Tandem Affinity Purification is een robuuste aanpak voor de identificatie van eiwitbinding partners. Als proof of concept, werd deze methode toegepast op de goed gekarakteriseerde translatie initiatie factor eIF4E van co-neerslag de gastheercel factoren die betrokken zijn in de vertaling initiatie. Deze methode kan gemakkelijk worden aangepast aan een cellulair of viraal eiwit.
Een kritische vaak beperkende stap het begrijpen van de werking van de gastheer en virale eiwitten is de identificatie van interactie cellulaire of viraal eiwit partners. Er zijn vele benaderingen die de identificatie van interagerende partners, waaronder de gist twee-hybride systeem, en pull-down assays met behulp van recombinante eiwitten en immunoprecipitatie van endogene eiwitten, gevolgd door massaspectrometrie identificatie 1 mogelijk te maken. Recente studies hebben gewezen op het nut van dubbele affiniteit tag gemedieerde zuivering, in combinatie met twee specifieke elutie stappen in de identificatie van interagerende eiwitten. Deze aanpak, aangeduid als Tandem Affinity Purification (TAP), werd aanvankelijk gebruikt in gist 2,3, maar meer recent is aangepast voor gebruik in zoogdiercellen 4-8.
Als proof-of-concept hebben we een tandem affinity purification '(TAP) methode met behulp van de goed gekarakteriseerde eukaryote translatie-initiatie factorenTor eIF4E 9,10. De cellulaire vertaling factor eIF4E is een cruciaal onderdeel van de cellulaire eIF4F complex betrokken bij cap-afhankelijke translatie initiatie 10. De TAP-tag gebruikt in de huidige studie is opgebouwd uit twee Proteïne G-eenheden en een streptavidine bindend peptide gescheiden door een Tobacco Etch Virus (TEV) protease-splitsing volgorde. De TAP-tag gebruikt in de huidige studie is opgebouwd uit twee Proteïne G-eenheden en een streptavidine bindend peptide gescheiden door een Tobacco Etch Virus (TEV) protease-splitsing volgorde 8. Om de behoefte aan het genereren van klonale cellijnen af te zien, ontwikkelden we een snel systeem dat is gebaseerd op de expressie van het TAP-tag aas eiwit uit een episomaal onderhouden plasmide gebaseerd op pMEP4 (Invitrogen). Expressie van muizen gelabeld eIF4E uit dit plasmide werd gecontroleerd met behulp van de cadmiumchloride induceerbare metallothioneïne promotor.
Lysis van de expressie brengen en vervolgens affiniteitszuivering via binding aan rabbit IgG agarose, TEV protease-splitsing, de binding aan streptavidine verbonden agarose en de daarop volgende biotine elutie op de vele eiwitten die blijkbaar eigen aan de eIF4E pull-down (in vergelijking met cellijnen de uiting van de TAP-tag alleen te controleren). De identiteit van de eiwitten werden verkregen door verwijdering van de banden van 1D SDS-PAGE en daaropvolgende tandem massaspectrometrie. De geïdentificeerde componenten die onderdeel zijn van de bekende eIF4E bindende eiwitten eIF4G en 4EBP-1. Ook andere componenten van het complex eIF4F waarvan eIF4E een component geïdentificeerd namelijk eIF4A en Poly-A bindende eiwit. De mogelijkheid om niet alleen bekend directe binding partners en secundaire interagerende eiwitten, te identificeren benadrukt verder het nut van deze aanpak in de karakterisering van eiwitten van onbekende functie.
De TAP labelen techniek hier getoonde toont een zeer specifieke en strenge werkwijze voor het isoleren van de bindingspartners van lokaas eiwitten in eukaryote cellen. Deze benadering kan worden toegepast zowel cellulaire als virale eiwitten. Voor zover ons bekend, is dit de eerste keer dat een dergelijke techniek is toegepast op de translatie-initiatie factor eIF4E. Identificatie van de bekende eIF4E bindende eiwitten eIF4G en de 4EBPs gebruik van deze techniek bevestigt de geldigheid van een dergelijke aanpak. Bovendien is de identificatie van de resterende component van het complex eIF4F, namelijk eIF4A en PABP bevestigt dat onrechtstreekse interactie en tertiaire complexen intact blijven tijdens het zuiveringsproces. De identificatie van meerdere isovormen van de canonieke eIF4e bindende eiwitten was ook duidelijk. Deze zijn in detail beschreven in figuur 2.
