从产前小鼠海马神经元的分离和培养

Summary

我们没有从产前的老鼠大脑海马神经元的神经胶质细胞饲养层的使用高度纯化的文化提供了一个协议。

Abstract

被广泛用于揭示小学文化的大鼠和小鼠海马神经元细胞在神经生物学机制。通过隔离和不断增长的单个神经元，研究人员能够分析贩运细胞，细胞结构和个别蛋白质本地化，使用各种生化技术相关的属性。从这些实验的结果是测试解决学习和记忆功能的神经基础理论的关键。然而，从这些形式的实验结果明确的增长能力，神经细胞与其他脑细胞类型的最低污染的前提。在这个协议中，我们使用特定的神经细胞生长和胚胎海马组织小心剥离，旨在优化健康的神经细胞的生长，同时最大限度地降低污染类型的细胞（即星形胶质细胞）的媒体。胚胎小鼠海马组织能更加困难比DI大小的样品，由于类似的灭鼠组织隔离开来ssection。我们发现从胚胎19天（E19）小鼠幼仔海马的详细解剖技术。一旦海马组织是孤立的，温柔的神经细胞的分离，实现稀浓度的胰蛋白酶和机械设计单独从结缔组织细胞的破坏，同时提供单个细胞的损害最小。包括一个详细说明如何准备用于在中断移液器。免疫荧光协议，以最大限度地提高成功的细胞培养提供最佳的电镀密度。该协议提供了一个快速（约2小时）和有效的技术从小鼠海马组织神经细胞文化。

Protocol

1。设置收获前

1. 为了产生神经元的收获产前幼仔，安排成年鼠的繁殖19天前神经隔离的日子。 （只C57BL / 6小鼠年龄2-8个月内被用来发展这个协议的目的交配）。在怀孕的女性，心悸或视觉确认，确认成功的交配可以通过检测阴道塞。
2. 前一天神经隔离：
   1. 对于免疫的应用，在24孔板以3:1的胶原蛋白，鼠尾光涂层的外衣盖玻片：聚-D-赖氨酸的解决方案。
   2. 用于细胞培养的应用，大衣适当大小的组织文化以3:1的胶原蛋白，鼠尾光涂层塑料制品：聚-D-赖氨酸的解决方案。
3. 在组织文化引擎盖发现板UV光下休息过夜。
4. 洗板前用无菌汉克的平衡盐溶液（HBSS中）使用。涂层板，可以填补与HBSS中，并储存在4℃黑暗中一个星期。

2。组织收获

1. 不育性始终是一个日益增​​长的初级细胞培养等，最大的，应谨慎行事，以确保在无菌的环境中最可能的因素。仔细注意无菌技术，初步解剖和神经组织的收获，这个协议可以完成的层流罩外，污染最小的风险。初步收获后，所有后续步骤应最大的无菌条件下进行细胞培养额定罩内。
2. 斩首怀孕鼠标安乐死在受精后约19天。使用麻醉安乐死的怀孕女性不建议作为麻醉已知会导致脑细胞死亡（Stratmann，等，2010）。使用无菌解剖剪刀和镊子，在中腹侧面创建一个开放鼠标完全揭示体腔。仪器可以消毒用酒精和明火。
3. 对小鼠的体腔后，将位于产前幼仔，应该很容易在子宫内可见。与蒸压消毒钳，打开子宫，取出幼仔。杀头与新鲜无菌剪刀和消毒纱布的地方在解剖显微镜下取出头幼仔。无菌，灭菌的仪器，可以使用酒精和明火之前火焰清理和使用过程中。
4. 用无菌剪刀或手术刀打开颅骨，从脖子后面的小狗的鼻子。此过程通常可以完成插入一剪刀尖椎孔，然后进行前方。用钳子小心地取出整个大脑。将无菌纱布上的大脑。用消毒的手术刀，删除的小脑和大脑中线切开分成两半球（ 图1） 。
5. 把握脑膜周围，用无菌镊子海马的一小部分，并把它轻轻地走。虽然这不是绝对必要之前删除隔离海马脑膜，脑膜的存在可以使夹层海马更加困难，由于膜的韧性。在任何情况下，海马将更加清晰可见脑膜后已被删除。海马是一个弧形的结构，在半球和腹侧弯曲（ 图2）远端部分开始。由于内，凹侧（尾鳍）正面临着一个心室，这已经是免费的。因此，分离海马，需要削减沿凸外侧。剥离后，轻轻提起每海马组织成一个小温暖（37℃）下的细胞培养罩的HBSS培养皿用无菌组织钳和转让。脑组织可结合多个幼仔。

