Isolering og kultur hippocampus Nerveceller fra Prenatal Mus

Summary

Vi tilbyr en protokoll for kultur høyt renset hippocampus nevroner fra prenatal mus hjerner uten bruk av en mater glial celle laget.

Abstract

Primære kulturer av rotter og murine hippocampus nevroner er mye brukt til å avsløre cellulære mekanismene i nevrobiologi. Ved å isolere og voksende enkelte nevroner, forskerne er i stand til å analysere egenskaper knyttet til mobilnettet menneskehandel, cellestruktur og individuell protein lokalisering ved hjelp av en rekke biokjemiske teknikker. Resultater fra slike eksperimenter er kritiske for å teste teorier adressering det nevrale grunnlaget for hukommelse og læring. Imidlertid er entydige resultater fra disse formene for eksperimentene betinget av evnen til å vokse nevrale kulturer med minimum forurensning av andre hjernen celletyper. I denne protokollen, bruker vi spesifikke mediet er laget for neuron vekst og forsiktig disseksjon av embryonale hippocampus vev for å optimalisere veksten av sunne nevroner samtidig som forurensende celletyper (dvs. astrocytes). Embryonale mus hippocampus vev kan være vanskeligere å isolere enn tilsvarende gnager vev på grunn av størrelsen av utvalget for dissection. Vi viser detaljerte disseksjon teknikker av hippocampus fra embryonale dag 19 (E19) mus valper. Når hippocampus vev er isolert, er skånsom dissosiasjon av nevrale celler oppnådd med en fortynnet konsentrasjon av trypsin og mekanisk avbrudd for å separere celler fra bindevev samtidig som det gir minst skade på individuelle celler. En detaljert beskrivelse av hvordan å forberede pipetter skal brukes ved forstyrrelser er inkludert. Optimale plating tettheter er gitt for immuno-fluorescens protokoller for å maksimere vellykket cellekultur. Protokollen gir en rask (ca. 2 timer) og effektiv teknikk for kulturen i nevrale celler fra mus hippocampus vev.

Protocol

1. Sett opp Før Harvest

1. For å generere prenatal valper for nevron høst, planlegge avl mellom voksne mus 19 dager før den dagen neuron isolasjon. (C57BL / 6 mus aldre 2-8 måneder ble brukt i parringer med henblikk på å utvikle denne protokollen). Vellykket parring kan bekreftes ved påvisning av en vaginal plugg i den kvinnelige, hjertebank eller visuell bekreftelse av svangerskapet.
2. Dagen før neuron isolasjon:
   1. For immunfluorescens applikasjoner, jakke glass Dekkglass i en 24-brønns plate med et tynt lag på 3:1 Kollagen 1, Rotte Hale: Poly-D-Lysine løsning.
   2. For cellekultur applikasjoner, frakk passende størrelse vevskultur plast ware med et tynt lag på 3:1 Kollagen 1, Rotte Hale: Poly-D-Lysine løsning.
3. Hvil platene avdekket i en vevskultur hette under en UV lys over natten.
4. Vask platene med steril Hank saldo Salt Solution (HBSS) førå bruke. Malte plater kan fylles med HBSS og lagres i opp til en uke ved 4 ° C i mørket.

