Isolatie en Cultuur van hippocampale neuronen van Prenatal Muizen

Summary

Wij bieden een protocol voor de cultuur van sterk gezuiverd hippocampale neuronen van prenatale muis hersenen zonder het gebruik van een feeder-gliale cellaag.

Abstract

Primaire culturen van ratten en muizen hippocampale neuronen worden op grote schaal gebruikt om cellulaire mechanismen te onthullen in de neurobiologie. Door te isoleren en groeiende individuele neuronen, onderzoekers zijn in staat om eigenschappen met betrekking tot mobiele handel, cellulaire structuur en individuele eiwit lokalisatie behulp van een verscheidenheid van biochemische technieken te analyseren. De resultaten van dergelijke experimenten zijn van cruciaal belang voor het testen van theorieën het aanpakken van de neurale basis van het geheugen en leren. Echter ondubbelzinnig resultaten van deze experimenten vormen gebaseerd op het vermogen om neuronale kweken groeien minimum verontreinigende andere hersenen celtypen. In dit protocol gebruiken we specifieke media ontwikkeld voor neuron groei en zorgvuldige dissectie van de embryonale hippocampus weefsel om de groei van gezonde neuronen te optimaliseren terwijl het minimaliseren van vervuilende soorten cellen (dwz astrocyten). Embryonale muis hippocampale weefsel moeilijker te isoleren dan vergelijkbare knaagdier weefsel door de grootte van het monster voor dissection. We tonen gedetailleerde dissectie technieken van de hippocampus van embryonale dag 19 (E19) muis pups. Zodra de hippocampus weefsel wordt geïsoleerd, is zacht dissociatie van neuronale cellen bereikt met een verdunde concentratie van trypsine en mechanische verstoring ontworpen om afzonderlijke cellen van het bindweefsel, terwijl het verstrekken van minimale schade aan de individuele cellen. Een gedetailleerde beschrijving van het pipetten bereiden voor gebruik in de onderbreking is opgenomen. Optimale plating dichtheden zijn bedoeld voor immuno-fluorescentie protocollen voor een succesvolle celkweek te maximaliseren. Het protocol biedt een snelle (ongeveer 2 uur) en efficiënte techniek voor de cultuur van de neuronale cellen van de muis de hippocampus weefsel.

Protocol

1. Up Set-voor de oogst

1. Om prenatale pups voor neuron oogst genereren, te plannen kweken tussen de volwassen muizen 19 dagen voorafgaand aan de dag van neuron isolatie. (C57BL / 6 muizen leeftijd 2-8 maanden werden gebruikt in paringen in het kader van de ontwikkeling van dit protocol). Geslaagde dekking kan worden bevestigd door de detectie van een vaginale plug in de vrouwelijke, hartkloppingen of een visuele bevestiging van de zwangerschap.
2. De dag voorafgaand aan de neuron isolatie:
   1. Voor immunofluorescentie toepassingen, jas dekglaasjes in een 24-well plaat met een dun laagje van 3:1 Collageen 1, Rat Tail: poly-D-Lysine oplossing.
   2. Voor celkweek applicaties, jas de juiste maat weefselkweek kunststofmateriaal met een dun laagje van 3:1 Collageen 1, Rat Tail: poly-D-Lysine oplossing.
3. Laat de platen ontdekt in een weefselkweek kap onder een UV-licht 's nachts.
4. Was de plaatjes met Balance steriele Hank's Salt Solution (HBSS) vóórgebruikt. Gecoate platen kan worden gevuld met HBSS en opgeslagen tot een week bij 4 ° C in het donker.

