Tandem purificazione per affinità è un valido approccio per l'individuazione di partner di legame proteico. Come prova di concetto, questa metodologia è stata applicata al ben caratterizzato eIF4E fattore di inizio traduzione di co-precipitato i fattori coinvolti in cellule ospiti di inizio di traduzione. Questo metodo è facilmente adattabile a qualsiasi proteina cellulare o virale.
Un punto critico e spesso limitante comprendere la funzione di host e proteine virali è l'identificazione di parti interagenti proteine cellulari o virali. Ci sono molti approcci che permettono l'identificazione di partner interagenti, compreso il sistema del doppio ibrido di lievito, nonché abbassarle saggi utilizzando proteine ricombinanti e di immunoprecipitazione di proteine endogene seguita dalla identificazione spettrometria di massa 1. Recenti studi hanno evidenziato l'utilità del doppio affinità purificazione tag mediata, accoppiato con due passi di eluizione specifici l'identificazione di proteine che interagiscono. Questo approccio, definito Tandem purificazione per affinità (TAP), è stata inizialmente utilizzata nel lievito 2,3 ma più recentemente è stato adattato da utilizzare in cellule di mammifero 4-8.
Come proof-of-concept che abbiamo stabilito una purificazione per affinità tandem (TAP) il metodo con il ben caratterizzato eucariotica traduzione iniziazione factor eIF4E 9,10. il cellulare eIF4E fattore di traslazione è una componente critica del complesso eIF4F cellulari coinvolti nella cap-dipendente inizio della traduzione 10. Il tag TAP utilizzato in questo studio si compone di due unità proteina G e un peptide streptavidina vincolante separati da un virus Tobacco Etch (TEV) clivaggio sequenza proteasi. Il tag TAP utilizzato in questo studio si compone di due unità proteina G e un peptide streptavidina vincolante separati da un virus Tobacco Etch (TEV) clivaggio sequenza proteasi 8. Per rinunciare la necessità per la generazione di linee cellulari clonali, abbiamo sviluppato un sistema rapido che si basa sull'espressione del TAP-tag proteina esca da un plasmide episomally mantenuto base pMEP4 (Invitrogen). Espressione di targhetta eIF4E murino da questo plasmide è stato controllato mediante il cloruro di cadmio promotore inducibile metallotioneina.
Lisi delle cellule esprimenti e successiva purificazione per affinità tramite legame rabbit IgG agarosio, clivaggio della proteasi TEV, l'associazione a streptavidina legata agarosio e successiva eluizione biotina identificato numerose proteine apparentemente specifiche per il eIF4E pull-down (rispetto ai controlli linee cellulari che esprimono il tag TAP solo). Le identità delle proteine sono stati ottenuti mediante escissione delle bande da 1D spettrometria di SDS-PAGE e successiva massa. I componenti individuati incluse le proteine eIF4E note vincolanti eIF4G e 4EBP-1. In aggiunta, altri componenti del complesso eIF4F, di eIF4E che è un componente sono stati identificati, cioè eIF4A e Poly-A proteina legante. La capacità di identificare non solo i noti partner diretti vincolanti così come secondari proteine interagenti, evidenzia ulteriormente l'utilità di questo approccio nella caratterizzazione di proteine di funzione sconosciuta.
La tecnica di codifica TAP illustrata qui viene illustrato un metodo altamente specifico e rigoroso per isolare i partner di legame delle proteine esca in cellule eucariotiche. Questo approccio può essere applicato sia alle proteine cellulari e virali. A nostra conoscenza, questa è la prima volta una tale tecnica è stata applicata alla eIF4E fattore di iniziazione traduzione. Identificazione del noto eIF4G proteine di legame eIF4E e le 4EBPs utilizzando questa tecnica conferma la validità di tale approccio. Inoltre, l'identificazione del restante componente del complesso eIF4F, cioè eIF4A, e PABP conferma che interazione indiretta e complessi terziari rimanere intatto durante il processo di purificazione. L'identificazione di isoforme multiple dei canonici eIF4E proteine di legame era anche evidente. Questi sono descritti in maggiore dettaglio nella figura 2.