“> 3。组织离解

1. 3毫升100毫米组织培养皿无菌HBSS中使用无菌手术刀，轻轻百果脑组织。
2. 碎组织和HBSS中转移到15毫升锥形管。新增的HBSS 1.5毫升和0.5毫升到5毫升的总量0.25％胰蛋白酶溶液。
3. 帽和轻轻颠倒离心管4-5次混合。尽量避免产生气泡释放的DNA消化组织将坚持气泡，导致碎组织，而不是解决试管底部（ 图3）浮动。
4. 在37℃孵育15分钟后，海马组织相管，每5分钟以上。
5. 允许组织，定居在试管底部。
6. 仔细去除多余的解决方案，使用无菌吸管，留在试管底部组织原状。
7. 洗颗粒组织在37°C 5分钟，5毫升的HBSS。重复共3次。允许组织完全解决管底部的每一次前出发到下一个清洗步骤。
8. 从组织颗粒最终清洗和更换2毫升新鲜的HBSS。

4。神经元研磨

1. 开始研磨步骤之前，你需要准备火抛光的巴斯德吸液管。使用Bunson燃烧器，保持无菌9英寸的巴斯德吸管中的火焰尖端（ 图4a），直到吸管开幕直径约0.5毫米大小和边缘的吸管开幕的已略圆（ 图4b）。允许吸管完全冷却，然后再开始研磨过程。
2. 使用正常的无菌9英寸巴斯德吸管，轻轻磨碎共组织了7次。较大的组织块，在这一点上是正常的，应允许移动到下一个步骤之前，解决管底​​部。
3. 将上清转移到一个新的无菌50毫升锥形管。
4. 允许所有剩余较大的组织块，以解决管的底部，并结合以前共4毫升分离神经细胞上清上清。

5。细胞接种

1. 使用血球计数游离细胞。
2. 作为一般规则，一旦细胞的数量已经确定，从这个最后的数字减去20％，占电镀后可能发生的任何细胞死亡。
3. 细胞可以镀使用以下建议：
   在24孔板盖玻片- 6×10 ⁴细胞/ 0.5毫升
   对于60毫米的组织培养板- 4×10 ⁵细胞/板，3毫升
   对于100 mm组织培养皿- 6×10 ⁶细胞/ 6毫升板
4. 混合适当的细胞数量的Neurobasal电镀媒体的指示量（的Neurobasal媒体含有B27的补充[1毫升/ 50毫升，，谷氨酰胺解决方案0.5毫米，25μM的谷氨酸（先生147.13克/摩尔），青霉素（10,000单位/毫升）/链霉素（10,000微克/毫升）[250μL/ 50毫升] ，1mm的肝素钠（先生238.3克/摩尔），10％热灭活供体马血清），并添加细胞板。旋流板轻轻细胞均匀分布。您好捐助者马血清加电镀媒体，以丰富的增长在第一个24小时的细胞。细胞随后断奶从血清和血清串行减少在每个媒体更换无血清的环境。还应当指出的是，而在较高浓度的谷氨酸是神经细胞培养的毒性，在这里添加浓度，它会抑制非神经细胞的附件^11。然而，它应该只被添加到培养的第一个24小时的电镀媒体，随后离开任何饲养媒体，以防止细胞的神经毒性。
5. P级花边神经元在_{37℃，5％CO2}培养箱过夜。
6. 从细胞中取出一半的媒体数量和相同体积的Neurobasal饲养媒体（含B27添加剂的Neurobasal媒体取代[1毫升/ 50毫升，0.5毫米谷氨酰胺​​溶液，青霉素（10,000单位/毫升）/链霉素（10,000微克/毫升）250μL/ 50毫升，1毫米肝素钠（先生238.3克/摩尔）。
7. 通过消除旧媒体的一半，并用相同体积的新鲜的Neurobasal饲养媒体的神经元应投喂，每4天。神经过程应开始第1天（ 图5a）可见，成为流行的10天（ 图5b）。