2. Tissue Harvest

1. Steriliteit is altijd een factor bij de teelt van primaire celculturen en als zodanig, de grootste voorzichtigheid is geboden om ervoor te zorgen de meest steriele omgeving mogelijk te maken. Met veel aandacht voor steriele techniek, kan in eerste instantie dissectie en oogst van zenuwweefsel voor dit protocol worden voltooid buiten een laminaire stroming kap met een minimaal risico op besmetting. Na de eerste oogst, moeten alle volgende stappen worden uitgevoerd onder maximale steriele omstandigheden in een kap geschikt voor celkweek.
2. Euthanaseren een zwangere muis op ongeveer 19 dagen na de bevruchting door onthoofding. Het gebruik van anesthesie aan de zwangere vrouw euthanaseren wordt niet aanbevolen als anesthesie is bekend dat het afsterven van hersencellen veroorzaken (Stratmann, et al.., 2010). Met behulp van steriele ontleden schaar en tang, een opening in het midden van de ventrale zijde van demuis volledig te onthullen lichaamsholte. Instrumenten kunnen worden gesteriliseerd met behulp van alcohol en een open vuur.
3. Prenatale pups zal worden gevestigd naar de achterkant van het lichaam van de muis holte en moet goed zichtbaar in de baarmoeder. Met autoclaaf steriel pincet, opent de baarmoeder en verwijder pups. Onthoofden pups met verse steriele schaar en plaats verwijderd hoofd op steriel gaas onder een stereomicroscoop. Steriel, geautoclaveerd instrumenten kunnen vlam gereinigd met alcohol en een open vlam voorafgaand aan en tijdens het gebruik.
4. Met behulp van steriele schaar of scalpel, open schedel van de pup uit achterkant van de nek naar de neus. Deze procedure kan normaal worden ingevuld door het invoegen van een punt van de schaar in het wervellichaam foramen en dan gaan naar voren. Verwijder voorzichtig het gehele brein met een pincet. Plaats de hersenen op een steriel gaasje. Met een steriel scalpel, verwijder de kleine hersenen en de incisie naar beneden de middellijn van de hersenen om het te scheiden in twee helften (figuur 1) .
5. Pak een klein deel van hersenvliezen rond de hippocampus met steriel pincet en trek het voorzichtig weg. Hoewel het niet strikt noodzakelijk om de vliezen te verwijderen voordat het isoleren van het hippocampus, kan de aanwezigheid van de vliezen maken de ontleding van de hippocampus moeilijker vanwege de taaiheid van het membraan. In beide gevallen zal de hippocampus duidelijker zichtbaar na de vliezen zijn verwijderd. De hippocampus is gebogen structuur die begint in het distale gedeelte van de halve bol en buigt ventraal (figuur 2). Omdat de innerlijke, concave, kant (caudale) wordt geconfronteerd met een hartkamer, is het al gratis. Derhalve isoleren hippocampus, moet men snijden langs de convexe buitenzijde. Na de dissectie, til elk hippocampus met een steriele pincet en de overdracht in een kleine weefselkweek schotel met warme (37 ° C) HBSS onder een celcultuur kap. Hersenweefsel kunnen worden gecombineerd van meerdere pups.

"> 3. Tissue Dissociatie

1. Met behulp van een steriel scalpel voorzichtig gehakt hersenweefsel in 3 ml steriele HBSS in een 100 mm Tissue Culture schotel.
2. Breng het gehakt weefsel en HBSS op een 15 ml conische buis. Voeg 1,5 ml HBSS en 0,5 ml 0,25% trypsine-oplossing tot een totaal volume van 5 ml.
3. Cap en voorzichtig omkeren van de buis 4-5 keer om te mengen. Vermijd produceren bolletjes als DNA vrij van de verkregen weefsel zich aan de bellen, waardoor de gehakt weefsel plaats drijven het afwikkelen op de bodem van de buis (figuur 3).
4. Incubeer hippocampale weefsel bij 37 ° C gedurende 15 minuten buisje hierboven elke 5 minuten.
5. Laat het weefsel naar de bodem van de buis.
6. Verwijder overtollige oplossing met een steriele pipet, waarbij weefsel ongestoord de bodem van de buis.
7. Was weefsel pellet met 5 ml van HBSS bij 37 ° C gedurende 5 minuten. Herhaal in totaal 3 keer. Laat weefsel compleet tot rust komende bodem van de buis telkens alvorens de volgende wasstap.
8. Verwijder de laatste wassing van het weefsel pellet en vervangen door 2 ml verse HBSS.

