Het beoordelen van de lever metabole veranderingen tijdens Progressieve kolonisatie van Kiemvrije Mouse door 1 H NMR-spectroscopie

Summary

Een progressieve kolonisatie procedure wordt beschreven om nader te beoordelen de impact ervan op de host levermetabolisme. Colonization is gecontroleerd non invasief door het evalueren van de urinaire excretie van microbiële metabolieten door co-NMR-based metabool profiel, terwijl levermetabolisme wordt beoordeeld door de hoge resolutie Magic Angle Spinning (HR MAS) NMR profilering van intact biopsie.

Abstract

Het is bekend dat darmbacteriën belangrijke bijdrage leveren aan de host-homeostase en biedt een scala aan voordelen, zoals bescherming van het immuunsysteem en vitamine synthese. Zij verzorgen ook de gastheer met een aanzienlijke hoeveelheid aan voedingsstoffen, waardoor dit ecosysteem een ​​essentiële metabolische orgaan. In de context van steeds meer bewijs van het verband tussen de darmflora en het metabool syndroom, het begrip van de metabole interactie tussen de gastheer en zijn darmflora is steeds een belangrijke uitdaging van de moderne biologie. ^1-4

Kolonisatie (ook wel aangeduid als normalisatie proces) wijst het opzetten van micro-organismen in een voormalige kiem-vrije dieren. Hoewel het een natuurlijk proces optreedt bij de geboorte, wordt het ook gebruikt bij volwassen kiemvrije dieren naar de darm bloemen ecosysteem-controle en verder bepalen de impact ervan op de host stofwisseling. Een gemeenschappelijke procedure om de kolonisatie procesbeheersing is om de maagsonde methode te gebruiken met een single of een mengsel van micro-organismen. Deze methode resulteert in een zeer snelle kolonisatie en presenteert het nadeel van de uiterst stressvolle ^5. Daarom is het nuttig om de stress te minimaliseren en een tragere kolonisatie proces te krijgen geleidelijk houden aan de invloed van bacteriële vestiging op de host stofwisseling.

In dit manuscript beschrijven we een procedure om de wijziging van metabolisme in de lever te beoordelen tijdens een geleidelijke kolonisatie proces met behulp van een niet-destructieve metabool profiel techniek. Wij stellen voor om darm microbiële kolonisatie monitor aan door het beoordelen van de darm microbiële metabolische activiteit weerspiegeld door de urinaire excretie van microbiële co-metabolieten door ^een H NMR-based metabool profiel. Hierdoor kan een appreciatie van de stabiliteit van de darm microbiële activiteit buiten de stal oprichting van de darm microbiële ecosysteem meestal bepaald door het bewaken van fecale bacteriën door DGGE (denaturerende gradiënt gel elektroforese). ⁶ Dekolonisatie vindt plaats in een conventionele open omgeving en wordt geïnitieerd door een vuile nest bevuild door middel van conventionele dieren, die zal dienen als controle. Knaagdieren worden coprophagous dieren, dit zorgt voor een homogene kolonisatie zoals eerder beschreven. ⁷

Hepatische metabool profiel wordt direct gemeten vanaf een intacte lever biopsie met behulp van ^een H met hoge resolutie Magic Angle Spinning NMR spectroscopie. Deze semi-kwantitatieve techniek biedt een snelle manier om te beoordelen, zonder beschadiging van de celstructuur, de belangrijkste metabolieten zoals triglyceriden, glucose en glycogeen om verdere raming van de complexe interactie tussen de kolonisatie proces en het levermetabolisme ^7-10. Deze methode kan ook worden toegepast op elk weefsel biopsie ^11,12.

Protocol

1. Kolonisatie van kiemvrije dieren en monsters verzamelen van Verwijder kiemvrije dieren uit isolatoren en onderbrengen in een conventionele veehouderij kamer in kooien zijn uitgerust met een filter in de voorkant van de gebruikelijke dieren, die zal dienen als controles (figuur 1). Meng de helft van het nest (3 dagen oud) uit de controle-conventionele kooi met het nest van de kiem-vrije dieren. Altijd 1 / 3 van de vuile conventionele nest elke keer is het nodig om het te vernieuwen met het oog op …

Discussion

In dit protocol beschreven we een progressieve kolonisatie procedure in een open omgeving om verder te onderzoeken de impact van de darmflora op levermetabolisme beoordeeld door ^een H-HR-MAS NMR profilering van intacte biopsie. Verschillende methoden van kolonisatie zijn beschreven in de literatuur. De meest voorkomende methoden om dieren te koloniseren met een gedefinieerde microbiota zijn orale sondevoeding of verontreinigd drinkwater ^19,20. Fecale inoculatie kan ook gebruikt worden zoals hiervoo…

Materials

Table of specific reagents and equipment:

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
2.5 mm microtube	New Era	NE-H5/2.5-V-Br
1.7 mm capillary tube	Sigma-Aldrich	NORS175001
Capillary adapter	New Era	NE-325-5/1.7
Extraction rod	New Era	NE-341-5
HR-MAS rotor BL4 with 50 μL spherical Teflon spacer kit	Bruker	HZ07213
Tool kit for 50 μL inserts	Bruker	B2950
Advance III 600 MHz NMR	Bruker
1H HR MAS NMR solid probe	Bruker
Deuterium oxide 99.9 %	Sigma-Aldrich	530867-1L
3-(trimethylsilyl)propionic acid-d4 (TSP)	Sigma-Aldrich	269913