6。代表结果

增长和文化的主要神经细胞的能力，已成为神经科学的一个不可缺少的一部分。小学文化的允许研究者分析特定的细胞通路，化学修饰和处理，目标禄在受控环境中alization和增长模式。许多这些程序利用先进的方法，可视化细胞的反应中的具体变化。在这种情况下，海马神经元用于研究特定的神经通路，将被证明是困难的，如果不是不可能的完整的大脑在分析。从大脑的特定区域的神经元附近的同质人口的制备是研究脑功能的关键。在单个神经元的分子作用，可以划定高阶通路，如内存或学习。由于该协议得到较纯的文化，而不需要的神经胶质细胞的饲养层，海马神经元，这些神经元很容易利用免疫研究。然而，小学文化的所有器官，含有多种细胞类型，一些污染少所需的细胞可以发生。在隔离神经细胞，神经胶质细胞污染是一个普遍的问题。神经胶质细胞c可以很容易被发现后微观可视化的文化形态目标神经元（ 图6）显着不同。胶质细胞污染的影响将取决于计划使用的文化。如果正在使用免疫荧光检查细胞，神经胶质污染可以尝试拍摄单个神经元时，是什么比一个多不便。然而，如果被用于生化分析的神经细胞是由神经胶质细胞的任何重大污染可能会导致结果的重大变化。概述了进一步讨论的方法来解决胶质细胞污染。

一旦神经已经成功地分离和培养，一个典型的应用是检查细胞免疫荧光技术的进程。 如图7所示，如线粒体的细胞器，可以使用添加到培养基修复前的重要染料染色ATION。内源性细胞的蛋白质，可以可视化固定细胞，使用标准的免疫荧光技术（ 图8）。一旦神经细胞是固定的，可以将感兴趣的蛋白质的特异性抗体的细胞，这些蛋白质可以用荧光显微镜可视化。培养的神经元，还提供与手段的研究人员检查个别蛋白影响神经功能。使用多种技术，包括DNA转染，电穿孔或病毒转导，蛋白质可在神经细胞（ 图9）过度。神经细胞如何回应过表达蛋白的影响，可以对大脑的反应可能有直接的推论，并提供细胞的目标确定为药物治疗的可能性。这些类型的实验细节超出了本文的范围，但他们没有说明这种技术制备的文化是适合广泛的为羽绒-Stream应用。然而，这个协议的整体简洁，以及为短的时间内，需要准备这些神经细胞，使这是一个在今日的神经科学实验室使用的理想方法。

图1。剖析产前鼠脑。第一个切口是大脑分成两个半球的中线。

图2。在产前鼠脑海马区的位置。纹状体一边移动到海马可视化，并注意到在每个半球的远端地区弯曲的“芸豆”型结构。

图3。海马组织中的胰蛋白酶溶液分解。

图4。巴斯德枪头用于海马组织研磨。 （一）普通巴斯德枪头。 （二）消防抛光的巴斯德枪头。注意的圆边和吸管开口尺寸减少约50％。

图5。海马神经元分离使用此程序，并镀在NB媒体。 （一）细胞生长1日后电镀。神经过程的开始，是在第1天可见。 （二）细胞生长10天电镀后，突起是分支和重叠。

图6。污染7天生长的神经胶质细胞和细胞器标记MitoTracker红，CM-H2XRos（Invitrogen公司＃M7515）和transfe染色的海马神经元反恐执行局与GFP-LC3的使用脂质体2000（Invitrogen公司＃11668019）。线粒体是可见的，但是只有一个单一的神经元，在所有细胞中成功转染荧光构造。与胶质细胞的污染，使GFP-LC3的表达很难想象，在神经元突起的分析。