2. Tissue Harvest-

1. Sterilitet er alltid en faktor når det vokser primære cellekulturer og som sådan, bør den største forsiktighet utvises for å sikre mest mulig sterilt miljø mulig. Med nøye oppmerksomhet på steril teknikk, kan initial disseksjon og høsting av nevrale vev for denne protokollen være gjennomført utenfor en laminær hette med minimal risiko for forurensning. Etter første høsting, bør alle etterfølgende trinn skal utføres under maksimal sterile forhold innenfor en hette vurdert for cellekultur.
2. Avlive en gravid mus på ca 19 dager etter befruktning ved halshogging. Bruk av anestesi til avlive den gravide kvinnen er ikke anbefalt som anestesi er kjent for å forårsake hjerne celledød (Stratmann, et al., 2010). Bruke sterile dissekere saks og pinsetter, lage en åpning i midten av ventrale siden avmus til helt åpenbare kroppens hulrom. Instrumenter kan steriliseres ved hjelp av alkohol og en åpen flamme.
3. Prenatal valper vil bli plassert mot bakre av musens kroppens hulrom og bør være lett synlig i livmoren. Med autoklaveres steril tang, åpne livmoren og fjerne valper. Halshugge unger med friske steril saks og sted fjernet hodet på steril kompress under en dissekere mikroskop. Sterile autoklaveres instrumenter kan være flamme rengjøres ved hjelp av alkohol og en åpen flamme før og under bruk.
4. Bruk steril saks eller skalpell, åpne kraniet av valp fra baksiden av halsen til nesen. Denne prosedyren kan normalt gjennomføres ved å sette en spiss av saksen inn i vertebralis foramen og deretter fortsetter fremover. Fjern forsiktig hele hjernen med tang. Plasser hjernen på steril kompress. Ved hjelp av en steril skalpell, fjerne lillehjernen og Incise ned midtlinjen av hjernen for å skille det i to halvkuler (Figur 1) .
5. Ta tak i en liten del av hjernehinnene som omgir hippocampus med steril tang og trekk den forsiktig bort. Selv om det ikke er strengt nødvendig for å fjerne hjernehinnene før isolere hippocampus, kan tilstedeværelsen av hjernehinnene gjør disseksjon av hippocampus mer vanskelig på grunn av seighet av membranen. I begge tilfeller vil hippocampus være mer tydelig etter at hjernehinnene har blitt fjernet. Hippocampus er en buet struktur som starter i den distale delen av halvkulen og bøyer ventrally (figur 2). Som indre, konkav, side (kaudal) står overfor en ventrikkel, er det allerede gratis. Derfor, for å isolere hippocampus, må man kutte langs den konvekse yttersiden. Etter disseksjon, forsiktig løfte hver hippocampi med sterile vev tang og overføre til en liten vev kultur parabolen med oppvarmet (37 ° C) HBSS under en cellekultur hette. Hjernevev kan kombineres fra flere valper.

"> 3. Tissue Dissosiasjon

1. Ved hjelp av en steril skalpell, forsiktig hakke hjernevev i 3 ml sterilt HBSS i en 100 mm Tissue Culture parabolen.
2. Overfør kvernet vev og HBSS til en 15 ml konisk rør. Tilsett 1,5 ml HBSS og 0,5 ml av 0,25% Trypsin løsning til et totalvolum på 5 ml.
3. Cap og forsiktig Snu røret 4-5 ganger for å blande. Prøv å unngå produsere bobler som DNA frigjort fra fordøyd vev vil følge de bobler og forårsake kvernet vev til å flyte i stedet for å bosette til bunnen av røret (figur 3).
4. Inkuber hippocampus vev ved 37 ° C i 15 minutter, snu røret som ovenfor hvert 5. minutt.
5. La vev å bosette til bunnen av røret.
6. Fjern forsiktig overflødig løsning ved hjelp av en steril pipette, forlater vevet uforstyrret på bunnen av røret.
7. Vask vev pellet med 5 ml HBSS ved 37 ° C i 5 minutter. Gjenta totalt 3 ganger. Tillat vev helt bosettetil bunnen av røret hver gang før du går videre til neste vasketrinn.
8. Ta den siste vask fra vevet pellet og erstatte med 2 ml av friske HBSS.

4. Neuron Trituration

1. Før du begynner trituration trinnene, må du forberede brann polerte Pasteurs pipetter. Ved hjelp av en Bunson brenner, holder en steril 9 tommer Pasteur pipette (figur 4a) i flammen til diameteren på pipetten åpningen er ca 0,5 mm i størrelse og kanter av pipetten åpningen er avrundet litt (figur 4b). Tillat pipette avkjøles helt før du starter trituration prosessen.
2. Ved hjelp av en normal steril 9 tommer Pasteur pipette, forsiktig triturate vevet totalt 7 ganger. Større vev brikkene er vanlig på dette punktet, og bør få lov til å bosette til bunnen av røret før han flyttet til neste trinn.
3. Overfør supernatanten til en frisk steril 50 ml konisk rør.
4. Tillat alle gjenværende større vev stykker å bosette til bunnen av røret, og kombinerer supernatant med den forrige supernatanten for totalt 4 ml dissosiert nevronale celler.

