Tandem affinitetsoprensning er en robust fremgangsmåde til identifikation af protein-bindende partnere. Som proof of concept, blev denne metode anvendt på velkarakteriserede translationsstart faktor eIF4E til co-bundfald værtscellesystemerne faktorer involveret i oversættelse initiering. Denne fremgangsmåde kan let tilpasses til enhver cellulært eller viralt protein.
En kritisk og ofte begrænsende trin i forståelsen af funktionen af værten og virale proteiner er identifikationen af interagerende cellulære eller virale protein partnere. Der er mange fremgangsmåder, der tillader identifikation af interagerende partnere, herunder gær-to hybrid-system samt nedbryde assays under anvendelse af rekombinante proteiner og immunopræcipitation af endogene proteiner, efterfulgt af massespektrometri identifikation 1. Nylige undersøgelser har vist nytten af dobbelt-affinitetsmærke medieret rensning, kombineret med to specifikke elueringstrin i identifikationen af interagerende proteiner. Denne fremgangsmåde, betegnet Tandem Affinitetsoprensning (TAP), blev oprindeligt anvendt i gær 2,3, men mere nylig er blevet tilpasset til brug i pattedyrceller 4-8.
Som proof-of-concept har vi etableret en tandem affinitetsrensningen (TAP), der bruger velkarakteriserede eukaryote translationsstart facTor eIF4E 9,10. Det cellulære oversættelse faktor eIF4E er en kritisk komponent af den cellulære eIF4F komplekse involveret i Cap-afhængige translationsstart 10. TAP tag anvendes i den nuværende undersøgelse er sammensat af to Protein G-enheder og en streptavidin-bindingspeptid adskilt af en Tobacco Etch Virus (TEV) proteasespaltning sekvens. TAP tag anvendes i den nuværende undersøgelse er sammensat af to Protein G-enheder og en streptavidin-bindingspeptid adskilt af en Tobacco Etch Virus (TEV) proteasespaltning sekvens 8. At give afkald behovet for dannelse af klonale cellelinier, vi udviklet et hurtigt system, baseret på ekspressionen af TAP-mærkede bait-proteinet fra en episomalt opretholdes plasmid baseret på pMEP4 (Invitrogen). Ekspression af mærkede murine eIF4E fra dette plasmid blev kontrolleret under anvendelse af cadmiumchlorid inducerbare metallothioneinpromotor.
Lysering af de udtrykkende celler og efterfølgende affinitetsoprensning via binding til rabbit IgG agarose, TEV-protease-spaltning, til at binde til streptavidin bundet agarose og efterfølgende biotin eluering identificeret talrige proteiner tilsyneladende specifikke for eIF4E pull-down (sammenlignet med kontrol cellelinier, der udtrykker TAP tag alene). Identiteten af de proteiner blev opnået ved udskæring af båndene fra 1D SDS-PAGE og efterfølgende tandem massespektrometri. De identificerede komponenter, der følger de kendte eIF4E proteiner eIF4G og 4EBP-1. Desuden andre komponenter i eIF4F komplekset som eIF4E er en komponent blev identificeret, nemlig eIF4A og poly-A-bindende protein. Evnen til at identificere ikke kun kendt direkte bindende partnere samt sekundære interagerende proteiner, hvilket yderligere understreger nytten af denne tilgang i karakterisering af proteiner med ukendt funktion.
TAP tagging teknik illustreret her viser en meget specifik og stringent fremgangsmåde til isolering af de bindende partnere bait-proteiner i eukaryote celler. Denne fremgangsmåde kan anvendes til både cellulære og virale proteiner. Vores kendskab er dette første gang en sådan teknik er blevet anvendt til translationsinitiering faktor eIF4E. Identifikation af den kendte eIF4E bindende proteiner eIF4G og 4EBPs at bruge denne teknik bekræfter gyldigheden af en sådan fremgangsmåde. Desuden identifikation af den resterende del af eIF4F komplekset nemlig eIF4A og PABP bekræfter, at indirekte interaktion og tertiære komplekser forbliver intakte under rensningsprocessen. Identifikation af multiple isoformer af de kanoniske eIF4e proteiner var også tydelige. Disse beskrives mere detaljeret i figur 2.
