جنبا إلى جنب تقارب تنقية هو نهج قوي للتعرف على شركاء بروتين ملزمة. كدليل على المفهوم، تم تطبيق هذه المنهجية على eIF4E ترجمة جيدة تتميز عامل البدء إلى راسب المشترك العوامل الخلية المضيفة المشاركة في بدء الترجمة. ويتم تكييف هذه الطريقة بسهولة إلى أي بروتين خلوي أو فيروسي.
والخطوة الحاسمة، والحد من كثير من الأحيان في فهم وظيفة المضيفة والبروتينات الفيروسية هو تحديد التفاعل شركاء بروتين خلوي أو فيروسي. هناك الكثير من النهج التي تتيح التعرف على شركاء التفاعل، بما في ذلك نظام هجين 2 الخميرة، وكذلك سحب المقايسات كما انخفض استخدام البروتينات المؤتلف ومناعي للبروتينات الذاتية تليها تحديد قياس الطيف الكتلي 1. وقد أبرزت الدراسات الحديثة فائدة مزدوجة تقارب العلامة تنقية بوساطة، إلى جانب اثنين من الخطوات شطف محددة في تحديد البروتينات المتفاعلة. واستخدمت في البداية لهذا النهج، ووصف تنقية الانجذاب جنبا الى جنب (وات)، في خميرة 2،3 لكن في الآونة الأخيرة قد تم تكييفه لاستخدامه في خلايا الثدييات 4-8.
كما إثبات المفهوم، من وضعنا تنقية تقارب جنبا إلى جنب (وات) طريقة استخدام جيدا تتميز ترجمة حقيقية النواة بدء القوات المسلحة الكونغوليةتور eIF4E 9،10. عامل ترجمة الخلوية eIF4E هو عنصر حاسم من مجمع eIF4F الخلوية العاملة في كاب يعتمد على بدء ترجمة 10. وتتكون العلامة وات المستخدمة في الدراسة الحالية من وحدتين G البروتين والببتيد streptavidin ملزم مفصولة فيروس إحفر التبغ (TEV) البروتيني تسلسل الانقسام. وتتكون العلامة وات المستخدمة في الدراسة الحالية من وحدتين G البروتين والببتيد streptavidin ملزم مفصولة فيروس التبغ إحفر (TEV) البروتيني تسلسل انشقاق 8. للتخلي عن الحاجة إلى جيل من خطوط الخلايا نسيلي، قمنا بتطوير نظام سريع يعتمد على التعبير عن برنامج المشورة التقنية الموسومة بروتين الطعم من البلازميد episomally حافظت على أساس pMEP4 (إينفيتروجن). وتمت السيطرة التعبير عن eIF4E الفئران الموسومة من هذا البلازميد باستخدام محرض كلوريد الكادميوم المروج metallothionein.
تحلل الخلايا التعبير عن واللاحقة تنقية تقارب عبر الربط إلى Rabbit مفتش الاغاروز، TEV انشقاق الأنزيم البروتيني، الربط إلى الاغاروز streptavidin مرتبط واللاحقة شطف البيوتين تحديد البروتينات المحددة العديدة على ما يبدو إلى eIF4E المنسدلة (بالمقارنة مع السيطرة على خطوط الخلايا معربا عن علامة TAP وحدها). وقد تم الحصول على هويات من البروتينات عن طريق الاستئصال من العصابات من 1D SDS-PAGE واللاحقة جنبا إلى جنب مطياف الكتلة. وشملت العناصر التي تم تحديدها من البروتينات المعروفة eIF4E ملزم eIF4G و4EBP-1. وبالإضافة إلى ذلك، المكونات الأخرى للمجمع eIF4F، من هو الذي eIF4E تم تحديد عنصر، وهي eIF4A وبولي بروتين ملزمة. القدرة على تحديد ليس فقط يعرف شركاء الربط المباشر، فضلا عن الثانوية البروتينات المتفاعلة، يسلط الضوء على مزيد من جدوى هذا النهج في توصيف البروتينات من وظيفة غير معروفة.
تقنية العنونة وات يتضح هنا يدل على طريقة محددة للغاية وصرامة لعزل شركاء ملزم للبروتينات الطعم في الخلايا حقيقية النواة. ويمكن تطبيق هذا النهج على البروتينات الخلوية والفيروسية. على حد علمنا، هذه هي المرة الأولى التي يتم فيها تطبيق هذه التقنية لعامل eIF4E ترجمة بدء. تحديد eIF4G eIF4E البروتينات ملزم المعروفة و4EBPs وباستخدام هذه التقنية ويؤكد على صحة هذا النهج. وبالإضافة إلى ذلك، وتحديد العنصر المتبقي من مجمع eIF4F، وهي eIF4A، وPABP يؤكد ان التفاعل غير المباشر ومجمعات التعليم العالي، لا تزال سليمة خلال عملية تنقية. وكان التعرف على الأشكال الإسوية متعددة من البروتينات الكنسي ملزم eIF4e واضحة أيضا. يتم وصف هذه في مزيد من التفاصيل في الشكل 2.