5. Cell Plettering

1. Tell dissosiert celler ved hjelp av en hemocytometer.
2. Som en generell regel, når celle tall har blitt bestemt, trekke 20% fra det endelige tallet for å registrere eventuell celledød som kan oppstå etter plating.
3. Celler kan belagt med anbefalingene nedenfor:
   For Dekkglass i en 24 godt plate - 6 x 10 ⁴ celler / brønn i 0,5 ml
   For 60 mm vevskulturstudier plater - 4 x 10 ⁵ celler / plate i 3 ml
   For 100 mm vevskulturstudier plater - 6 x 10 ⁶ celler / plate i 6 ml
4. Bland passende celle tall med angitte volum av Neurobasal Kontaktflate Media (NeurobasalMedia inneholder B27 Supplement [1 ml / 50 ml], 0,5 mm Glutamin Solution, 25 mM Glutamat (Mr 147,13 g / mol), Penicillin (10.000 enheter / ml) / Streptomycin (10.000 mikrogram / ml) [250 mL / 50 ml] , 1mm HEPES (Mr 238,3 g / mol), 10% Heat Inaktivert Donor hest serum) og legge celler til platene. Swirl platene forsiktig for å fordele celler jevnt. HI-Donor Horse Serum er lagt til plating Media å berike cellene i løpet av de første 24 timene av vekst. Cellene er senere avvent fra serum og returneres til en Serum-Free miljøet ved seriell reduksjon av serum ved hver media erstatning. Det bør også bemerkes at mens glutamat ved høyere konsentrasjoner er giftig for nevronale cellekulturer, ved lavere konsentrasjoner lagt her, vil det hemme feste av ikke-nevronale celler ^11. Imidlertid bør det bare legges til plating media for de første 24 timene i kultur og deretter til venstre ut av eventuelle Feeding Media for å hindre nevrotoksisitet av cellene.
5. Pblonder nevroner i en 37 ° C, 5% CO ₂ inkubator over natten.
6. Ta halvparten av volumet av media fra cellene og erstatte med samme volum av Neurobasal Fôring Media (Neurobasal Media inneholder B27 Supplement [1 ml / 50 ml], 0,5 mm Glutamin Solution, Penicillin (10.000 enheter / ml) / Streptomycin (10.000 mikrogram / ml) [250 mL / 50 ml], 1 mm HEPES (Mr 238,3 g / mol).
7. Nerveceller skal fôres hver 4. dag ved å fjerne halvparten av de gamle mediene og erstatte den med det samme volumet av fersk Neurobasal Fôring media. Nevrale prosesser bør begynne å være synlig på dag 1 (figur 5a) og bli utbredt med Day 10 (figur 5b).

6. Representative Resultater

Evnen til å vokse og kultur primære nevrale celler har blitt en uunnværlig del av nevrovitenskap. Primær kulturer tillater forskeren å analysere spesifikke cellulære veier, kjemisk modifikasjon og behandling, målet localization og vekst mønstre i et kontrollert miljø. Mange av disse prosedyrene utnytte avansert metode for å visualisere konkrete endringer i celle responser. I dette tilfellet er hippocampus neurons brukes til å studere spesifikke nervebaner som ville vise seg vanskelig, om ikke umulig å analysere i den intakte hjerne. Utarbeidelse av nær homogene populasjoner av nerveceller fra bestemte områder av hjernen er avgjørende for å studere hjernens funksjon. Molekylære effekter i enkelte nerveceller kan være medvirkende for å kartlegge høyere ordens trasé for eksempel minne eller læring. Som denne protokollen gir relativt rene kulturer av hippocampus nevroner, uten behov for en mater lag av gliacellene, er disse nevronene lett utnyttes til immunfluorescens undersøkelser. Men som med alle primære kultur fra organer som inneholder flere celletyper, kan noen forurensning av mindre ønskede celler oppstår. Isolert av nevrale celler, kan forurensning ved gliacellene være et vanlig problem. Gliacellene cen lett oppdages ved mikroskopisk visualisering av den kulturen som sin morfologi skiller seg vesentlig fra målet nevronene (figur 6). Virkningen av glial celle forurensning vil avhenge av den planlagte bruken av kulturer. Hvis cellene blir brukt for immuno-fluorescens eksamen, kan glial forurensning være noe mer enn en ulempe når du prøver å fotografere enkelte nerveceller. Men hvis neuronal kulturer skal brukes for biokjemisk analyse, kunne noen vesentlig forurensning av gliacellene medføre store endringer i resultatene. Måter å løse glial celle forurensning er beskrevet ytterligere i diskusjonen.

