탠덤 친화 정화 단백질 바인딩 파트너의 식별을위한 강력한 접근이다. 개념 증명으로서,이 방법론은 숙주 세포의 요인 번역 개시에 관여 공동 침전물에 잘 특성화 번역 개시 인자의 eIF4E에 적용되었다. 이 방법은 쉽게 다른 세포 또는 바이러스성 단백질에 적응하고 있습니다.
호스트 및 바이러스 단백질의 기능을 이해하는데 중요하며 종종 제한 단계는 세포 또는 바이러스성 단백질 파트너를 상호 작용의 신분증입니다. 상호 작용하는 효모 두 하이브리드 시스템을 포함한 파트너,뿐만 아니라 재조합 단백질 및 대량 분석법 식별 1 다음 내생 단백질의 immunoprecipitation을 사용하여 assays를 풀다운의 식별을 허용 여러 방법이 있습니다. 최근 연구는 상호 작용하는 단백질의 식별에 두 특정 용출 단계와 결합 이중 친화 태그 중재 정화의 유틸리티를 강조했습니다. 이러한 접근 방식은, 되나 탠덤 동질 정화 (TAP)는 처음 효모 2,3에 사용되었지만 최근에는 포유 동물 세포에서 4-8를 사용하는 적응되었습니다.
Proof-Of-Concept, 개념으로서 우리는 잘 특성화 진핵세포 번역 개시 포워드 액티브를 사용하여 탠덤 선호도 정화 (TAP) 메서드를 설립토르 eIF4E 9,10 있습니다. 셀룰러 번역 팩터 eIF4E는 캡 종속 번역 개시 10에 관련된 세포 eIF4F 복합 중요한 구성 요소입니다. 현재 연구에 사용되는 TAP 태그는 두 단백질 G 단위로 구성되어와 streptavidin 바인딩 펩타이드는 담배 엣지 바이러스 (TEV) 단백 분해 효소 절단 순서로 구분됩니다. 현재 연구에 사용되는 TAP 태그는 두 단백질 G 단위로 구성되어와 streptavidin 바인딩 펩타이드는 담배 엣지 바이러스로 구분 (TEV) 단백 분해 효소 절단 순서 8이다. clonal 세포 라인의 생성에 대한 필요성을 …없이 지내다하기 위해, 우리는 pMEP4 (Invitrogen)에 근거 episomally 유지 플라스미드의 TAP-태그를 미끼 단백질의 표현에 의존 빠른 시스템을 개발했습니다. 이 플라스미드의 태그를 murine eIF4E 표현은 카드뮴 염화물 inducible의 metallothionein 모터를 사용하여 통제되었다.
R에 바인딩을 통해 표현하는 세포와 후속 친화 정화의 용해abbit IgG 아가로 오스, TEV 프로 테아제 절단은 streptavidin 연결된 아가로 오스로 묶는 방식과 (혼자 TAP 태그를 표현하는 세포 라인을 제어하는 비교시) 이후 비오틴의 용출은 풀다운 eIF4E에 분명히 특정 다수의 단백질을 발견. 단백질의 정체성은 1D SDS-PAGE와 후속 탠덤 질량 분광법에서 밴드의 절단에 의해 획득되었다. 식별된 구성 요소는 알려진 eIF4E 구속력 eIF4G 단백질과 4EBP-1을 포함시켰습니다. 또한, eIF4F 복합 다른 구성 요소는 eIF4E는 구성 요소가 eIF4A 및 폴리-결합 단백질 즉, 식별되었습니다이다 중. 알려진 직접적인 구속력이 파트너뿐만 아니라, 이차 상호 작용하는 단백질뿐만 아니라, 식별하는 능력은 더욱 알 수없는 함수의 단백질의 특성이 접근 방식의 유틸리티를 강조 표시합니다.
여기에 그림과 TAP 태그 기술은 진핵 세포의 미끼 단백질의 바인딩 파트너를 격리를위한 매우 구체적이고 엄격한 방법을 보여줍니다. 이 접근법은 세포와 바이러스 모두 단백질에 적용할 수 있습니다. 우리가 알기로,이 같은 기술이 번역 개시 인자의 eIF4E에 적용되었습니다 처음이다. 이 기법을 사용하여 알려진 eIF4E 바인딩 단백질의 eIF4G 및 4EBPs의 확인은 이러한 접근 방식의 유효성을 확인. 또한, eIF4F 복합 나머지 구성 요소의 식별은, 즉 eIF4A 및 PABP는 간접 상호 작용과 차 단지는 정화 과정에서 그대로 유지 인증해줍니다. 정식 eIF4e 바인딩 단백질의 여러 isoforms의 신분도 분명했습니다. 이들은 그림 2에 자세히 설명되어 있습니다.
