Выделение и культуре нейронов гиппокампа мышей от пренатального

Summary

Мы предоставляем протокол к культуре высокой степени очистки нейронов гиппокампа из мозга мышей пренатальной без использования подачи глиальных слоя клеток.

Abstract

Первичные культуры крысы и мыши нейронов гиппокампа широко использованы для выявления клеточных механизмов в области нейробиологии. Выделяя и рост отдельных нейронов, ученые могут анализировать свойства, связанные с оборотом сотовых, сотовые структуры и отдельные локализации белка с помощью различных биохимических методов. Результаты этих экспериментов очень важны для проверки теории решения нейронные основы памяти и обучения. Тем не менее, однозначного результата от этих форм эксперимента основана на способности к росту нейронов культур с минимальным загрязнением другие типы клеток мозга. В этом протоколе, мы используем конкретные средства массовой информации предназначена для роста нейронов и тщательного вскрытия эмбриональной ткани гиппокампа для оптимизации роста здоровых нейронов при минимизации загрязнения типах клеток (например, астроциты). Эмбриональные ткани гиппокампа мыши может быть более трудно выделить, чем аналогичные ткани грызунов, в связи с размером выборки для ди-ssection. Мы покажем, подробные методы вскрытия гиппокампе мышей из эмбриональных день 19 (E19) щенков. После ткани гиппокампа изолирован, нежный диссоциации нервных клеток достигается с помощью разбавленной концентрации трипсина и механическое разрушение, направленных на отдельные клетки соединительной ткани, обеспечивая при этом минимальный ущерб отдельные клетки. Подробное описание того, как подготовить пипетки, которые будут использоваться в нарушение включен. Оптимальная плотность покрытия предназначены для иммуно-флуоресценции протоколов максимально успешной культуре клеток. Протокол обеспечивает быструю (около 2 ч) и эффективный способ для культуры нервных клеток гиппокампа мышей из ткани.

Protocol

1. Настройки до сбора урожая

1. Для создания пренатальной щенков для сбора нейрона, график разведения между взрослых мышей 19 дней до дня изоляции нейронов. (C57BL / 6 мышей возрасте 2-8 месяцев были использованы в вязки в целях развития этого протокола). Успешное спаривание может быть подтверждено обнаружение вагинальной вилку в женском, сердцебиение или визуальное подтверждение беременности.
2. За день до изоляции нейронов:
   1. Для иммунофлюоресценции приложений, пальто стекла покровные в 24-луночного планшета с легким покрытием 3:1 коллагена 1, крысы хвост: поли-D-лизин решение.
   2. Для применения клеточных культур, пальто соответствующего размера культуре ткани пластиковая посуда с легким покрытием 3:1 коллагена 1, крысы хвост: поли-D-лизин решение.
3. Отдых пластин обнаружены в капюшоне культуры ткани под ультрафиолетовым светом ночь.
4. Промыть пластины с баланса стерильной Хэнка солевой раствор (HBSS) дов использовании. Покрытые пластины могут быть заполнены HBSS и хранится до одной недели при температуре 4 ° С в темноте.