Med hensyn til de begrænsninger fremgangsmåde bør bestemt udvises forsigtighed med hensyn til valgaf bait-protein, og hvorvidt at placere TAG mærket i den N-eller C-terminalen. Det kan være tilrådeligt at udføre et funktionelt assay eller undersøge lokalisering af fusionsproteinet ved mikroskopi før fuld skala oprensning for at sikre, tagged derivat er funktionel. Integreret membran eller kerneproteiner ikke nødvendigvis blive frigivet ved de relativt milde detergenter er beskrevet i lysis trin. Som med alle immunopræcipitationer og lignende pull-down assays, kan der foretages modifikationer til arten og koncentrationen af detergentet i lyseringspuffer at øge effektiviteten af lysis. Den ioniske koncentration af lysis-og vaske puffere kan også modificeres til at forøge eller formindske stringensen af oprensningen. Det er også muligt at udføre den indledende oprensning under standardbetingelser milde betingelser (beskrevet ovenfor), men derefter dividere streptavidinkugler (afsnit 5.8) i 4-5 portioner, som kan derefter vaskes under stigende ionisk congelserne. Dette kan gøre det muligt for brugeren at identificere de optimale betingelser at fjerne ikke-specifikke interagerende proteiner. Hele processen kan også udføres under anvendelse af forbigående transfektion, hvor de samvirkende parter er kendt og deres tilstedeværelse eller fravær bestemmes ved efterfølgende western blot alene. I dette tilfælde vil vi foreslå to 100cm 2 retter af celler hver transficeret med 8 ug af ekspressionsplasmid. Denne modificerede fremgangsmåde er især nyttig ved undersøgelse af evnen af mutant derivater af TAP-fusionsproteinet til at interagere med kendte bindingspartnere.
Analyse prøverne 1 til 8 på sølvfarvede SDS-PAGE-geler (eller ved western-blot, hvis et antistof er tilgængeligt) er en fremragende måde til fejlfinding, bør teknikken ikke frembringe acceptable resultater. Effektiviteten af de enkelte affinitet baserede udfældning og specifikt eluering kan analyseres ved hjælp af denne systematiske prøver. Prøver man at otte bør tages under optimization af protokollen for hver ny madding.
Den TAP tagging teknik giver en kraftig og robust alternativ til andre metoder, såsom GST pull-downs, gær to hybrid-analyser etc. Den dobbelte affinitetsrensningen og specifikke elueringstrin (TEV spaltning og biotin eluering) giver specificitet og stringens at blive fastholdt på et højt niveau i hele oprensningsprocedure. Kritisk denne teknik kan anvendes til ethvert protein, og derfor repræsenterer en fremragende fremgangsmåde til identificering bindingspartnere for et protein målet af interesse.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev finansieret af en Wellcome Trust Senior Fellowship tildelt til Dr. Ian Goodfellow.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Hygromycin B | Roche | 10843555001 |
Rabbit IgG Agarose | Sigma | A2909 |
AC-TEV Protease | Invitrogen | 12575-015 |
Protease inhibitor cocktail | Calbiochem | 539134 |
Ultralink Immobilized Streptavidin Plus beads | Pierce | 53116 |
Vivaspin 500 centrifugal concentrator (5KDa) | Vivaspin | V50112 |
SilverQuest silver staining kit | Invitrogen | LC6070 |
Novex Colloidal Blue Coomassie staining kit | Invitrogen | LC6025 |
1.7ml prelubricated tubes | Costar | 3207 |
Microcapillary pipette tips | VWR | 37001-150 |
NuPage 4-12% Bis-Tris gradient gels | Invitrogen | NP0322BOX |
CdCl2 | Sigma | 202908 |
5x SDS Sample Buffer | Fisher | PN39000 |