्ष्य नियंत्रण रेखाalization और एक नियंत्रित वातावरण में विकास पैटर्न. इन प्रक्रियाओं के कई परिष्कृत पद्धति का उपयोग करने के लिए सेल प्रतिक्रिया में विशिष्ट परिवर्तन कल्पना. इस मामले में hippocampal न्यूरॉन्स के विशिष्ट neuronal रास्ते कि मुश्किल, नामुमकिन नहीं तो बरकरार मस्तिष्क में विश्लेषण साबित होगा अध्ययन किया जाता है. विशिष्ट क्षेत्रों से मस्तिष्क के न्यूरॉन्स के निकट सजातीय आबादी की तैयारी मस्तिष्क समारोह के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है. व्यक्तिगत न्यूरॉन्स में आणविक प्रभाव स्मृति या सीखने के रूप में उच्च आदेश के रास्ते का वर्णन करने में सहायक हो सकता है. इस प्रोटोकॉल के रूप में पैदावार hippocampal न्यूरॉन्स के अपेक्षाकृत शुद्ध संस्कृतियों, glial कोशिकाओं की एक फीडर परत की आवश्यकता के बिना, इन न्यूरॉन्स immunofluorescence पढ़ाई के लिए आसानी से उपयोग कर रहे हैं. हालांकि, के रूप में अनेक प्रकार की कोशिकाओं से युक्त अंगों से सभी प्राथमिक संस्कृति के साथ, कम वांछित कोशिकाओं द्वारा कुछ संक्रमण हो सकता है. Neuronal कोशिकाओं के अलगाव में glial कोशिकाओं द्वारा संक्रमण एक आम समस्या हो सकता है. Glial कोशिकाओं गएक आसानी से संस्कृति का सूक्ष्म दृश्य पर पाया जा सकता है के रूप में उनकी आकारिकी लक्ष्य न्यूरॉन्स (चित्रा 6) से काफी अलग है. glial सेल संदूषण के प्रभाव संस्कृतियों की योजना बनाई उपयोग पर निर्भर करेगा. यदि कोशिकाओं इम्युनो-प्रतिदीप्ति परीक्षा के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है, glial संदूषण एक असुविधा से अधिक कुछ नहीं हो सकता है जब व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की तस्वीर की कोशिश कर सकते हैं. हालांकि, अगर neuronal संस्कृतियों के लिए जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा रहे हैं, glial कोशिकाओं द्वारा किसी भी महत्वपूर्ण संदूषण परिणामों में बड़े बदलाव का कारण सकता है. Glial सेल संदूषण का पता करने के लिए तरीके और चर्चा में रेखांकित कर रहे हैं.
न्यूरॉन्स एक बार सफलतापूर्वक किया गया है अलग है और संस्कृति में विकसित, एक ठेठ आवेदन इम्युनो - प्रतिदीप्ति तकनीक सेलुलर प्रक्रियाओं की जांच करना है. 7 चित्रा में सचित्र, organelles, mitochondria के रूप में, महत्वपूर्ण संस्कृति मीडिया से पहले ठीक करने के रंगों का उपयोग कर कलंकित किया जा सकता हैसमझना. अंतर्जात सेलुलर प्रोटीन तय मानक इम्युनो - प्रतिदीप्ति तकनीक (चित्रा 8) का उपयोग कोशिकाओं से देखे जा सकते हैं. एक बार neuronal कोशिकाओं तय कर रहे हैं, हित के प्रोटीन के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी सेल करने के लिए शुरू किया जा सकता है और इन प्रोटीनों एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग कल्पना किया जा सकता है. सभ्य न्यूरॉन्स भी मतलब के साथ अनुसंधानकर्ता प्रदान है neuronal कार्यों पर अलग - अलग प्रोटीन के प्रभाव की जांच. डीएनए transfections, electroporation या वायरल पारगमन सहित तकनीक की एक किस्म का प्रयोग, प्रोटीन neuronal कोशिकाओं (9 चित्रा) में overexpressed जा सकता है. कैसे तंत्रिका कोशिकाओं से अधिक व्यक्त प्रोटीन के प्रभाव का जवाब कैसे मस्तिष्क जवाब हो सकता है पर प्रत्यक्ष अनुमान है और नशीली दवाओं के उपचार के लिए सेलुलर लक्ष्य की पहचान करने की संभावना की पेशकश कर सकते हैं. प्रयोगों के इन प्रकार के विवरण इस कागज के दायरे से परे जाना, लेकिन वे उदाहरण देकर स्पष्ट करना है कि इस तकनीक द्वारा तैयार संस्कृतियों के नीचे है की एक विस्तृत सरणी के लिए उपयुक्त हैंtream अनुप्रयोगों. हालांकि, इस प्रोटोकॉल के समग्र सादगी के रूप में अच्छी तरह के रूप में, कम समय के इन neuronal संस्कृतियों तैयार करने की आवश्यकता अवधि आज तंत्रिका विज्ञान प्रयोगशाला में प्रयोग के लिए एक आदर्श तरीका है.
