Tandem purificação por afinidade é uma abordagem robusta para a identificação de parceiros de ligação às proteínas. Como prova de conceito, este método foi aplicado ao bem caracterizado eIF4E factor de iniciação da tradução para o co-precipitado os factores de células hospedeiras envolvido na iniciação da tradução. Este método é facilmente adaptado a qualquer proteína celular ou virai.
Um passo crítico e, muitas vezes limitante na compreensão da função do hospedeiro e proteínas virais é a identificação de interagir parceiros de proteínas celulares ou virais. Existem muitas abordagens que permitem a identificação de parceiros que interagem, incluindo o sistema de levedura duas híbrido, bem como puxar para baixo, utilizando ensaios de proteínas recombinantes e imunoprecipitação de proteínas endógenas seguidos por espectrometria de massa de identificação 1. Estudos recentes revelaram a utilidade de duplo afinidade purificação mediada tag, juntamente com dois passos de eluição específicos na identificação de proteínas que interagem. Esta abordagem, denominado Tandem purificação por afinidade (TAP), foi inicialmente utilizado em levedura 2,3 mas mais recentemente foi adaptado para usar em células de mamíferos 4-8.
Como prova de conceito, criámos uma purificação por afinidade tandem (TAP) usando o método do bem caracterizada eucariótico de iniciação da tradução factor eIF4E 9,10. O eIF4E fator celular de tradução é um componente crítico do complexo eIF4F celular envolvido na cap-dependente de início da tradução 10. A etiqueta de TAP utilizado no presente estudo é composto de duas unidades de proteína G e um péptido de ligação a estreptavidina separados por um vírus de Tabaco Etch (TEV) sequência de clivagem de protease. A etiqueta de TAP utilizado no presente estudo é composto de duas unidades de proteína G e um péptido de ligação a estreptavidina separados por um vírus de Tabaco Etch (TEV) a sequência de clivagem de protease 8. Para renunciar a necessidade para a geração de linhas de células clonais, foi desenvolvido um sistema rápido que depende da expressão da proteína TAP-etiquetados com isco de um plasmídeo episomally mantida com base em pMEP4 (Invitrogen). Expressão de etiquetados eIF4E murino a partir deste plasmídeo foi controlado usando o cádmio cloreto de promotor de metalotioneina indutível.
Lise das células que expressam e subsequente purificação por afinidade através de ligação a rabbit IgG agarose, TEV clivagem protease, a ligação a estreptavidina agarose ligada e eluição biotina subseqüente identificaram proteínas numerosas aparentemente específicos para o eIF4E pull-down (quando comparado ao grupo controle linhas de células que expressam a marca TAP sozinho). As identidades das proteínas foram obtidos por excisão das bandas de espectrometria de massa de SDS-PAGE e subsequente em tandem 1D. Os componentes identificados incluído as proteínas de ligação conhecidos eIF4E eIF4G e 4EBP-1. Além disso, outros componentes do complexo eIF4F, dos quais eIF4E é um componente foram identificados, ou seja, eIF4A e Poly-A proteína de ligação. A capacidade de identificar não apenas conhecidos diretos parceiros de ligação, bem como secundárias proteínas interagem entre si, acentua ainda mais a utilidade desta abordagem para a caracterização de proteínas de função desconhecida.
A técnica de marcação TAP ilustrado aqui demonstra um método altamente específico e rigoroso para isolar os parceiros de ligação de proteínas isca em células eucarióticas. Esta abordagem pode ser aplicada a ambas as proteínas celulares e virais. Para o nosso conhecimento, este é a primeira vez que uma tal técnica tem sido aplicada à eIF4E factor de iniciação da tradução. Identificação do conhecido eIF4G proteínas eIF4E vinculativa e os 4EBPs usando esta técnica confirma a validade de tal abordagem. Além disso, a identificação do componente restante do complexo eIF4F, a saber, eIF4A, e PABP confirma que a interacção indirecta e complexos terciárias permanecer intacto durante o processo de purificação. A identificação de múltiplas isoformas dos canónicos eIF4E proteínas de ligação também era evidente. Estes são descritos em mais detalhe na Figura 2.
