Avaliar as alterações metabólicas hepáticas Durante a colonização progressiva de Germ-free Mouse 1 H NMR Spectroscopy

Summary

Um procedimento de colonização progressiva é descrito para melhor avaliar seu impacto sobre o metabolismo hepático host. Colonização é monitorado não invasiva através da avaliação da excreção urinária de microbiana co-metabólitos por RMN baseado em perfil metabólico, enquanto o metabolismo hepático é avaliado pela Alta Resolução Magia Angle Spinning (MAS HR) NMR perfil da biópsia intacta.

Abstract

É bem conhecido que as bactérias do intestino contribuir significativamente para a homeostase host, fornecendo uma gama de benefícios como a proteção imunológica e síntese de vitaminas. Eles também fornecem o host com uma quantidade considerável de nutrientes, fazendo com que este ecossistema um órgão metabólicas essenciais. No contexto da crescente evidência da relação entre a flora intestinal e síndrome metabólica, a compreensão da interação metabólica entre o anfitrião e sua microbiota intestinal está se tornando um desafio importante da biologia moderna. ^1-4

Colonização (também referida como processo de normalização) designa o estabelecimento de micro-organismos em um animal livre de germes ex. Embora seja um processo natural que ocorre no nascimento, é também utilizado em adulto livre de germes animais para controlar o ecossistema intestinal floral e ainda determinar o seu impacto sobre o metabolismo hospedeiro. Um procedimento comum para controlar o processo de colonização é a utilização do método de gavagem com um single ou uma mistura de micro-organismos. Este método resulta em uma colonização muito rápido e apresenta a desvantagem de ser extremamente estressante ^5. Portanto, é útil para minimizar o estresse e obter um processo mais lento de colonização para observar gradualmente o impacto da criação de bactérias sobre o metabolismo hospedeiro.

Neste manuscrito, nós descrevemos um procedimento para avaliar a modificação do metabolismo hepático durante um processo de colonização gradual utilizando uma técnica não destrutiva de perfil metabólico. Propomos para monitorar a colonização microbiana do intestino através da avaliação da atividade metabólica microbiana do intestino refletida pela excreção urinária de microbiana co-metabólitos por ^um perfil H RMN baseado metabólica. Isto permite uma apreciação da estabilidade da atividade microbiana do intestino, além do estabelecimento estável do ecossistema microbiano do intestino geralmente avaliado pelo monitoramento bactérias fecais por DGGE (eletroforese em gel de gradiente de desnaturação). ⁶ Acolonização ocorre em um ambiente convencional aberta e é iniciada por uma maca, suja de animais convencionais, que servirá como controle. Roedores são animais coprófagos, isso garante uma colonização homogênea como descrito anteriormente. ⁷

Perfil metabólico hepático é medido diretamente a partir de uma biópsia do fígado intacto utilizando ¹ H Angle Magia Alta Resolução Spinning espectroscopia de RMN. Esta técnica semi-quantitativa oferece uma forma rápida de avaliar, sem danificar a estrutura da célula, os principais metabolitos, tais como triglicérides, glicose e glicogênio, a fim de estimar mais a complexa interação entre o processo de colonização e do metabolismo hepático ^7-10. Este método também pode ser aplicado a qualquer tecido biópsia ^11,12.

Protocol

1. Colonização do germe-free animais e coleta de amostras Remover livre de germes animais de isoladores e abrigá-los em uma sala de criação em gaiolas convencionais equipados com filtro na frente dos animais convencionais, que servirão como controles (Figura 1). Meia mistura do lixo (3 dias) retirado da gaiola de controle convencional, com a ninhada dos animais germ-free. Mantenha sempre 1 / 3 do lixo sujos convencionais cada vez que é necessário renová-lo, a fim de manter um nível de bact…

Discussion

Neste protocolo, descrevemos um procedimento colonização progressiva em um ambiente aberto para investigar o impacto da microbiota intestinal no metabolismo hepático avaliado por ¹ H RMN HR MAS perfil da biópsia intacta. Vários métodos de colonização têm sido descritos na literatura. Os métodos mais comuns para colonizar animais com microbiota definida são gavagem oral ou água contaminada ^19,20. Inoculação de fezes também pode ser usado como descrito anteriormente ^21. O m?…

Materials

Table of specific reagents and equipment:

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
2.5 mm microtube	New Era	NE-H5/2.5-V-Br
1.7 mm capillary tube	Sigma-Aldrich	NORS175001
Capillary adapter	New Era	NE-325-5/1.7
Extraction rod	New Era	NE-341-5
HR-MAS rotor BL4 with 50 μL spherical Teflon spacer kit	Bruker	HZ07213
Tool kit for 50 μL inserts	Bruker	B2950
Advance III 600 MHz NMR	Bruker
1H HR MAS NMR solid probe	Bruker
Deuterium oxide 99.9 %	Sigma-Aldrich	530867-1L
3-(trimethylsilyl)propionic acid-d4 (TSP)	Sigma-Aldrich	269913