2. Ткань Урожай

1. Бесплодие всегда фактор при выращивании первичных культур клеток и, таким образом, наибольшую осторожность следует соблюдать, чтобы обеспечить наиболее стерильных условиях это возможно. С внимательное отношение к стерильности, начальная вскрытия и уборки нервной ткани для этого протокола может быть завершена за пределами ламинарном боксе с минимальным риском заражения. После первого урожая, все последующие шаги должны проводиться при максимальном стерильных условиях в капот рассчитан на культуре клеток.
2. Эвтаназии беременных мышей примерно 19 дней после оплодотворения путем обезглавливания. Использование анестезии, чтобы усыпить беременным не рекомендуется в качестве анестезии, как известно, причиной смерти клеток мозга (Stratmann и соавт., 2010). Использование стерильных рассечения ножницы и щипцы, создать отверстие в середине брюшной сторонемышь, чтобы полностью раскрыть полость тела. Инструменты можно стерилизовать употребление алкоголя и открытого пламени.
3. Пренатальная щенки будут расположены на задней полости тела мыши и должны быть хорошо видны в матке. С автоклавного стерильные щипцы, открытие матки и удаление щенков. Обезглавьте щенков со свежими стерильными ножницами и места удалены голова на стерильную марлю при вскрытии микроскопом. Стерильные, автоклавного инструменты могут быть пламенем очистить с помощью алкоголя и открытого пламени до и во время использования.
4. Используя стерильные ножницы или скальпель, открытый череп щенка от затылка к носу. Эта процедура может быть завершена нормально, вставив один совет от ножниц в позвоночный отверстие, а затем идет вперед. Осторожно удалите весь мозг щипцами. Поместите мозга на стерильную марлю. С помощью стерильного скальпеля, удалить мозжечка и надрезать вдоль средней линии мозга разделить его на два полушария (рис. 1) .
5. Возьмите небольшую часть мозговых оболочек окружающих гиппокамп стерильным пинцетом и вытащить его мягко далеко. Хотя это и не строго необходимо удалить до мозговых оболочек изоляции гиппокамп, наличие мозговых оболочек может сделать вскрытие гиппокампа сложнее из-за жесткость мембраны. В любом случае, гиппокамп будет более четко видно после мозговых оболочек были удалены. Гиппокамп представляет собой изогнутую структуру, которая начинается в дистальной части полушария и изгибы вентрально (рис. 2). Как внутренняя, вогнутая, сторона (каудального) сталкивается желудочка, это уже бесплатно. Поэтому, чтобы изолировать гиппокамп, нужно разрезать вдоль выпуклой внешней стороны. После вскрытия, осторожно поднимите каждый гиппокампе стерильным пинцетом ткани и передачи в небольшое блюдо культуры ткани с подогретой (37 ° C) HBSS под капотом культуре клеток. Мозговая ткань могут быть объединены в несколько щенков.

"> 3. Ткани диссоциации

1. С помощью стерильного скальпеля, мягко фаршем ткани головного мозга в 3 мл стерильной HBSS в 100 мм блюдо культуры тканей.
2. Передача измельченной ткани и HBSS в 15 мл коническую трубку. Добавить 1,5 мл HBSS и 0,5 мл 0,25% раствора трипсина в общем объеме 5 мл.
3. Cap и аккуратно переверните трубы в 4-5 раз перемешать. Старайтесь не производить пузырьки, как ДНК высвобождается из ткани перевариваются будет придерживаться пузырьков и вызвать измельченной ткани, чтобы плавать, а не разрешения на дне пробирки (рис. 3).
4. Инкубируйте ткани гиппокампа при 37 ° С в течение 15 минут, переворачивая трубку, как указано выше, каждые 5 минут.
5. Дайте ткани оседают на дне пробирки.
6. Осторожно снимите избыток раствора с использованием стерильной пипеткой, оставляя нетронутыми ткани в нижней части трубы.
7. Промойте ткань пеллет 5 мл HBSS при 37 ° С в течение 5 минут. Повторить в общей сложности 3 раза. Позвольте ткани полностью решитьв нижней части трубки каждый раз, прежде чем переходить к следующему шагу стирки.
8. Удаление последней промывки из ткани гранул и заменить 2 мл свежего HBSS.

4. Нейрон Растирание

1. Перед растиранием шаги, вам необходимо подготовить граненые пипетки Пастера. С помощью горелки Бансон, провести стерильные 9 дюймов пипетки Пастера (рис. 4а), в пламени, пока диаметр отверстия пипетки составляет примерно 0,5 мм и края отверстия пипетки были округлены немного (рис. 4б). Позвольте пипетки полностью остыть прежде, чем начать растирание процесса.
2. Использование нормальных стерильных 9 дюймов пипетки Пастера осторожно растереть ткань в общей сложности 7 раз. Большие части тканей нормальной в этой точке и должна быть предоставлена ​​возможность поселиться в нижней части трубы до перехода к следующему шагу.
3. Перенести супернатант в новую стерильную 50 мл коническую трубку.
4. Разрешить все оставшиеся крупные куски ткани оседают на дне пробирки и объединить супернатант с предыдущим супернатант в общей сложности 4 мл диссоциированных нервных клеток.