Når nevroner har blitt isolert og dyrket i kultur, er en typisk program for å undersøke cellulære prosesser immuno-fluorescens teknikker. Som illustrert i figur 7, kan organeller som mitokondrier, som skal farges ved hjelp av vitale fargestoffer lagt til kultur media før fikseasjon. Endogene cellulære proteiner kan visualiseres fra faste celler ved hjelp av standard immuno-fluorescens teknikker (Figur 8). Når nevronale celler er løst, kan spesifikke antistoffer for proteiner av interesse bli introdusert til cellen og disse proteinene kan visualiseres ved hjelp av en fluorescens mikroskop. Kulturperler nevronene også gi forsker med midler til å undersøke individuelle protein effekter på nevrale funksjoner. Ved hjelp av en rekke teknikker, inkludert DNA transfections og electroporation eller viral transduksjon, kan proteiner bli overexpressed i nevrale celler (figur 9). Hvordan nevrale celler reagerer på effektene av over-uttrykk proteiner kan ha direkte slutninger om hvordan hjernen kan reagere og tilbyr muligheten for å identifisere cellulære mål for medikamentell behandling. Detaljene i disse typer eksperimenter går utenfor rammen av dette papiret, men de illustrerer at kulturer utarbeidet av denne teknikken er egnet for et bredt spekter av ned-stream applikasjoner. Men den generelle enkelhet av denne protokollen, samt den korte tidsperioden er nødvendig for å forberede disse nevrale kulturene gjør dette en ideell metode for bruk i dagens nevrovitenskap laboratorium.

Figur 1. Dissection av prenatal musen hjernen. Den første innsnitt er nede midtlinjen i hjernen skiller det i to halvkuler.

Figur 2. Plassering av hippocampus i prenatal mus hjernen. Striatum blir flyttet til side for å visualisere hippocampus og er kjent av den buede "nyre bønne" type struktur i distale regionen hver halvkule.

Figur 3. Dissosiasjon av hippocampus vev i trypsin løsning.

Figur 4. Pasteurs pipettespisser brukt i trituration av hippocampus vev. (A) Normal Pasteur pipette tips. (B) Brann-polert Pasteur pipette tips. Ta notat av avrundede kanter og omtrentlig 50% reduksjon i pipette åpningen størrelse.

Figur 5. hippocampus nevroner isolert ved hjelp av denne prosedyren og belagt i NB Media. (A) Cellevekst en dag etter plating. Nevrale prosesser begynner å bli synlig i løpet av dag 1. (B) Cellevekst 10 dagers post-plating, er neurites forgrenet og overlappende.

Figur 6. Hippocampus nevroner forurenset med gliacellene dyrket i 7 dager og farget med organeller markør MitoTracker Red CM-H2XRos (Invitrogen # M7515) og transfected med GFP-LC3 hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen # 11668019). Mitokondrier er synlig i alle celler imidlertid bare en enkelt nervecelle ble vellykket tilført med fluorescerende konstruksjon. Forurensning med gliacellene gjør analyse av GFP-LC3 uttrykk i de nevrale prosesser vanskelige å visualisere.

Figur 7. hippocampus nevroner vokst i 7 dager og farget med organeller markør MitoTracker Red CM-H ₂ XRos (Invitrogen # M7513). Denne vitale fargestoff brukes til å farge aktiv mitokondriene i vevskulturstudier celler. Cellene ble fiksert i 4% paraformaldehyde / PBS og visualisert ved fluoriserende mikroskopi. Fargestoffet i seg selv er ikke-fluorescerende inntil oksidert i mitokondriene. Aktiv mitokondrier kan ses over hele nevronale prosesser.

Figur 8.