चित्रा 1 जन्म के पूर्व का माउस मस्तिष्क के विच्छेदन. पहले चीरा नीचे दो गोलार्द्धों में अलग मस्तिष्क के midline है.
चित्रा 2 जन्म के पूर्व का माउस मस्तिष्क में हिप्पोकैम्पस के स्थान. striatum अलग ले जाया जाता है हिप्पोकैम्पस कल्पना और घुमावदार "मूंग" प्रत्येक गोलार्द्ध के बाहर का क्षेत्र में प्रकार संरचना ने कहा है.
चित्रा 3 trypsin समाधान में hippocampal ऊतक की हदबंदी.
चित्रा 4. पाश्चर विंदुक युक्तियाँ में hippocampal ऊतक के विचूर्णन में प्रयोग किया जाता है. (क) सामान्य पाश्चर विंदुक टिप. (ख) आग पॉलिश पाश्चर विंदुक टिप. गोल किनारों और विंदुक खोलने आकार में लगभग 50% कमी को ध्यान में ले लो.
संख्या 5 hippocampal न्यूरॉन्स इस प्रक्रिया और नायब मीडिया में चढ़ाया का उपयोग अलग है. (क) सेल विकास के 1 दिन बाद चढ़ाना. Neuronal प्रक्रियाओं के दिन 1 के दौरान दिखाई शुरू करते हैं. (ख) सेल विकास 10 दिन बाद चढ़ाना, neurites branched है और कर रहे हैं अतिव्यापी.
चित्रा 6 hippocampal न्यूरॉन्स glial 7 दिनों के लिए विकसित कोशिकाओं के साथ दूषित और organelle मार्कर MitoTracker लाल (Invitrogen M7515) मुख्यमंत्री - H2XRos और transfe के साथ दाग.GFP-LC3 साथ cted 2000 Lipofectamine (Invitrogen 11,668,019) का उपयोग कर. Mitochondria सभी कोशिकाओं में दिखाई दे लेकिन केवल एक न्यूरॉन फ्लोरोसेंट निर्माण के साथ सफलतापूर्वक ट्रांसफ़ेक्ट किया गया हैं. Glial कोशिकाओं के साथ संदूषण GFP-LC3 neuronal कल्पना मुश्किल प्रक्रियाओं में अभिव्यक्ति का विश्लेषण करता है.
चित्रा 7. Hippocampal न्यूरॉन्स 7 दिनों के लिए हो और organelle मार्कर MitoTracker लाल मुख्यमंत्री - एच 2 XRos (Invitrogen M7513 #) के साथ दाग है. यह महत्वपूर्ण डाई टिशू कल्चर कोशिकाओं में सक्रिय mitochondria के दाग के लिए प्रयोग किया जाता है. कोशिकाओं 4% paraformaldehyde की / पीबीएस में तय किया गया और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना. डाई ही गैर फ्लोरोसेंट है जब तक mitochondria में ऑक्सीकरण. सक्रिय mitochondria के neuronal प्रक्रियाओं के दौरान देखा जा सकता है.
संख्या 8.
9 चित्रा. Hippocampal neuronal संस्कृतियों 5 दिनों के लिए बड़े हो रहे थे और GFP LC3β डीएनए के साथ ट्रांसफ़ेक्ट के 2000 Lipofectamine (# Invitrogen 11,668,019) का उपयोग करते हुए निर्माण. 7 दिन में कोशिकाओं के GFP टैग उनके बाहरी झिल्ली में शामिल LC3β साथ 4% paraformaldehyde की / पीबीएस और aggresomes के कल्पना का उपयोग फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर रहे थे तय किया गया. Aggresomes सेल शरीर और neurites भर में स्थित हैं और तीर के साथ चिह्नित कर रहे हैं.