5. Сотовые покрытие

1. Подсчитайте диссоциированных клеток с использованием гемоцитометра.
2. Как правило, один раз числа клеток были определены, вычесть 20%, что окончательное число для учета любых гибели клеток, которые могут возникнуть после покрытия.
3. Клетки могут быть покрыты помощью приведенных ниже рекомендаций:
   Для покровных в 24-луночного планшета - 6 х 10 ⁴ клеток / лунку в 0,5 мл
   Для 60 мм Tissue Culture плит - 4 х 10 ⁵ клеток / пластину в 3 мл
   Для 100 мм Tissue Culture платы - 6 х 10 ⁶ клеток / пластину в 6 мл
4. Смешайте соответствующие номера ячейки с указанного объема Neurobasal СМИ Покрытие (NeurobasalСреды, содержащие B27 Дополнение [1 мл / 50 мл], 0,5 мМ глютамина Решение, 25 мкМ глутамата (г-н 147,13 г / моль), пенициллина (10000 ЕД / мл) / стрептомицина (10000 мкг / мл) [250 мкл / 50 мл] , 1 мМ HEPES (г-н 238,3 г / моль), 10% тепла инактивированной сыворотки доноров лошади) и добавить клетки пластины. Swirl пластины аккуратно распределяют клетки равномерно. HI-доноров лошадиной сыворотки добавляются в покрытие медиа для обогащения клеток в течение первых 24 часов роста. Клетки впоследствии отлученных от сыворотки и вернулся в бессывороточной среде серийных снижение в сыворотке крови при каждой замене средств массовой информации. Следует также отметить, что в то время как глутамат при более высоких концентрациях является токсичным для нейронов клеточных культур, в более низких концентрациях добавить здесь, она будет тормозить присоединение без нервных клеток ^11. Тем не менее, она должна быть добавлена ​​только в покрытие средств массовой информации в течение первых 24 часов в культуре, а затем исключены из любого кормления СМИ, чтобы предотвратить нейротоксичность клеток.
5. Pкружева нейронов в 37 ° C, 5% СО ₂ инкубатор ночь.
6. Удаление половины объема информации из клетки и замените же объем Neurobasal СМИ питания (Neurobasal Среды, содержащие B27 Дополнение [1 мл / 50 мл], 0,5 мМ глютамина решение, пенициллина (10000 ЕД / мл) / стрептомицина (10000 мкг / мл) [250 мкл / 50 мл], 1 мМ HEPES (г-н 238,3 г / моль).
7. Нейроны нужно кормить каждые 4 дня, удаляя половину старых средств массовой информации и заменить ее такой же объем свежей Neurobasal СМИ питания. Нейронных процессов следует начинать, чтобы быть видимыми на 1 день (рис. 5а) и стала распространенной на 10 день (рис. 5б).

6. Представитель Результаты

Способность к росту и культуры первичных нервных клеток стала незаменимой частью нейронауки. Первичные культуры позволяет исследователю анализировать специфический клеточный пути, химическая модификация и лечения, цель LOCлизации и динамику роста в контролируемой среде. Многие из этих процедур используют сложные методологии для визуализации конкретных изменений в клеточных ответов. В этом случае нейронов гиппокампа используются для изучения конкретных нейронных путей, которые оказались бы трудно, если не невозможно проанализировать в интактном мозге. Подготовка у однородной популяции нейронов из конкретных областей мозга, имеет решающее значение для изучения функций мозга. Молекулярные эффекты в отдельных нейронах может играть важную роль в разграничении высшего порядка путей, таких как память или обучение. В этот протокол дает относительно чистых культурах нейронов гиппокампа, без необходимости подачи слой глиальных клеток, эти нейроны легко использованы для иммунофлюоресценции исследования. Однако, как и все основные культуры, от органов, содержащих несколько типов клеток, некоторые загрязнения менее нужные ячейки может произойти. В изоляции нервных клеток, загрязнение глиальных клеток может быть общей проблемой. Глиальных клеток сбыть легко обнаружены при микроскопическом визуализации культуры, как их морфология, существенно отличается от целевого нейронов (рис. 6). Влияние глиальные клетки загрязнение будет зависеть от планируемого использования культур. Если клетки используются для иммуно-флуоресценции экспертизы, глиальные загрязнения может быть не более чем неудобство, когда пытался сфотографировать отдельные нейроны. Однако, если нейронных культур, которые будут использоваться для биохимического анализа, любое значительное загрязнение глиальных клеток может привести к существенным изменениям в результатах. Способы решения глиальных клеток загрязнения, изложенные далее в обсуждение.