图7。海马神经元增长为7天，细胞器标记MitoTracker红CM-H的₂ XRos（Invitrogen公司＃M7513）染色。这一重要的染料来染色积极组织培养细胞中的线粒体。这些细胞被固定在4％多聚甲醛/ PBS和荧光显微镜观察。染料本身无荧光，直到在线粒体氧化。活跃​​的线粒体中可以看出整个神经过程。

图8。

图9。海马神经细胞生长5天，并与GFP-LC3βDNA转建设用脂质体2000（Invitrogen公司＃11668019）。第7天，细胞固定用绿色荧光蛋白标记纳入其外膜LC3β4％多聚甲醛/ PBS和aggresomes用荧光显微镜进行可视化。 aggresomes位于整个细胞体和突起，并用箭头表示。

Discussion

海马文化已被应用于分子生物学，为20年以上。虽然原则上，神经细胞可以从大脑的任何部分，海马文化已被证明是最流行 ​​，由于在⁷海马神经细胞的人口相对简单的架构。海马文化通常是由后期的胚胎组织。这个组织是容易分解和包含不少于成熟的脑组织的神经胶质细胞。从胚胎组织的海马神经元的分离，也减少了由于更少的黏附接触^3的轴突和树突的剪切破坏。虽然海马的文化是最经常产生由于相对容易隔离海马大鼠，小鼠也可以使用相同的协议，如果组织分离过程中采取适当的照顾。一旦神经元培养，能够使用先进的分子生物学技术分析亚升可以采用ocalization和贩运。这可能是胚胎致死的转基因小鼠进行分析时，特别有利，因为它提供的能力，研究蛋白质的相互作用，将导致胚胎死亡。

海马有牵连的空间和情境学习和记忆^6。从海马小学文化的增长，可以使细胞内的生物事件和对大脑的学习和记忆能力的影响之间的关系。

与所有的神经细胞，神经生长海马文化需要重要的生长因子，激素和氨基酸。在大脑中，这些因素是由神经胶质细胞。这种共生关系，也可以进行成一个文化环境中，随着培养的神经细胞生长“接驳”神经胶质细胞层。然而，神经胶质细胞也会产生在其寿命^11瓦特的毒性因素HICH培养的神经元可能是有毒的。绕过这个，神经元在无血清培养基，如与B27的补充的Neurobasal中等已经长大。 B27的补充优化的海马神经元的生存，但将支持以及⁴其他神经细胞的生长。 L-谷氨酰胺是一种重要的能源生产和蛋白质的合成，在细胞培养氨基酸。然而，谷氨酰胺可以是不稳定的，随着时间的推移，降解成氨和羧酸副产品，一旦添加到培养基。 glutamax，从Invitrogen公司的细胞培养补充，可以作为直接替代品，如果需要，为L-谷氨酰胺。 glutamax是媒体更稳定，但稍贵。神经元在无血清培养基中生长，允许对神经细胞生长和分化的生长因子和激素的影响的研究。