فيما يتعلق بالقيود على النهج، ينبغي توخي الحذر معينة فيما يتعلق باختيارمن البروتين و الطعم. أو عدم وضع علامة TAG في N-أو محطة-C قد يكون من المستحسن لإجراء فحص وظيفي أو دراسة توطين انصهار بروتين بواسطة المجهر قبل تنقية النطاق الكامل لضمان مشتق الموسومة هو وظيفي. قد لا يتجزأ أو بروتينات غشاء نووي بالضرورة أن صدر عن ظروف منظف معتدل نسبيا وصفها في خطوة تحلل. كما هو الحال مع جميع immunoprecipitations وفحوصات مماثلة المنسدلة، يمكن إجراء تعديلات على طبيعة وتركيز المنظفات في المخزن المؤقت تحلل إلى زيادة كفاءة تحلل. ويمكن أيضا تركيز أيوني للمخازن وتحلل الغسيل يمكن تعديلها لزيادة أو نقصان صرامة للتنقية. ومن الممكن أيضا لأداء تنقية أولية تحت ظروف معتدلة معيار (المذكورة أعلاه) ولكن بعد ذلك تفرق الخرز streptavidin (القسم 5.8) في aliquots 4-5، والتي يمكن بعد ذلك يتم غسلها تحت يخدع الأيونية زيادةditions. هذا قد تمكن المستخدم من تحديد الظروف المثلى التي تعمل على إزالة غير محددة البروتينات المتفاعلة. ويمكن أيضا أن العملية برمتها يمكن تنفيذها باستخدام ترنسفكأيشن عابر حيث من المعروف أن الشركاء التفاعل وجودها أو عدم وجود يحددها طخة غربية لاحقة فقط. في هذه الحالة نقترح 2 100cm 2 أطباق من الخلايا كل transfected مع 8 ميكروغرام التعبير البلازميد. هذا الإجراء هو تعديل للاستخدام خاص عند النظر في قدرة المشتقات متحولة من البروتين TAP-انصهار للتفاعل مع شركاء ملزم معروف.
تحليل عينات من 1 إلى 8 في المواد الهلامية الفضة SDS-PAGE الملون (أو لطخة غربية ما إذا كان الجسم المضاد هو متاح) هو وسيلة ممتازة لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها، يجب أن تفشل هذه التقنية لتوليد نتائج مقبولة. ويمكن تحليل كفاءة كل هطول الأمطار تقارب القائم وشطف محددة باستخدام هذا النهج أخذ العينات بطريقة منهجية. وينبغي أخذ عينات 1-8 خلال OPTIMسعودة للبروتوكول لكل بيت جديد.
تقنية العنونة البرنامج يوفر بديلا قويا وقوية لمناهج أخرى مثل ضريبة السلع والخدمات سحب هبوطا، خميرة 2 المقايسات هجين وما إلى ذلك. تنقية تقارب مزدوجة وخطوات محددة شطف (انشقاق TEV وشطف البيوتين) توفير خصوصية وصرامة على الإبقاء على ارتفاع مستوى طوال الإجراء تنقية. ويمكن للغاية أن تطبق هذه التقنية إلى أي بروتين، ويمثل ذلك وسيلة ممتازة للتعرف على شركاء ملزم لهدف بروتين من الفائدة.
The authors have nothing to disclose.
وقد تم تمويل هذا البحث من قبل الزمالة ويلكوم ترست كبار منحت للدكتور إيان Goodfellow.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Hygromycin B | Roche | 10843555001 |
Rabbit IgG Agarose | Sigma | A2909 |
AC-TEV Protease | Invitrogen | 12575-015 |
Protease inhibitor cocktail | Calbiochem | 539134 |
Ultralink Immobilized Streptavidin Plus beads | Pierce | 53116 |
Vivaspin 500 centrifugal concentrator (5KDa) | Vivaspin | V50112 |
SilverQuest silver staining kit | Invitrogen | LC6070 |
Novex Colloidal Blue Coomassie staining kit | Invitrogen | LC6025 |
1.7ml prelubricated tubes | Costar | 3207 |
Microcapillary pipette tips | VWR | 37001-150 |
NuPage 4-12% Bis-Tris gradient gels | Invitrogen | NP0322BOX |
CdCl2 | Sigma | 202908 |
5x SDS Sample Buffer | Fisher | PN39000 |