Когда нейроны успешно изолированы и выращены в культуре, одного типичного приложения для изучения клеточных процессов иммуно-флуоресценции техники. Как показано на рисунке 7, органеллы, такие как митохондрии, могут быть окрашены использованием витальных красителей добавлены в культуре средств массовой информации до исправитьЦ И А Ц. Эндогенные клеточные белки могут быть визуализированы с фиксированных клеток с использованием стандартных иммунофлуоресценции методов (рис. 8). Как только нервные клетки неподвижны, специфические антитела к белкам ставки могут быть введены в ячейку, и эти белки могут быть визуализированы помощью флуоресцентного микроскопа. Искусственный нейронов также обеспечивают исследователей со средствами для проверки отдельных эффектов белка на нейронных функций. Используя различные методы, в том числе ДНК трансфекции, электропорации или вирусной трансдукции, белки могут быть избыточно экспрессируется в нейронах (рис. 9). Как нервные клетки реагируют на воздействие более выраженной белков может иметь прямое выводы о том, как мозг может реагировать и дает возможность выявления клеточных мишеней для лекарственной терапии. Детали этих типов экспериментов выходит за рамки данной статьи, но они показывают, что культуры подготовленный этой технике подходят для широкого спектра вниз-х годовtream приложений. Тем не менее, общая простота этого протокола, а также, на короткий период времени, необходимого для подготовки этих нейронов культуры сделать это идеальный метод для использования в неврологии сегодня лаборатория.

Рисунок 1. Препарирование мозга пренатальной мыши. Первый разрез вдоль средней линии мозга, разделяющей его на два полушария.

Рисунок 2. Расположение гиппокампа в пренатальный мозг мыши. Полосатое тело перемещается в сторону визуализации гиппокампа и отмечается изогнутый "фасоль" типа структуры в дистальной части каждого полушария.

Рисунок 3. Диссоциация ткани гиппокампа в растворе трипсина.

Рисунок 4. Пастера наконечники, используемые в растирания ткани гиппокампа. (А) Нормальная Пастера пипетки. (Б) огневой полировкой Пастера пипетки. Обратите внимание на скругленные края и приблизительное 50% уменьшаются в размерах открытия пипетки.

Рисунок 5. Нейронов гиппокампа изолированы с помощью этой процедуры и покрытием в NB СМИ. (А) роста клеток 1 день после покрытия. Нейронные процессы начинают быть видимыми в 1 день. (Б) роста клеток 10 дней после покрытия, невриты разветвленных и перекрытия.

Рисунок 6. Нейронов гиппокампа загрязненных глиальных клеток, выращенных в течение 7 дней и окрашенных маркеров органелл MitoTracker Красной CM-H2XRos (Invitrogen # M7515) и transfeИДКТК с GFP-LC3 использованием липофектамина 2000 (Invitrogen # 11668019). Митохондрии видны во всех клетках, однако, только один нейрон успешно трансфицированных флуоресцентные конструкции. Загрязнение глиальных клеток делает анализ GFP-LC3 выражение в нейронных процессах трудно себе представить.

Рисунок 7. Нейронов гиппокампа выросли на 7 дней и окрашенных маркеров органелл MitoTracker Красной CM-H ₂ XRos (Invitrogen # M7513). Этот жизненно важный краситель используется для окраски активных митохондрий в клетках тканевой культуры. Клетки фиксировали в 4% параформальдегид / PBS и визуализация методом флуоресцентной микроскопии. Краска сама не является люминесцентная до окисляется в митохондриях. Активность митохондрий можно увидеть во всем нейронных процессов.

Рисунок 8.