Com relação às limitações da abordagem, certos cuidados devem ser tomadas medidas em relação à escolhade proteína isco e se ou não a colocar a etiqueta de TAG na extremidade N-ou C-terminal. Pode ser aconselhável realizar um ensaio funcional ou examinar a localização da proteína de fusão por microscopia antes da purificação escala completa para assegurar o derivado marcado é funcional. Membrana Integral ou proteínas nucleares não podem necessariamente ser liberado pelas condições relativamente suaves detergente descritos na etapa de lise. Como com todas as imunoprecipitações e semelhantes pull-down ensaios, as modificações podem ser feitas com a natureza e as concentrações do detergente no tampão de lise para aumentar a eficiência de lise. A concentração iónica dos buffers de lise e de lavagem pode também ser modificado para aumentar ou diminuir o rigor da purificação. É também possível realizar a purificação inicial sob condições padrão suaves (descrito acima), mas posteriormente dividir as esferas de estreptavidina (secção 5.8) em alíquotas 4-5, que podem posteriormente ser lavados sob crescente con iónicoções. Isso pode permitir que o usuário a identificar as condições ideais que removem não-específicas proteínas que interagem. Todo o processo pode também ser realizada usando transfecção transiente em que os parceiros que interagem são conhecidos ea sua presença ou ausência determinada por Western blot subsequente apenas. Neste caso, sugiro dois 100cm 2 pratos de cada células transfectadas com 8 mg de plasmídeo de expressão. Este procedimento modificado é de particular utilidade quando se examina a capacidade de derivados de mutantes da proteína de fusão TAP-para interagir com parceiros de ligação conhecidos.
Análise de amostras de 1 a 8 em corado com prata de SDS-PAGE (gel ou por western blot se um anticorpo está disponível) é um excelente meio de resolução de problemas, se a técnica de falhar para gerar os resultados aceitáveis. A eficiência de cada precipitação afinidade baseada e eluição específico podem ser analisados usando esta abordagem sistemática de amostragem. As amostras de um a oito deve ser tomado durante optimização do protocolo para cada nova isca.
A técnica de marcação TAP fornece uma alternativa poderosa e robusta para outras abordagens, tais como GST pull-baixos, de levedura dois ensaios híbridos etc A purificação por afinidade dupla e os passos de eluição específicos (de clivagem de TEV e eluição biotina) fornecer especificidade e rigor que ser mantido a uma elevado nível durante todo o procedimento de purificação. Criticamente esta técnica pode ser aplicada a qualquer proteína e, portanto, representa um excelente método para identificar parceiros de ligação para um alvo da proteína de interesse.
The authors have nothing to disclose.
Esta pesquisa foi financiada por uma bolsa Wellcome Senior confiança atribuído ao Dr. Ian Goodfellow.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Hygromycin B | Roche | 10843555001 |
Rabbit IgG Agarose | Sigma | A2909 |
AC-TEV Protease | Invitrogen | 12575-015 |
Protease inhibitor cocktail | Calbiochem | 539134 |
Ultralink Immobilized Streptavidin Plus beads | Pierce | 53116 |
Vivaspin 500 centrifugal concentrator (5KDa) | Vivaspin | V50112 |
SilverQuest silver staining kit | Invitrogen | LC6070 |
Novex Colloidal Blue Coomassie staining kit | Invitrogen | LC6025 |
1.7ml prelubricated tubes | Costar | 3207 |
Microcapillary pipette tips | VWR | 37001-150 |
NuPage 4-12% Bis-Tris gradient gels | Invitrogen | NP0322BOX |
CdCl2 | Sigma | 202908 |
5x SDS Sample Buffer | Fisher | PN39000 |