Per quanto riguarda i limiti del metodo, certa attenzione dovrebbe essere presa per quanto riguarda la sceltadi proteine e se esca o meno per posizionare l'etichetta TAG alla N-o C-terminale. Potrebbe essere consigliabile effettuare un saggio funzionale o esaminare la localizzazione della proteina di fusione mediante microscopia prima della purificazione scala per garantire il derivato etichettato è funzionale. Integrali di membrana o proteine nucleari non possono necessariamente essere rilasciato dalle condizioni relativamente blande detergenti descritte nella fase di lisi. Come con tutti immunoprecipitazioni e simili pull-down saggi, modifiche possono essere apportate alla natura e concentrazione del detersivo nel tampone di lisi per aumentare l'efficienza di lisi. La concentrazione ionica dei buffer di lisi e lavaggio possono anche essere modificati per aumentare o ridurre la severità della purificazione. E 'anche possibile eseguire la purificazione iniziale in normali condizioni blande (sopra descritto), ma successivamente dividere i talloni sezione streptavidina (5,8) in aliquote 4-5, che possono successivamente essere lavate sotto crescente con ionicazioni. Ciò può consentire all'utente di identificare le condizioni ottimali per la rimozione di proteine interagenti non-specifici. L'intero processo può essere effettuata anche mediante trasfezione transiente in cui sono note le parti interagenti e la loro presenza o assenza determinata dalla successiva western blot solo. In questo caso vi suggeriamo due 100cm due piatti di cellule trasfettate ciascuna con 8 microgrammi di plasmide di espressione. Questa procedura modificata è particolarmente utile quando esaminando la capacità dei derivati mutanti del TAP-proteina di fusione per interagire con i noti partner di legame.
Analizzando i campioni da 1 a 8 su Silver macchiati SDS-PAGE gel (o western blot se un anticorpo è disponibile) è un ottimo modo di risoluzione dei problemi, se la tecnica non riescono a produrre risultati accettabili. L'efficienza di ciascuna precipitazione affinità basata e eluizione specifica possono essere analizzati utilizzando questo approccio sistematico campionamento. I campioni da uno a otto deve essere assunto durante Optimzazione del protocollo per ogni nuova esca.
La tecnica di tagging TAP offre un'alternativa potente e robusto per altre vie, come GST pull-down, lievito due saggi ibridi ecc purificazione per affinità doppia e specifiche fasi di eluizione (TEV cleavage eluizione e biotina) forniscono specificità e rigore deve essere mantenuta ad un livello alto durante la procedura di purificazione. Criticamente questa tecnica può essere applicata a qualsiasi proteina e rappresenta quindi un metodo eccellente per individuare partner di legame per una proteina bersaglio di interesse.
The authors have nothing to disclose.
Questa ricerca è stata finanziata da una borsa di studio Wellcome Trust senior assegnato al Dr. Ian Goodfellow.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Hygromycin B | Roche | 10843555001 |
Rabbit IgG Agarose | Sigma | A2909 |
AC-TEV Protease | Invitrogen | 12575-015 |
Protease inhibitor cocktail | Calbiochem | 539134 |
Ultralink Immobilized Streptavidin Plus beads | Pierce | 53116 |
Vivaspin 500 centrifugal concentrator (5KDa) | Vivaspin | V50112 |
SilverQuest silver staining kit | Invitrogen | LC6070 |
Novex Colloidal Blue Coomassie staining kit | Invitrogen | LC6025 |
1.7ml prelubricated tubes | Costar | 3207 |
Microcapillary pipette tips | VWR | 37001-150 |
NuPage 4-12% Bis-Tris gradient gels | Invitrogen | NP0322BOX |
CdCl2 | Sigma | 202908 |
5x SDS Sample Buffer | Fisher | PN39000 |