Рисунок 9. Гиппокампа нейронов культуры выращивали в течение 5 дней и трансфицированных GFP-LC3β ДНК построить использованием липофектамина 2000 (Invitrogen # 11668019). На 7 день, клетки были установлены с помощью 4% параформальдегид / PBS и aggresomes с GFP помеченный LC3β включены в их внешней мембраны были визуализированы с помощью флуоресцентного микроскопа. Aggresomes расположены по всему телу клетки и невриты и обозначены стрелками.

Discussion

Гиппокампа культур используются в молекулярной биологии уже более 20 лет. Хотя в принципе нейронных культур могут быть сделаны из любой части мозга, гиппокампа культуры оказались самыми популярными в связи с относительно простой архитектуры населения нервных клеток в гиппокампе ^7. Гиппокампа культур, как правило, из поздних стадиях эмбриональной ткани. Эта ткань легче отделить и содержит меньшее количество глиальных клеток, чем зрелые ткани головного мозга ^1. Выделение нейронов гиппокампа из эмбриональной ткани также уменьшается сдвиг повреждение аксонов и дендритов, в связи с меньшим сцепление контактов ^3. В то время как гиппокамп культур наиболее часто возникает у крыс из-за относительно легче изоляция гиппокампе мышей может использоваться с теми же протоколами, если соответствующее внимание уделяется в ткани изоляции. Когда нейроны культивировали, умение использовать современные молекулярные методы анализа субклеточных лocalization и торговли могут быть использованы. Это может быть особенно выгодно при анализе эмбриональные смертельные трансгенных мышей, так как предоставляет возможность изучать белковых взаимодействий, которые приводят к гибели эмбриона.

Гиппокамп был вовлечен в пространственных и контекстной обучения ⁵ и памяти ^6. Рост первичных культур из гиппокампа может позволить корреляция между субклеточных биологических событий и их влияние на способность мозга учиться и запоминать.

Как и все нервные клетки, нейроны, выращенные из гиппокампа культуры требуют важнейших факторов роста, гормонов и аминокислот. В мозге эти факторы обеспечивают глиальных клеток. Этот симбиоз может быть выполнена в культуру среды ростом "подачи" слой глиальных клеток, наряду с культурной нейронов. Тем не менее, глиальные клетки также будет производить цитотоксические факторы во время их жизни ¹¹ Втакие могут быть токсичными для культивируемых нейронов. Чтобы обойти это, нейроны были выращены в сыворотке крови, свободные средства массовой информации, таких как Neurobasal среде с B27. B27 добавки оптимизированы для выживания нейронов гиппокампа, но будет поддерживать рост других нейронов культуры, а ^4. L-глютамин является незаменимой аминокислотой для производства энергии и синтеза белка в клеточной культуре. Тем не менее, глютамин может быть лабильным течением времени, унижающего на аммиак и карбоновые кислоты, побочные раз добавлена ​​в культуре средств массовой информации. Glutamax, дополнения культуры клеток из Invitrogen, может быть использована в качестве прямой заменой L-глутамин, если это необходимо. Glutamax является более стабильной в средствах массовой информации, но немного дороже. Рост нейронов в сыворотке крови, свободных средств массовой информации позволяет изучать эффект факторов роста и гормонов на рост нейронов и дифференциации.

Мы представить протокол для быстрого выделения из нейронов гиппокампа мыши пренатальной эмбрионов с использованием средств массовой информации и Neurobasal B27 supplemЛОР для роста нейронов в бессывороточной среде без использования фидерных клеток. Как и во всех культурных первичных протоколов клетки, целесообразно, чтобы минимизировать рост без желаемого типа клеток (например, глиальных клеток). Это наиболее легко осуществлять тщательный рассечение гиппокампа от окружающих областей мозга. Пренатальная клетки также содержат сравнительно небольшое число глиальных клеток помощь в достижении этой цели. Тем не менее, глиальные клетки загрязнение все еще может произойти. Это позволило сократить глиальные клетки загрязнений путем обработки цитозинарабинозид (AraC) на ранних моментов времени в культуре ^8,9. AraC может быть использован в качестве анти-митотический агент по сокращению населения не-нервных клеток способны с синтезу ДНК. Тем не менее, чтобы избежать возможных токсических эффектов лечения на нейроны, она должна быть использована на самой низкой эффективной делает (5 мкм), а не добавляется после 3-4 дней культуры ^11. Другим вариантом может быть использование 5-фтор-2'-дезоксиуридина (ФУДР) обращение в десятичнуюувеличение происходит доля фибробластов-реактивных клеток микроглии ^10.