我们提交的产前胚胎小鼠海马神经元的Neurobasal媒体迅速隔离协议和B27的supplem耳鼻喉科不使用饲养层细胞在无血清神经细胞的生长环境。与所有原代培养细胞的协议，它是有利于最大限度地减少非所需的细胞类型（即神经胶质细胞）的生长。这是最容易从周边地区的大脑海马小心剥离完成。产前细胞也包含了协助实现这一目标的神经胶质细胞的数量相对较小。但是，胶质细胞污染仍时有发生。这可能与阿糖胞苷（阿糖胞苷）治疗，以减少胶质细胞污染^，8,9文化早期的时间点。阿糖胞苷可以用来作为抗有丝分裂剂，以减少非神经细胞的DNA合成能力的人口。然而，对神经元的治疗，以避免可能的毒性作用，它应使用最低有效（5μM）文化的¹¹后的3-4天，而不是增加。另一种办法是使用5 - 氟-2'-脱氧尿苷（FUDR）治疗至十二月的现象越来越多的成纤维细胞反应¹⁰小胶质细胞的比例。

收获后，海马组织是可以治疗的稀胰蛋白酶的解决方案，贴壁细胞分离/分解。然而，长时间暴露在高浓度的胰蛋白酶可能是有害细胞亚文化，使胰蛋白酶溶液中的时间是最常见的限制在3-5分钟之间。在这个协议中使用的胰蛋白酶的稀释浓度并允许增加单个细胞解离酶潜伏期较长时间，但应注意严格坚持所提供的时间点。木瓜蛋白酶可作为另一种酶，已被证明是更有效和破坏性的某些组织，如视网膜神经细胞的^10。

其次是研磨的组织细胞分离。这已被证明是一致的神经文化中最重要的一步，并强调了两个重要的画法TS。首先，两个巴斯德消毒移液器在此过程中使用。首先是用于严重破坏组织/细胞协会。这家吸管开放的大小应该是1.0-1.5毫米之间。通常可以导致这首研磨适当移液器移液器直接从供应商包精心挑选的。第二巴斯德吸管使用的是“火抛光”过本生灯，以减少大小直径约0.5毫米的开幕。这也导致在“抛光”光滑的表面，减少机械损伤的细胞，因为他们通过开放的玻璃环。其次，通过吸管的速度/研磨力是非常重要的。作为整个组织细胞脱离，他们当然更脆弱。因此，“粗”，因为这点治疗，会损害神经细胞的生存。代胰酶消化组织应通过移液器一致的，但公司的流量。由第一个常见的​​错误ê研究者是完全撇清，直到没有明显的结构，其余的组织的想法。在大多数情况下，这将导致大量的神经细胞死亡的细胞将通过反复的机械操纵损坏。在指定的时间，通过吸管组织，会导致没有足够数量的神经元，造成总伤害的人口。

一旦细胞已经分离和集中，台盼蓝染色细胞等分，将提供一个活到死细胞比例。通常情况下，有75-80％的细胞生存的收获过程，可以用于电镀。台盼蓝染色，也可以用来获得准确的细胞计数，血球完成时。在实践中，一旦实现总细胞计数，添加20％的总使用用于电镀细胞死亡的大约金额占该细胞数量。在上述协议所提供的数字是一个很好的starti吴点，以实现良好的神经元密度。如果神经元密度过低，电镀，细胞的生长可能会不足够的电镀密度的细胞群体传播的一个重要的变量。与B27/Neurobasal饲料媒体的细胞应饲喂每四天。神经生长在这些条件下，可以很容易地进行了10-14天，在文化，并已用于传播神经元²时至30天的文化接种80个细胞/ mm ^2。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat Tail Collagen 1	BD Biosciences	354236
Poly-D-lysine Solution	Chemicon	A-003-E
Hanks Balanced Salt Solution	Invitrogen	14175-095
Trypsin Solution (1X) 0.25%, liquid	Invitrogen	15050-065
NeuroBasal Medium (1X) liquid	Invitrogen	21103-049
B27 Supplement (50X) liquid	Invitrogen	17504-044
L-Glutamine 200 mM (100X) liquid	Invitrogen	25030-149
Penicillin (10,000 units/ml) / Streptomycin (10,000 μg/ml)	Invitrogen	15140-148
HI-Donor Horse Serum	Atlanta Biologicals	S12150H