4. Neuron aanwrijving

1. Voordat u begint met aanwrijving stappen, moet u brand gepolijst Pasteurpipetten voor te bereiden. Een Bunson brander bezit een steriele 9 inch Pasteur pipet (figuur 4a) in de vlam tot diameter van de pipet opening ongeveer 0,5 mm en randen van de pipet opening zijn enigszins afgerond (figuur 4b). Laat pipet volledig afkoelen voordat de tritureren proces.
2. Met behulp van een normale steriele 9 inch Pasteur pipet voorzichtig Vermaal de weefsel in totaal 7 keer. Grotere weefselstukken normaal op dit punt worden bezinken naar de onderkant van de buis voor het verplaatsen naar de volgende stap.
3. Breng de bovenstaande een nieuwe steriele 50 ml conische buis.
4. Zodat alle resterende grotere stukken weefsel naar de bodem van de buis en supernatant met de vorige supernatant in totaal 4 ml gescheiden neuronale cellen te combineren.

5. Cell Plating

1. Tel de gescheiden cellen met behulp van een hemocytometer.
2. Als algemene regel geldt, zodra cel aantallen zijn bepaald, af te trekken van 20% van dat laatste nummer om eventuele celdood die kunnen optreden na plating.
3. Cellen kunnen worden uitgeplaat met de aanbevelingen:
   Voor dekglaasjes in een 24 wei-plaat - 6 x 10 ⁴ cellen / putje in 0,5 ml
   Voor 60 mm weefselkweekplaten - 4 x 10 ⁵ cellen / plaat in 3 ml
   Voor 100 mm Tissue Culture platen - 6 x 10 ⁶ cellen / plaat in 6 ml
4. Meng juiste cel nummers aangegeven volume van Neurobasal Plating Media (NeurobasalMedia die B27 Supplement [1 ml / 50 ml], 0,5 mM glutamine oplossing, 25 pM glutamaat (Mr 147,13 g / mol), penicilline (10.000 eenheden / ml) / streptomycine (10.000 ug / ml) [250 ul / 50 ml] , 1 mM HEPES (Mr 238,3 g / mol), 10% door warmte geïnactiveerd Donor paardenserum) en voeg cellen te platen. Swirl platen voorzichtig gelijkmatig te verdelen cellen. HI-Donor paardenserum wordt toegevoegd aan de beplating media om de cellen te verrijken in de eerste 24 uur kweken. De cellen worden vervolgens gespeend van het serum en keerde terug naar een serum-allergene omgeving door seriële reductie van het serum bij elke media vervangen. Er moet ook worden opgemerkt dat glutamaat bij hogere concentraties toxisch is neuronale celculturen de lagere concentraties toegevoegd hier zal de bevestiging van niet-neuronale cellen ¹¹ remmen. Er moet echter alleen worden toegevoegd aan de beplating media voor de eerste 24 uur in cultuur en vervolgens weggelaten elke voedingsmethode Media neurotoxiciteit van de cellen te voorkomen.
5. Pkant neuronen in een 37 ° C, _5% CO2 incubator gedurende de nacht.
6. Verwijder de helft van het volume van de media van de cellen en te vervangen door hetzelfde volume van Neurobasal Feeding Media (Neurobasal Media met B27 supplement [1 ml / 50 ml], 0,5 mM Glutamine Solution, penicilline (10.000 eenheden / ml) / streptomycine (10.000 g / ml) [250 ul / 50 ml], 1 mM HEPES (Mr 238,3 g / mol).
7. Neuronen moeten worden gevoed om de 4 dagen door het verwijderen van de helft van de oude media en te vervangen door hetzelfde volume van verse Neurobasal Feeding media. Neuronale processen moeten beginnen zichtbaar op dag 1 (figuur 5a) en voorkomt op dag 10 (figuur 5b) worden.