접근 방식의 한계로 돌아가서 특정주의 선택에 관련하여 복용해야미끼 단백질과 N-또는 C-말단에 태그 태그를 추가할지 여부. 그것은 기능적 분석을 수행하거나 태그를 유도체가 작동하기 위해 사전에 전격적인 정화에 현미경으로 융합 단백질의 지방화를 검토 권할 수도 있습니다. 적분 막이나 핵 단백질은 반드시 용해 단계에서 설명한 비교적 순한 세제를 조건으로 석방되지 않을 수 있습니다. 모든 immunoprecipitations 및 유사 풀다운 assays와 마찬가지로, 수정은 용해의 효율성을 높일 수있는 용해 완충액에서 자연과 세제의 농도로 만들 수 있습니다. 용해 및 세척 버퍼의 이온 농도는 정화의 엄중을 늘리거나 줄일 수정할 수 있습니다. 그것은 표준 온화한 조건 (위에서 설명한)에서 초기 정화를 수행하는 것도 가능하지만, 이후 연속적으로 증가하는 이온 사기꾼 아래 씻어 수 4-5 aliquots에 streptavidin 구슬 (섹션 5.8), 나누다ditions. 이것은 사용자가 아닌 특정 상호 작용하는 단백질을 제거 최적의 조건을 확인할 수 있습니다. 전체 프로세스는 또한 과도 상호 작용하는 파트너 알려져 transfection 이후 서부의 얼룩에 의해서만 결정의 존재 또는 부재를 사용하여 수행할 수 있습니다. 이 경우 우리는 각각의 플라스미드 표현 8 μg으로 transfected 세포의 두 100cm 두 요리를 제안합니다. 알려진 바인딩 파트너들과 상호 작용하기 위해 TAP-융합 단백질의 돌연변이 유도체의 능력을 조사 때 수정 절차는 쓸모없는 것입니다.
실버 스테인드 SDS-PAGE의 젤 (또는 서양 얼룩에 의한 항체를 사용할 수있는 경우) 8을 통해 샘플 1을 분석하는 것은 문제 해결의 좋은 방법이며, 기술 수용 결과를 생성하는 데 실패한다. 각 친화력 기반의 강수량 및 특정 용리의 효율성이 체계적인 표본 추출 방법을 사용하여 분석할 수 있습니다. 샘플 8-1는 optim 동안 복용해야각각의 새 미끼를위한 프로토콜의 ization.
TAP 태그 기술은 GST와 같은 다른 접근 방식 당겨 – 다운 등 이중 친화 정화 및 특정 용출 단계 (TEV 절단과 비오틴의 용출이)로 유지되는 특이성과 엄중를 제공 효모 두 하이브리드 assays를 대한 강력하고 강력한 대안을 제공합니다 정화 절차 전반에 걸쳐 높은 수준. 비판적으로이 기법은 모든 단백질에 적용할 수 있으므로 관심있는 단백질 표적에 대한 바인딩 파트너를 식별하기위한 탁월한 방법을 나타냅니다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 박사 이안 Goodfellow에게 수여 Wellcome 트러스트 수석의 원정대에 의해 후원되었다.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Hygromycin B | Roche | 10843555001 |
Rabbit IgG Agarose | Sigma | A2909 |
AC-TEV Protease | Invitrogen | 12575-015 |
Protease inhibitor cocktail | Calbiochem | 539134 |
Ultralink Immobilized Streptavidin Plus beads | Pierce | 53116 |
Vivaspin 500 centrifugal concentrator (5KDa) | Vivaspin | V50112 |
SilverQuest silver staining kit | Invitrogen | LC6070 |
Novex Colloidal Blue Coomassie staining kit | Invitrogen | LC6025 |
1.7ml prelubricated tubes | Costar | 3207 |
Microcapillary pipette tips | VWR | 37001-150 |
NuPage 4-12% Bis-Tris gradient gels | Invitrogen | NP0322BOX |
CdCl2 | Sigma | 202908 |
5x SDS Sample Buffer | Fisher | PN39000 |