タンデムアフィニティー精製は、タンパク質の結合パートナーを同定するための堅牢なアプローチである。コンセプトの証明として、この方法論は、翻訳開始に関与する共沈物宿主細胞因子に十分に特徴付けられた翻訳開始因子eIF4Eに適用した。このメソッドは、簡単に任意の細胞またはウイルスのタンパク質に適合されている。
ホストとウイルスタンパク質の機能を理解する上で重要かつしばしば律速段階は、細胞またはウイルスタンパク質パートナー相互作用の識別です。酵母ツーハイブリッドシステムと同様に、組換えタンパク質および質量分析同定続く1内因性タンパク質の免疫沈降を用いたアッセイをプルダウンを含む相互作用パートナーの同定を可能にする多くのアプローチがあります。最近の研究では、相互作用するタンパク質の同定つの特定の溶出ステップで結合し、ダブルアフィニティータグ媒介精製の有用性を強調している。このアプローチでは、と呼ばれるタンデムアフィニティー精製(TAP)は、最初に酵母2,3で使用されていたが、最近哺乳動物細胞で4-8を使用するように適応されています。
概念実証として、私たちは十分に特徴付けられた真核生物の翻訳開始FACを使用してタンデムアフィニティー精製(TAP)法を確立していますTorのeIF4E 9,10。携帯翻訳因子eIF4Eはキャップ依存性翻訳開始10に関与する細胞eIF4F複合体の重要なコンポーネントです。現在の研究で使用されているのTAPタグが2つのプロテインGユニットから構成され、ストレプトアビジン結合ペプチドは、タバコエッチウイルス(TEV)プロテアーゼ切断配列で区切られています。現在の研究で使用されているのTAPタグが2つのプロテインGユニットから構成され、タバコエッチウイルス(TEV)プロテアーゼ切断配列8で区切られたストレプトアビジン結合ペプチドである。クローン細胞株を生成するための必要性をあきらめるために、我々はpMEP4(Invitrogen社)に基づいて、エピソームに保持するプラスミドから、TAPタグ付きベイト蛋白質の発現に依存して迅速なシステムを開発しました。このプラスミドからのタグ付きマウスeIF4Eの発現は、塩化カドミウム誘導性メタロチオネインプロモーターを用いて制御されていました。
Rへの結合を介して発現する細胞とそれに続くアフィニティ精製の溶解abbit IgGアガロース、TEVプロテアーゼ切断は、ストレプトアビジン架橋アガロースに結合して(単独TAPタグを発現する細胞株を制御する場合と比較して)、その後のビオチンの溶出は、プルダウンeIF4Eに明らかに特定の多くのタンパク質を同定した。タンパク質の同定は、1D SDS-PAGEからのバンドの切除とその後のタンデム質量分析により得られた。識別されるコンポーネントは、eIF4Gと4EBP-1の既知のeIF4E結合タンパク質が含まれています。さらに、eIF4EがコンポーネントであるeIF4F複合体の他の成分は、eIF4Aとポリ-結合タンパク質すなわち、同定された。知られている直接の結合パートナーとしてだけでなく、二次相互作用するタンパク質だけでなく、を識別する能力は、さらに、機能未知のタンパク質の特性評価では、このアプローチの有用性を強調しています。
ここに示すTAPタギング技術は、真核細胞内でベイトタンパク質の結合パートナーを単離するための高度に特異的かつ厳格な方法を示しています。このアプローチは、細胞とウイルス両方のタンパク質に適用することができます。我々の知る限り、このような手法は翻訳開始因子eIF4Eに適用されたのは今回が初めてです。このテクニックを使用して既知のeIF4E結合タンパク質のeIF4Gと4EBPsの同定は、このようなアプローチの有効性を確認します。さらに、eIF4F複合体の残りのコンポーネントの識別、すなわちeIF4Aと、PABPは、間接的な相互作用および第三複合体が精製プロセス中にそのまま残っていることを確認します。標準的なeIF4e結合タンパク質の複数のアイソフォームの同定にも明らかであった。これらは、図2で詳細に説明されています。
アプローチの限界に関しては、一定の注意が選択肢に関しては注意が必要ですbaitタンパク質およびN末端またはC末端タグtagを配置するか否かを判定する。それは機能的アッセイを実施またはタグ誘導体の機能であることを確認する前に、フルスケールの精製に顕微鏡により融合タンパク質の局在を調べることをお勧めかもしれません。内在性膜や核タンパク質は必ずしも溶解ステップで説明されて相対的に中性洗剤を条件によって解放されない場合があります。すべての免疫沈降と同様のプルダウンアッセイと同様に、変更は溶解の効率を高めるために溶解バッファー中で自然と洗剤の濃度に作ることができる。溶解および洗浄バッファーのイオン濃度はまた、精製のストリンジェンシーを増加または減少するように変更されることがあります。それは、標準的な温和な条件(上記)で初期精製を行うことも可能ですが、その後に続いて増加するイオンの消費で洗浄することができます4月5日のアリコートにストレプトアビジンビーズ(セクション5.8)、分割ditions。これにより、ユーザーは、非特定の相互作用するタンパク質を除去する最適な条件を識別するために有効にすることができます。全体のプロセスは、相互作用パートナーが知られており、それらの有無だけで、その後のウェスタンブロットによって決定される一過性トランスフェクションを使用して実行することができます。このケースでは、発現プラスミド8μgのトランスフェクションした細胞の2 100センチメートル2皿ずつお勧めします。既知の結合パートナーと相互作用するTAP-融合タンパク質の変異体の誘導体の能力を調べるときにこの変更されたプロシージャは、特定の使用である。
テクニックは許容可能な結果を生成するために失敗した銀染色SDS-PAGEゲル(またはウェスタンブロットによる抗体が使用可能な場合)に8を介してサンプル1を分析することで、トラブルシューティングの優れた方法です。それぞれの親和性に基づく降水量と特定の溶出の効率が、この体系的なサンプリング手法を用いて分析することができます。サンプル八から一はoptim中に撮影されるべきそれぞれの新しい餌のためのプロトコルの化。
TAPタグ付け技術は、GSTのような他のアプローチはプルダウンなどの二重アフィニティー精製および特定の溶出ステップ(TEV切断部位とビオチン溶出)で維持する特異性と厳しさを提供して酵母ツーハイブリッドアッセイをに強力かつ堅牢な代替手段を提供精製工程を通して高いレベル。批判的にこの手法は、任意のタンパク質に適用することができるので、目的のタンパク質ターゲットの結合パートナーを同定するための優れた方法を表しています。
The authors have nothing to disclose.
本研究では、博士イアングッドフェローに授与ウェルカムトラストシニア·フェローシップによって資金を供給された。
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Hygromycin B | Roche | 10843555001 |
Rabbit IgG Agarose | Sigma | A2909 |
AC-TEV Protease | Invitrogen | 12575-015 |
Protease inhibitor cocktail | Calbiochem | 539134 |
Ultralink Immobilized Streptavidin Plus beads | Pierce | 53116 |
Vivaspin 500 centrifugal concentrator (5KDa) | Vivaspin | V50112 |
SilverQuest silver staining kit | Invitrogen | LC6070 |
Novex Colloidal Blue Coomassie staining kit | Invitrogen | LC6025 |
1.7ml prelubricated tubes | Costar | 3207 |
Microcapillary pipette tips | VWR | 37001-150 |
NuPage 4-12% Bis-Tris gradient gels | Invitrogen | NP0322BOX |
CdCl2 | Sigma | 202908 |
5x SDS Sample Buffer | Fisher | PN39000 |