6. Representatieve resultaten

Het vermogen om te groeien en cultuur primaire neuronale cellen is uitgegroeid tot een onmisbaar onderdeel van de neurowetenschappen. Primaire culturen kan de onderzoeker om specifieke cellulaire mechanismen te analyseren, chemische modificatie en de behandeling, doel localization en groeipatronen in een gecontroleerde omgeving. Veel van deze procedures gebruik maken van geavanceerde methodologie om specifieke veranderingen in de cel responsen te visualiseren. In dit geval worden hippocampale neuronen gebruikt om specifieke zenuwbanen zou moeilijk, zo niet onmogelijk te analyseren in de intactehersenen bestuderen. Voorbereiding van de buurt van homogene populaties van neuronen van specifieke gebieden van de hersenen is van cruciaal belang voor het bestuderen van de hersenfunctie. Moleculaire effecten in individuele neuronen kan een grote rol spelen bij het afbakenen van hogere orde wegen, zoals geheugen of leren. Aangezien dit protocol levert relatief zuivere cultures van hippocampale neuronen, zonder dat een voedingsbodem van gliacellen worden deze neuronen gemakkelijk gebruikt voor immunofluorescentie studies. Echter, zoals met alle primaire cultuur van andere organen met meerdere celtypen, kunnen sommige besmetting met minder gewenste cellen voorkomen. In isolatie van neuronale cellen, kan verontreiniging van gliacellen een algemeen probleem. Gliacellen ceen gemakkelijk worden opgespoord op microscopische visualisatie van de cultuur in hun morfologie aanzienlijk verschilt van het doel neuronen (figuur 6). De impact van de glia cel besmetting hangt af van het geplande gebruik van de culturen. Als cellen worden gebruikt voor immuno-fluorescentie onderzoek, kan gliale verontreiniging zijn niets meer dan een ongemak wanneer het proberen om individuele neuronen te fotograferen. Indien de neuronale kweken worden gebruikt voor biochemische analyse kan een aanzienlijke vervuiling door gliacellen leiden tot aanzienlijke veranderingen in de resultaten. Manieren om gliale cel verontreiniging aan te pakken worden nader beschreven in de discussie.

Zodra neuronen met succes zijn geïsoleerd en in kweek, een typische toepassing is om cellulaire processen te onderzoeken immuno-fluorescentie technieken. Zoals getoond in figuur 7 kan organellen, zoals mitochondria worden gekleurd met kleurstoffen essentieel toegevoegd aan het kweekmedium voor vastatie. Endogene cellulaire eiwitten kunnen worden gevisualiseerd van gefixeerde cellen met standaard immuno-fluorescentie technieken (figuur 8). Zodra neuronale cellen gefixeerd, kunnen specifieke antilichamen voor eiwitten van belang worden geïntroduceerd om de cel en deze eiwitten kunnen worden gevisualiseerd met behulp van een fluorescentie microscoop. Gekweekte zenuwcellen ook de onderzoeker van de middelen om individuele eiwit effecten op de neuronale functies te onderzoeken. Een verscheidenheid van technieken zoals DNA transfecties elektroporatie of virale transductie kunnen eiwitten worden overexpressie gebracht in neuronale cellen (figuur 9). Hoe neurale cellen reageren op de effecten van een tot expressie gebrachte eiwitten kunnen direct conclusies over de manier waarop de hersenen kan reageren en biedt de mogelijkheid tot identificatie van cellulaire doelwitten voor de behandeling met geneesmiddelen. De details van deze soort experimenten buiten het bestek van dit maar ze illustreren dat culturen bereid door deze methode zijn geschikt voor een groot aantal naar beneden entream toepassingen. Echter, de algehele eenvoud van dit protocol, evenals de korte tijdsspanne die nodig is om deze neuronale culturen voor te bereiden maken dit een ideale methode voor gebruik in de neurowetenschappen de huidige laboratorium.