После уборки урожая, ткани гиппокампа можно лечить с помощью разбавленного раствора трипсина отделить / разбивки прилипшие клетки. Тем не менее, длительное воздействие высоких концентраций трипсина может быть пагубным для клетки субкультуры, так что время в растворе трипсина чаще всего ограничиваются между 3-5 минут. Разбавленной концентрации трипсина, используемые в настоящем протоколе действительно позволяет более длительное время инкубации фермента увеличить отдельные сотовые диссоциации, но следует позаботиться, чтобы строго придерживаться временных точках при условии. Папаин может быть использована в качестве альтернативы фермента и было доказано, что более эффективным и менее разрушительной определенные ткани, такие как нейроны сетчатки ^10.

Сотовые диссоциации с последующим растиранием ткани. Это оказалось самым важным шагом в последовательной нейронной культуры и подсвечивается двумя важными Пуанкарец. Первые две стерильные пипетки Пастера используются в этом процессе. Первый используется для грубой нарушить ткань / сотовая связь. Открытие размер этой первой пипетки должна быть в пределах 1,0-1,5 мм. Тщательный отбор пипетки непосредственно от производителя пакет, как правило, приводит к соответствующей пипетки для первого растирания. Вторая пипетка Пастера используется "огневой полировкой" за горелку, чтобы уменьшить размер открытия примерно 0,5 мм в диаметре. Это также приводит к "полировке" стеклянное кольцо открытия на гладкой поверхности снижение механических повреждений клетки, как они проходят. Во-вторых, скорость / силу растирания через пипетку, имеет большое значение. В клетках отмежеваться от всей ткани, они, конечно, более хрупким. Таким образом, "грубый" режим, эта точка будет иметь пагубные последствия для выживания нервных клеток. Трипсином ткань должна быть пассировать через пипетку на последовательное, но твердо расхода. Распространенной ошибкой при йэлектронной исследователь идея того, чтобы полностью дистанцироваться ткани, пока не заметно структура остается. В большинстве случаев, это приведет к массовой гибели нейронов, как клетки будут слишком пострадали от повторных механических манипуляций. Указанное количество раз пройти через ткань пипеткой приведет в достаточном количестве нейронов, не приводя к валовой ущерб населению.

После того, клетки были диссоциированы и объединены, Трипановый синевы аликвоты клеток обеспечит соотношение жить с мертвыми клетками. Как правило, 75-80% клеток должны пережить процесс сбора урожая и могут быть использованы для нанесения покрытий. Трипановый Синяя окраска также может быть использован для получения точного количества клеток, когда сделано на гемоцитометра. На практике, как только общее число клеток достигается, добавить 20% к общей и использовать это номер ячейки для металлизации к ответственности за примерное количество гибели клеток. Номера представлены в указанных протоколов являются хорошим startiнг точкой для достижения хорошей плотности нейронов. Если нейрон плотность слишком мала на покрытие, клеточный рост, скорее всего, не будет достаточным покрытием плотностью является важной переменной в распространении клеточной популяции. Клетки должны питаться раз в четыре дня с B27/Neurobasal медиа-канал. Рост нейронов в этих условиях может легко осуществляться с 10-14 дней в области культуры и был использован для распространения нейронов ² из 30 дней в культуре, когда посеяны на 80 клеток / мм ^2.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat Tail Collagen 1	BD Biosciences	354236
Poly-D-lysine Solution	Chemicon	A-003-E
Hanks Balanced Salt Solution	Invitrogen	14175-095
Trypsin Solution (1X) 0.25%, liquid	Invitrogen	15050-065
NeuroBasal Medium (1X) liquid	Invitrogen	21103-049
B27 Supplement (50X) liquid	Invitrogen	17504-044
L-Glutamine 200 mM (100X) liquid	Invitrogen	25030-149
Penicillin (10,000 units/ml) / Streptomycin (10,000 μg/ml)	Invitrogen	15140-148
HI-Donor Horse Serum	Atlanta Biologicals	S12150H