Figur 9. Hippocampus nevrale kulturer ble dyrket i 5 dager og tilført med GFP-LC3β DNA konstruere ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen # 11668019). Hos Dag 7, ble cellene festes ved hjelp av 4% paraformaldehyde / PBS og aggresomes med GFP tagget LC3β innlemmet i sin ytre membran ble visualisert ved hjelp av fluoriserende mikroskopi. Aggresomes ligger hele cellen kroppen og neurites og er merket med piler.

Discussion

Hippocampus kulturer har blitt brukt i molekylær biologi i mer enn 20 år. Mens i prinsippet kan nevrale kulturer gjøres fra hvilken som helst del av hjernen, har hippocampus kulturer vist seg å være den mest populære på grunn av den relativt enkle arkitekturen av nerve cellen befolkningen i hippocampus ^7. Hippocampus kulturer er vanligvis laget av sent stadium embryonale vev. Dette vevet er lettere å distansere og inneholder færre gliacellene enn gjør moden hjernevev ^en. Isolering av hippocampus nevroner fra embryonale vev reduserer også alpakkaull skade axoner og dendritter grunn færre vedheft kontakter ^3. Mens hippocampus kulturer er oftest generert fra rotter på grunn av relativt enklere isolering av hippocampus, kan mus også brukes med de samme protokollene eventuelt omsorg er tatt under vev isolasjon. Når nevroner dyrkes, evne til å bruke avanserte molekylærbiologiske teknikker for å analysere subcellulære localization og menneskehandel kan benyttes. Dette kan være spesielt fordelaktig når analysere embryonale dødelige transgene mus som det gir muligheten til å studere protein interaksjoner som ville resultere i død av embryoet.

Hippocampus har vært innblandet i både romlig og kontekstuell læring ⁵ og hukommelse ^6. Vekst av primære kulturer fra hippocampus kan tillate en sammenheng mellom subcellulære biologiske hendelser og deres effekt på hjernens evne til å lære og huske.

Som med alle nevrale celler, nevroner vokst fra hippocampus kulturer krever kritiske vekstfaktorer, hormoner og aminosyrer. I hjernen er disse faktorene levert av gliacellene. Dette symbiotiske forholdet kan også bæres inn i en kultur miljø ved å dyrke en "mater" lag med gliacellene sammen med de dyrkede nerveceller. Imidlertid vil gliacellene også produsere cytotoksiske forhold under sin levetid ¹¹ which kan være giftig for dyrkede nerveceller. For å omgå dette, har nevroner blitt dyrket i serum-frie medier som Neurobasal medium supplert med B27. Den B27 supplement er optimalisert for overlevelse av hippocampus nevroner, men vil støtte veksten av andre nevrale kulturer samt ^fire. L-glutamin er en essensiell aminosyre for energiproduksjon og proteinsyntese i cellekultur. Imidlertid kan glutamin være labil over tid, nedverdigende til ammoniakk og karboksylsyre biprodukter gang lagt til kultur media. Glutamax, en cellekultur supplement fra Invitrogen, kan brukes som en direkte erstatning for L-glutamin hvis ønskelig. Glutamax er mer stabil i media, men litt dyrere. Vekst av nevroner i serum-frie medier gjør studiet av effekter av vekstfaktorer og hormoner på neuronal vekst og differensiering.

Vi sender en protokoll for rask isolering av hippocampus nevroner fra mus prenatal embryoer med Neurobasal media og B27 supplement for vekst av nevroner i et serum fritt miljø uten bruk av materen celler. Som med alle dyrkede primære celle protokoller, er det en fordel å minimere veksten av ikke-ønskede celletyper (dvs. gliacellene). Dette er lettest utføres ved forsiktig disseksjon av hippocampus fra omkringliggende regioner av hjernen. Prenatal celler inneholder også en forholdsvis lite antall gliacellene hjelpe til dette målet. Imidlertid kan glial celle forurensning fortsatt skje. Det er mulig å redusere glial celle forurensning ved behandling med cytosin arabinoside (AraC) på tidlige tidspunkter i kulturen ^8,9. AraC kan brukes som en anti-mitotisk middel for å redusere andelen av ikke-nevronale celler i stand til DNA-syntese. Men for å unngå mulige toksiske effekter av behandling på nervecellene, bør den brukes på sitt laveste effektive gjør (5 mikrometer) og ikke legges etter 3-4 dager med kultur ^11. Et annet alternativ ville være bruk av 5-fluoro-2'-deoxyuridine (FUdR) behandling til desemberrease andelen fibroblastic-reaktive microglial celler ^10.