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Discussion
Hippocampal संस्कृतियों 20 से अधिक वर्षों के लिए किया गया है आण्विक जीव विज्ञान में प्रयोग किया जाता है. सिद्धांत रूप में है, जबकि, neuronal संस्कृतियों के मस्तिष्क के किसी भी हिस्से से किया जा सकता है, hippocampal संस्कृतियों के लिए सबसे लोकप्रिय 7 हिप्पोकैम्पस में तंत्रिका कोशिका जनसंख्या के अपेक्षाकृत सरल वास्तुकला के कारण हो सिद्ध कर दिया है. Hippocampal संस्कृतियों आम तौर पर देर चरण भ्रूण ऊतक से बना रहे हैं. इस ऊतक के लिए अलग कर देना आसान है और कम glial कोशिकाओं से परिपक्व मस्तिष्क 1 ऊतक करता है. भ्रूण ऊतक से hippocampal न्यूरॉन्स के अलगाव भी कर्तन axons और dendrites कम आसंजन 3 संपर्कों के कारण नुकसान कम हो जाती है. जबकि hippocampal संस्कृतियों हिप्पोकैम्पस के अपेक्षाकृत आसान अलगाव के कारण चूहों से सबसे अधिक बार उत्पन्न कर रहे हैं, चूहे भी एक ही प्रोटोकॉल के साथ प्रयोग किया जा सकता है अगर उचित देखभाल ऊतक अलगाव के दौरान लिया जाता है. एक बार न्यूरॉन्स सुसंस्कृत, उन्नत आणविक तकनीक का उपयोग करने के लिए subcellular एल का विश्लेषण करने की क्षमताocalization और तस्करी नियोजित किया जा सकता है. यह विशेष रूप से लाभप्रद हो सकता है जब भ्रूण घातक ट्रांसजेनिक चूहों का विश्लेषण कर सकते हैं के रूप में यह प्रोटीन बातचीत है कि भ्रूण की मौत में परिणाम होगा अध्ययन करने की क्षमता प्रदान करता है.
यह हिप्पोकैम्पस दोनों स्थानिक और प्रासंगिक 5 सीखने और 6 स्मृति में फंसा दिया गया है. हिप्पोकैम्पस से प्राथमिक संस्कृतियों के विकास subcellular जैविक घटनाओं और मस्तिष्क के लिए सीखने और याद करने की क्षमता पर उनके प्रभाव के बीच एक संबंध की अनुमति कर सकते हैं.
सभी तंत्रिका कोशिकाओं के साथ के रूप में, hippocampal संस्कृतियों से बड़े न्यूरॉन्स में महत्वपूर्ण वृद्धि कारक, हार्मोन और एमिनो एसिड की आवश्यकता है. दिमाग में, इन कारकों glial कोशिकाओं द्वारा प्रदान की जाती हैं. यह सहजीवी रिश्ते भी सभ्य न्यूरॉन्स के साथ glial कोशिकाओं का एक "फीडर" परत बढ़ द्वारा एक संस्कृति के वातावरण में किया जा सकता है. हालांकि, glial कोशिकाओं को भी उनकी उम्र 11 w के दौरान साइटोटोक्सिक कारकों का उत्पादन होगाhich सभ्य न्यूरॉन्स को विषाक्त हो सकता है. इस दरकिनार करने के लिए, न्यूरॉन्स Neurobasal B27 के साथ पूरक माध्यम के रूप में सीरम मुक्त मीडिया में हो गए हैं. B27 पूरक hippocampal न्यूरॉन्स के अस्तित्व के लिए अनुकूलित है लेकिन अन्य neuronal 4 के रूप में अच्छी तरह से संस्कृतियों के विकास का समर्थन करेंगे. एल glutamine के ऊर्जा उत्पादन और सेल संस्कृति में प्रोटीन संश्लेषण के लिए एक आवश्यक अमीनो एसिड है. हालांकि, glutamine के समय के साथ अस्थायी, अमोनिया और कार्बोक्जिलिक एसिड संस्कृति मीडिया के लिए एक बार जोड़ा byproducts में अपमानजनक हो सकता है. Glutamax, Invitrogen से एक सेल संस्कृति के पूरक, एल glutamine के लिए एक सीधा विकल्प अगर वांछित के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. Glutamax अधिक मीडिया में स्थिर है, लेकिन थोड़ा और अधिक महंगा है. सीरम मुक्त मीडिया में न्यूरॉन्स की वृद्धि neuronal विकास और भेदभाव पर विकास और कारकों हार्मोन के प्रभाव के अध्ययन की अनुमति देता है.