Met betrekking tot de beperkingen van de aanpak, dienen bepaalde zorg worden ondernomen met betrekking tot de keuzeaas eiwit en of de TAG tag plaatsen op de N-of C-terminus. Het is misschien raadzaam om een functionele test uitvoeren of de lokalisatie van het fusie-eiwit te onderzoeken door middel van microscopisch voorafgaand aan de full scale zuivering om ervoor te zorgen de gelabelde afgeleide functioneel is. Integraal membraan of nucleaire eiwitten kunnen niet zonder meer worden vrijgegeven door de relatief mild voorwaarden beschreven in de lysis stap. Zoals alle immunoprecipitaties en dergelijke pull-down assays kunnen wijzigingen worden aangebracht aan de aard en concentratie van het detergens in de lysisbuffer de efficiëntie van lysis te verhogen. De concentratie van de ionische lysis en wasbuffers kunnen ook worden gemodificeerd te verhogen of verlagen de stringentie van de zuivering. Het is ook mogelijk om de eerste zuivering onder standaard milde omstandigheden (hierboven beschreven) maar vervolgens verdelen streptavidine kralen (punt 5.8) in 4-5 aliquots, dat kan worden gewassen onder meer ionische conomstandigheden. Daardoor kunnen de gebruiker de optimale voorwaarden niet-specifieke interagerende eiwitten verwijderd identificeren. Het gehele proces kan uitgevoerd worden met transiënte transfectie waarbij de interactie partners zijn bekend en de aanwezigheid of afwezigheid bepaald door western blot na alleen. In dit geval zouden we suggereren twee 100cm 2 gerechten van cellen elk getransfecteerd met 8 ng van expressie plasmide. Deze gewijzigde procedure is van bijzonder bij de behandeling van het vermogen van mutant derivaten van de TAP-fusie-eiwit interactie met bekende bindingspartners.
Analyseren monsters 1 tot en met 8 op zilver gekleurde SDS-PAGE gels (of western blot als een antilichaam aanwezig) is een goede manier problemen is de techniek niet acceptabele resultaten oplevert. De capaciteit van elke affiniteit gebaseerde neerslag en specifieke elutie kunnen worden geanalyseerd met deze systematische steekproefbenadering. Monsters een tot acht moeten worden genomen tijdens de optimisering van het protocol voor elk nieuw aas.
De TAP-tagging techniek biedt een krachtige en robuuste alternatief voor andere benaderingen, zoals GST pull-downs, gist twee-hybride testen, etc. De dubbele affiniteitszuivering en specifieke elutie stappen (TEV decollete en biotine elutie) specificiteit en strengheid te verstrekken aan worden gehandhaafd op een hoog gedurende de zuiveringsprocedure. Kritisch deze techniek kan worden toegepast op elk eiwit en derhalve een goede methode voor het identificeren bindingspartners voor een eiwit doel van belang.
The authors have nothing to disclose.
Dit onderzoek werd gefinancierd door een Wellcome Trust Senior Fellowship toegekend aan Dr Ian Goodfellow.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Hygromycin B | Roche | 10843555001 |
Rabbit IgG Agarose | Sigma | A2909 |
AC-TEV Protease | Invitrogen | 12575-015 |
Protease inhibitor cocktail | Calbiochem | 539134 |
Ultralink Immobilized Streptavidin Plus beads | Pierce | 53116 |
Vivaspin 500 centrifugal concentrator (5KDa) | Vivaspin | V50112 |
SilverQuest silver staining kit | Invitrogen | LC6070 |
Novex Colloidal Blue Coomassie staining kit | Invitrogen | LC6025 |
1.7ml prelubricated tubes | Costar | 3207 |
Microcapillary pipette tips | VWR | 37001-150 |
NuPage 4-12% Bis-Tris gradient gels | Invitrogen | NP0322BOX |
CdCl2 | Sigma | 202908 |
5x SDS Sample Buffer | Fisher | PN39000 |