Figuur 1. Dissectie van de prenatale hersenen van muizen. De eerste incisie is beneden de middellijn van de hersenen scheidt het in twee hersenhelften.

Figuur 2. Locatie van de hippocampus in de prenatale hersenen van muizen. Het striatum wordt verplaatst opzij om de hippocampus visualiseren en wordt opgemerkt door de gebogen "nier bean" type structuur in de distale regio van elk halfrond.

Figuur 3. Dissociatie van de hippocampus weefsel in trypsine oplossing.

Figuur 4. Pasteur pipet uiteinden in fijnwrijving van hippocampale weefsel. (A) Normale Pasteur pipet tip. (B) brand-gepolijst Pasteur pipet tip. Let op de afgeronde hoeken en de ongeveer 50% afname in pipet opening grootte.

Figuur 5. Hippocampale neuronen geïsoleerd met behulp van deze procedure en uitgeplaat in NB Media. (A) Celgroei 1 dag na plating. Neuronale processen beginnen zichtbaar te zijn tijdens dag 1. (B) Celgroei 10 dagen post-plating, zijn neurieten vertakt en overlappend.

Figuur 6. Hippocampale neuronen besmet met gliale cellen gekweekt voor 7 dagen en gekleurd met het organel marker MitoTracker Red CM-H2XRos (Invitrogen # M7515) en Transfected met GFP-LC3 met Lipofectamine 2000 (Invitrogen # 11668019). Mitochondriën zichtbaar in alle cellen echter slechts een neuron succesvol was getransfecteerd met de fluorescerende construct. Contaminatie met gliacellen maakt analyse van de GFP-LC3 uitdrukking in de neuronale processen moeilijk te visualiseren.

Figuur 7. Hippocampale neuronen geteeld voor 7 dagen en gekleurd met het organel marker MitoTracker Red CM-H ₂ XRos (Invitrogen # M7513). Deze vitale kleurstof wordt gebruikt om een ​​actieve mitochondriën in weefselkweek cellen vlek. De cellen werden gefixeerd in 4% paraformaldehyde / PBS en gevisualiseerd door fluorescentiemicroscopie. De kleurstof zelf niet fluorescerend tot geoxideerd in de mitochondria. Actieve mitochondriën kan worden gezien in de neuronale processen.

Figuur 8.

Figuur 9. Hippocampus neuronale kweken werden gedurende 5 dagen gekweekt en getransfecteerd met GFP-LC3β DNA constructie met Lipofectamine 2000 (Invitrogen # 11668019). Op dag 7 werden de cellen gefixeerd met 4% paraformaldehyde / PBS en aggresomes met GFP gelabeld LC3β opgenomen in de buitenste membraan werden gevisualiseerd met fluorescentiemicroscopie. Aggresomes liggen verspreid over het cellichaam en neurieten en zijn aangegeven met pijlen.

Discussion

Hippocampale culturen werden in de moleculaire biologie voor meer dan 20 jaar. Hoewel in principe neuronale kweken kan worden gemaakt van een deel van de hersenen, hebben hippocampale culturen gebleken de meest door de relatief eenvoudige structuur van de zenuw cellen in de hippocampus ^7. Hippocampale culturen zijn meestal gemaakt van een laat stadium embryonaal weefsel. Dit weefsel is gemakkelijker om zich te distantiëren en bevat minder gliacellen dan wel volwassen hersenweefsel ^1. Isolatie van hippocampale neuronen uit embryonaal weefsel vermindert ook scheren schade aan de axonen en dendrieten door minder hechting contacten ^3. Hoewel hippocampale culturen meestal gegenereerd ratten door het relatief gemakkelijk isolatie van de hippocampus, kan muizen ook worden gebruikt met hetzelfde protocol eventueel zorg tijdens weefsel isolatie. Zodra neuronen worden gekweekt, de mogelijkheid om geavanceerde moleculaire technieken te gebruiken om subcellulaire l te analyserenocalization van en de handel kunnen worden gebruikt. Dit kan vooral voordelig zijn bij het analyseren van embryonale dodelijke transgene muizen als het biedt de mogelijkheid om eiwit interacties die zou resulteren in de dood van het embryo te bestuderen.