हम माउस प्रसव पूर्व भ्रूण से hippocampal न्यूरॉन्स Neurobasal मीडिया का उपयोग तेजी से अलगाव और B27 supplem के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुतन्यूरॉन्स की एक सीरम मुक्त वातावरण में वृद्धि के लिए फीडर कोशिकाओं के उपयोग के बिना ईएनटी. सभी सुसंस्कृत प्राथमिक सेल प्रोटोकॉल के साथ के रूप में, यह गैर वांछित सेल प्रकार (यानी glial कोशिकाओं) की वृद्धि को कम करने के लिए फायदेमंद है. यह सबसे हिप्पोकैम्पस के मस्तिष्क के आसपास के क्षेत्रों से सावधान विच्छेदन के द्वारा आसानी से पूरा किया है. जन्म के पूर्व का कोशिकाओं को भी इस लक्ष्य में सहायता glial कोशिकाओं की एक अपेक्षाकृत छोटी संख्या में होते हैं. हालांकि, glial सेल संदूषण अभी भी हो सकता है. यह संभव है करने के लिए साइटोसिन arabinoside (AraC) के साथ इलाज के द्वारा 8,9 संस्कृति में जल्दी समय बिंदुओं पर glial सेल प्रदूषण को कम. गैर neuronal कोशिकाओं के डीएनए संश्लेषण में सक्षम जनसंख्या को कम करने के लिए AraC विरोधी mitotic एजेंट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, न्यूरॉन्स पर उपचार के संभावित विषाक्त प्रभाव से बचने के लिए, यह इसकी सबसे कम करता है (5 सुक्ष्ममापी) के प्रभावी इस्तेमाल किया जाना चाहिए और 11 संस्कृति के 3-4 दिनों के बाद नहीं जोड़ा. एक अन्य विकल्प (FUdR) दिसम्बर के लिए 5 - फ्लोरो उपचार - 2'-deoxyuridine का उपयोग होगातंतुप्रसू संबंधी प्रतिक्रियाशील microglial 10 कोशिकाओं का अनुपात rease.
एक बार काटा, hippocampal ऊतक एक पतला trypsin पक्षपाती कोशिकाओं को अलग कर देना / विसमूहन समाधान के साथ इलाज किया जा सकता है. हालांकि, लंबे समय तक से trypsin की उच्च सांद्रता जोखिम सेल उपसंस्कृति के लिए हानिकारक हो सकता है तो trypsin समाधान में समय के सबसे अक्सर 3-5 मिनट के बीच तक ही सीमित है सकते हैं. इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता trypsin की जलमिश्रित एकाग्रता की लंबी बार एंजाइम ऊष्मायन व्यक्तिगत सेलुलर विसंघटन के वृद्धि करने की अनुमति है लेकिन देखभाल करने के लिए सख्ती से समय प्रदान की अंक के पालन के लिए लिया जाना चाहिए. Papain एक वैकल्पिक एंजाइम के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है और अधिक प्रभावी और कम रेटिना 10 न्यूरॉन्स के रूप में कुछ ऊतकों के साथ विनाशकारी साबित हो गया है.