Når høstes, kan hippocampus vev behandles med en fortynnet trypsin løsning å dissosiere / disaggregate heftende celler. Imidlertid kan langvarig eksponering for høye konsentrasjoner av trypsin være skadelig for cellen subkultur så tiden i trypsin løsningen er oftest begrenset til mellom 3-5 minutter. Den fortynnede konsentrasjonen av trypsin som brukes i denne protokollen tillater lengre tider av enzymet inkubasjonstiden for å øke individuell mobilnettet disassociation men forsiktighet bør utvises for å strengt følge de tidspunkter som tilbys. Papain kan brukes som et alternativ enzymet og har vist seg å være mer effektive og mindre destruktiv med visse vev som netthinnens nerveceller ^10.

Cell dissosiasjon etterfølges av trituration av vev. Dette har vist seg å være det viktigste steget i tråd neuronal kultur og er markert med to viktige points. Først blir to sterile Pasteurs pipetter brukes under denne prosessen. Den første brukes til grovt forstyrre vev / mobilnettet forening. Den åpning størrelsen på denne første pipette bør være mellom 1,0 til 1,5 mm. Nøye utvalg av pipetter direkte fra leverandøren pakken kan vanligvis resultere i egnede pipetter for denne første trituration. Den andre Pasteur pipette benyttes er "brann-polert" over en gassbrenner for å redusere størrelsen på åpningen til ca 0,5 mm i diameter. Dette resulterer også i "polere" glasset ringen av åpningen til en glattere overflate reduserer mekanisk skade på celler som de passerer gjennom. For det andre er hastighet / kraft trituration gjennom pipetten av stor betydning. Som cellene distansere seg fra hele vev, er de selvsagt mer skjør. Dermed vil "røff" behandling som dette punktet være skadelig for overlevelse av de nevrale celler. Trypsinized vev bør passaged gjennom pipetten på en konsekvent, men fast flow rate. En vanlig feil ved the forsker er tanken på å måtte oppheve tilknytningen vevet til det er noen merkbar struktur igjen. I de fleste tilfeller vil dette resultere i massive neuronal død som cellene vil bli altfor skadet av gjentatt mekanisk manipulasjon. Det angitte antall ganger å passere vev gjennom pipetten vil resultere i et tilstrekkelig antall nevroner uten resulterer i brutto skade befolkningen.

Når cellene har vært skilt og samlet, en Trypan blå flekk av en delmengde av celler vil gi en ratio på leve til døde celler. Vanligvis bør 75-80% av cellene overlever innhøstingen prosessen og kan brukes til plating. Trypan Blå flekker kan også brukes til å få en nøyaktig celletall når det gjøres på en hemocytometer. I praksis, når en samlet celletall oppnås, legger 20% til den totale og bruke den celle nummer for plating å redegjøre for hvor mye celledød. Tall gitt i ovennevnte protokollen er et godt starting punkt for å oppnå gode tettheter av nerveceller. Hvis neuron tetthet er for lav ved plating, vil cellevekst sannsynlig ikke være tilstrekkelig som platekledning tetthet er en viktig variabel i forplantning av cellen befolkningen. Celler skal fôres hver fire dager med B27/Neurobasal Feed-media. Neuronal vekst under disse forholdene kan lett utføres til 10-14 dager i kultur og har blitt brukt til å spre neurons ² ut til 30 dager i kultur når seedet på 80 celler / mm ^2.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat Tail Collagen 1	BD Biosciences	354236
Poly-D-lysine Solution	Chemicon	A-003-E
Hanks Balanced Salt Solution	Invitrogen	14175-095
Trypsin Solution (1X) 0.25%, liquid	Invitrogen	15050-065
NeuroBasal Medium (1X) liquid	Invitrogen	21103-049
B27 Supplement (50X) liquid	Invitrogen	17504-044
L-Glutamine 200 mM (100X) liquid	Invitrogen	25030-149
Penicillin (10,000 units/ml) / Streptomycin (10,000 μg/ml)	Invitrogen	15140-148
HI-Donor Horse Serum	Atlanta Biologicals	S12150H