De hippocampus is betrokken bij zowel ruimtelijk als contextueel leren ⁵ en geheugen ^6. De groei van de primaire culturen uit de hippocampus kan toestaan ​​dat een correlatie tussen de subcellulaire biologische gebeurtenissen en hun invloed op de bekwaamheid van de hersenen om te leren en te onthouden.

Zoals met zenuwcellen neuronen gegroeid van hippocampale culturen zijn kritieke groeifactoren, hormonen en aminozuren. In de hersenen worden deze factoren door gliacellen. Dit symbiose kan ook uitgevoerd in een cultuur omgeving door het kweken van een "feeder" laag gliacellen samen met de gekweekte neuronen. Toch zal gliacellen produceren ook cytotoxische factoren tijdens hun levensduur ¹¹ Which kan giftig zijn voor gekweekte zenuwcellen. Om dit te omzeilen hebben neuronen gekweekt in serum-vrij medium zoals Neurobasal medium aangevuld met B27. De B27 supplement is geoptimaliseerd voor de overleving van hippocampale neuronen, maar zal de groei van andere neuronale culturen en ⁴ te ondersteunen. L-glutamine is een essentieel aminozuur voor de productie van energie en de eiwitsynthese in de cel cultuur. Echter, glutamine zijn labiele loop van de tijd, vernederende in ammoniak en carbonzuur bijproducten een keer toegevoegd aan de cultuur media. Glutamax een celkweek supplement van Invitrogen, kan worden gebruikt als een directe vervanging voor L-glutamine, indien gewenst. Glutamax is stabiel in media maar iets duurder. De groei van neuronen in serum-vrij medium maakt het mogelijk onderzoek naar de effecten van groeifactoren en hormonen op de neuronale groei en differentiatie.

We dienen een protocol voor de snelle isolatie van hippocampale neuronen van muis embryo's met behulp van prenatale Neurobasal media en de B27 supplement groei van neuronen in serumvrij omgeving zonder het gebruik van feeder cellen. Zoals alle gekweekte primaire cel protocollen, is het voordelig te minimaliseren de groei van niet gewenste celtypen (bijvoorbeeld gliacellen). Dit wordt het gemakkelijkst bereikt door zorgvuldige dissectie van de hippocampus uit de omliggende gebieden van de hersenen. Prenatale cellen ook een relatief klein aantal gliacellen hulp bij dit doel. Echter, gliale cel besmetting nog steeds optreden. Het is mogelijk om gliacellijn besmetting te verminderen door behandeling met cytosinearabinoside (AraC) op vroege tijdstippen in de cultuur ^8,9. AraC kan worden gebruikt als anti-mitotische middel om de populatie van niet-neuronale cellen kunnen DNA synthese te verminderen. Echter mogelijk toxische effecten van de behandeling op neuronen voorkomen moet worden gebruikt bij de laagst mogelijke doet (5 pM) en niet toegevoegd na 3-4 dagen kweken ^11. Een andere optie is het gebruik van 5-fluor-2'-deoxyuridine (FUdR) behandeling dec zijnrease het percentage fibroblastische reactieve microgliale cellen ^10.

Na de oogst kan hippocampus weefsel worden behandeld met een verdunde oplossing dissociëren trypsine / splitsen hechtende cellen. Echter, langdurige blootstelling aan hogere concentraties trypsine schadelijk voor cellen subcultuur dus tijd in trypsine-oplossing meestal beperkt tot tussen 3-5 minuten. De verdunde concentratie van trypsine gebruikt in dit protocol niet toestaat langere tijden van incubatie enzym aan individuele cellulaire scheiding te vergroten, maar zorg moeten worden genomen om zich strikt aan de voorziene tijdstippen. Papaïne kan worden gebruikt als alternatief enzym is gebleken effectievere en destructieve bepaalde weefsels zoals retinale neuronen ^10.