सेल हदबंदी ऊतक की विचूर्णन को द्वारा पीछा किया जाता है. यह लगातार neuronal संस्कृति में सबसे महत्वपूर्ण कदम साबित हो गया है और दो महत्वपूर्ण poin से प्रकाश डाला हैटीएस. सबसे पहले, दो बाँझ पाश्चर pipettes इस प्रक्रिया के दौरान इस्तेमाल किया जाता है. पहले निहायत / ऊतक सेलुलर संघ के बाधित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. यह पहली विंदुक खोलने आकार 1.0-1.5 मिमी के बीच होना चाहिए. विक्रेता पैकेज से सीधे pipettes सावधान चयन आमतौर पर यह पहली विचूर्णन के लिए उचित pipettes में परिणाम कर सकते हैं. 2 पाश्चर विंदुक प्रयोग किया जाता है एक लेम्प बर्नर पर "आग पॉलिश" खोलने के व्यास में लगभग 0.5 मिमी आकार को कम करने के लिए. यह भी "चमकाने" एक चिकनी सतह कोशिकाओं को यांत्रिक क्षति को कम करने के रूप में वे के माध्यम से पारित करने के लिए खोलने की अंगूठी गिलास में परिणाम है. दूसरे, / विंदुक के माध्यम से गति विचूर्णन के बल के प्रमुख महत्व है. के रूप में पूरे ऊतक कोशिकाओं से अलग कर देना, वे अधिक नाजुक पाठ्यक्रम के हैं. इस प्रकार, इस बिंदु के रूप में किसी न किसी "उपचार neuronal कोशिकाओं के अस्तित्व के लिए हानिकारक होगा. विंदुक के माध्यम से एक सुसंगत लेकिन फर्म प्रवाह दर पर trypsinized ऊतक passaged किया जाना चाहिए. वें द्वारा एक आम गलतीई शोधकर्ता पूरी तरह से ऊतक को अलग जब तक वहाँ कोई प्रत्यक्ष शेष संरचना करने का विचार है. ज्यादातर मामलों में, यह बड़े पैमाने पर neuronal मौत में परिणाम के रूप में कोशिकाओं को भी दोहराया यांत्रिक हेरफेर द्वारा क्षतिग्रस्त किया जा जाएगा. समय का संकेत संख्या विंदुक के माध्यम से ऊतक को पारित न्यूरॉन्स की पर्याप्त संख्या में आबादी के लिए सकल नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप के बिना परिणाम होगा.
एक बार कोशिकाओं को अलग किया गया है और जमा, एक Trypan ब्लू कोशिकाओं के एक नि: शेष भाजक के दाग रहते हैं की मृत कोशिकाओं को एक अनुपात प्रदान करेगा. आमतौर पर, कक्षों की 75-80% फसल प्रक्रिया जीवित है और चढ़ाना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Trypan ब्लू धुंधला हो जाना भी एक सटीक सेल गिनती जब एक hemocytometer पर किया प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अभ्यास में, एक बार कुल सेल गिनती हासिल की है, कुल 20% जोड़ सकते हैं और कोशिका मृत्यु की अनुमानित राशि के लिए खाते में चढ़ाना के लिए कि सेल नंबर का उपयोग करें. ऊपर प्रोटोकॉल में प्रदान की संख्या एक अच्छा शुरूएनजी बिंदु न्यूरॉन्स के घनत्व अच्छा प्राप्त करने के लिए. यदि न्यूरॉन घनत्व भी से चढ़ाना कम है, सेल के विकास होने की संभावना के रूप में चढ़ाना घनत्व सेल जनसंख्या के प्रसार में एक महत्वपूर्ण चर है नहीं होगा पर्याप्त. कोशिकाओं हर चार दिनों B27/Neurobasal फ़ीड मीडिया के साथ खिलाया जाना चाहिए. इन परिस्थितियों में neuronal विकास संस्कृति में 10-14 दिनों के लिए आसानी से कर सकते हैं बाहर ले जाने और न्यूरॉन्स 2 प्रचार संस्कृति में 30 दिनों के लिए जब 80 कोशिकाओं / 2 मिमी पर वरीयता प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम पांडुलिपि तैयार करने में उसकी मदद के लिए धन्यवाद डॉ. माइकल Wooten. इस काम में एनआईएच 2RO1NS033661 (MWW) द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat Tail Collagen 1 | BD Biosciences | 354236 | |
| Poly-D-lysine Solution | Chemicon | A-003-E | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175-095 | |
| Trypsin Solution (1X) 0.25%, liquid | Invitrogen | 15050-065 | |
| NeuroBasal Medium (1X) liquid | Invitrogen | 21103-049 | |
| B27 Supplement (50X) liquid | Invitrogen | 17504-044 | |
| L-Glutamine 200 mM (100X) liquid | Invitrogen | 25030-149 | |
| Penicillin (10,000 units/ml) / Streptomycin (10,000 μg/ml) | Invitrogen | 15140-148 | |
| HI-Donor Horse Serum | Atlanta Biologicals | S12150H |
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