Cell Dissociation volgt fijnwrijving van het weefsel. Dit heeft zich bewezen als de meest belangrijke stap in de consequente neuronale cultuur en wordt gemarkeerd door twee belangrijke points. Eerst worden twee steriele pasteurpipetten tijdens dit proces. De eerste wordt gebruikt om grove verstoring van weefsel / cellen vereniging. De opening grootte van deze eerste tube moet tussen 1,0-1,5 mm. Een zorgvuldige selectie van pipetten direct van de leverancier pakket kan meestal resulteren in een geschikte pipetten voor deze eerste tritureren. De tweede gebruikt Pasteur pipet "vuur gepolijst" over een Bunsen-brander ter vermindering van de grootte van de opening ongeveer 0,5 mm in diameter. Dit resulteert tevens in "het polijsten van" het glas ring van de opening van een gladder oppervlak verminderen van mechanische schade aan cellen als ze door. Tweede snelheid / kracht fijnwrijving door de pipet van groot belang. Als de cellen los te zien van het hele weefsel, ze zijn natuurlijk meer kwetsbaar. Zo zou 'grof' te behandelen, omdat dit punt ten koste gaan van overleving van de neuronale cellen. Getrypsiniseerd weefsel moet worden gepasseerd door de pipet in een gelijkmatige, maar stevige debiet. Een veel gemaakte fout door THe-onderzoeker is het idee van het hebben om volledig te distantiëren van het weefsel tot er geen waarneembare structuur blijven. In de meeste gevallen zal dit resulteren in grote neuronale dood de cellen te worden beschadigd door het herhaald mechanische manipulatie. Het aangegeven aantal keren dat het weefsel door het pipet zal resulteren in een voldoende aantal neuronen zonder dat dit leidt in het bruto schade aan de bevolking.

Nadat de cellen zijn gescheiden en samengevoegd een Trypan blauwe kleuring van een aliquot van cellen een verhouding van leven dode cellen. Meestal moet 75-80% van de cellen overleven de oogst proces kan worden gebruikt voor platen. Trypan blauwe kleuring kan ook worden gebruikt om een ​​nauwkeurige cellen bij uitgevoerd op een hemocytometer verkrijgen. In de praktijk is een keer een totale celgetal wordt bereikt, voeg 20% ​​aan de totale en gebruiken die het aantal cellen voor plating om rekening te houden voor de geschatte hoeveelheid van celdood. Getallen in de bovenstaande protocol zijn een goede starting punt goede dichtheden van neuronen bereiken. Als neuron dichtheid te laag plating zal celgroei waarschijnlijk niet voldoende als plating dichtheid is een belangrijke variabele propagatie van de celpopulatie. De cellen moeten worden gevoed om de vier dagen met B27/Neurobasal Feed media. Neuronale groei onder deze omstandigheden kan gemakkelijk worden uitgevoerd bij 10-14 dagen in kweek en is gebruikt doorgeven neuronen ² tot 30 dagen kweek bij geënt bij 80 cellen / ^mm2.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat Tail Collagen 1	BD Biosciences	354236
Poly-D-lysine Solution	Chemicon	A-003-E
Hanks Balanced Salt Solution	Invitrogen	14175-095
Trypsin Solution (1X) 0.25%, liquid	Invitrogen	15050-065
NeuroBasal Medium (1X) liquid	Invitrogen	21103-049
B27 Supplement (50X) liquid	Invitrogen	17504-044
L-Glutamine 200 mM (100X) liquid	Invitrogen	25030-149
Penicillin (10,000 units/ml) / Streptomycin (10,000 μg/ml)	Invitrogen	15140-148
HI-Donor Horse Serum	Atlanta Biologicals	S12150H