Tandem affinitet rensing er en robust metode for identifisering av protein bindende partnere. Som bevis på konseptet, ble denne metoden brukt på godt karakterisert oversettelse initiering faktor eIF4E til co-fremskynde vertscellen faktorer involvert i oversettelse innvielse. Denne metoden er lett tilpasses enhver cellulær eller viral protein.
En kritisk og ofte begrense skritt i å forstå funksjonen av host og virale proteiner er identifisering av å samhandle mobilnettet eller viral protein partnere. Det er mange tilnærminger som gjør identifiseringen av samvirkende partnere, inkludert gjær to hybrid system, samt trekke ned analyser ved hjelp av rekombinante proteiner og immunoprecipitation av endogene proteiner etterfulgt av massespektrometri identifikasjon 1. Nyere studier har fremhevet nytten av dobbelt-affinitet tag mediert rensing, kombinert med to konkrete eluering trinn i identifiseringen av samvirkende proteiner. Denne tilnærmingen, kalt Tandem Affinity Renselse (TAP), ble opprinnelig brukt i gjær 2,3 men mer nylig har blitt tilpasset til bruk i pattedyrceller 4-8.
Som proof-of-concept har vi etablert en tandem affinitet renselse (TAP)-metoden bruker godt karakterisert eukaryote oversettelse initiering facTor eIF4E 9,10. Den cellulære oversettelse faktoren eIF4E er en kritisk komponent i den cellulære eIF4F komplekset involvert i Cap-avhengige oversettelse initiering 10. TAP tag brukt i denne studien består av to Protein G enheter og en streptavidin bindende peptid atskilt med en Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sekvens. TAP tag brukt i denne studien består av to Protein G enheter og en streptavidin bindende peptid atskilt med en Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sekvens åtte. For å gi avkall på behovet for generering av klonal cellelinjer, utviklet vi en rask system som bygger på den uttrykk for TAP-merkede agn protein fra en episomally opprettholdes plasmid basert på pMEP4 (Invitrogen). Uttrykk av merket murine eIF4E fra denne plasmid ble kontrollert ved hjelp av kadmium klorid induserbar metallothionein promoter.
Lyse av de uttrykker cellene og påfølgende affinitet rensing via binding til rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding til streptavidin knyttet agarose og påfølgende biotin eluering identifisert en rekke proteiner tilsynelatende spesifikke for eIF4E trekke ned (i forhold til styre cellelinjer som uttrykker TAP tag alene). Identiteten til de proteinene ble innhentet ved eksisjon av bandene fra 1D SDS-PAGE og påfølgende tandem massespektrometri. De identifiserte komponentene som følger de kjente eIF4E proteiner eIF4G og 4EBP-1. I tillegg andre deler av eIF4F komplekset, hvorav eIF4E er en komponent ble identifisert, nemlig eIF4A og Poly-A bindende protein. Evnen til å identifisere ikke bare kjent direkte bindende partnere samt sekundære samvirkende proteiner, fremhever videre nytten av denne tilnærmingen i karakterisering av proteiner med ukjent funksjon.
TAP tagging teknikken illustrert her demonstrerer en svært bestemt og streng metode for å isolere bindende partnere av agn proteiner i eukaryote celler. Denne tilnærmingen kan brukes til både cellulære og viral proteiner. Så vidt vi vet er dette første gang en slik teknikk har blitt brukt på oversettelsen innvielse faktor eIF4E. Identifikasjon av den kjente eIF4E bindende proteiner eIF4G og 4EBPs bruke denne teknikken bekrefter gyldigheten av en slik tilnærming. I tillegg har identifisering av den gjenværende delen av eIF4F komplekse, bekrefter nemlig eIF4A, og PABP som indirekte samhandling og tertiære komplekser forbli intakt under renseprosessen. Identifiseringen av flere isoformer av de kanoniske eIF4e proteiner var også tydelig. Disse er beskrevet nærmere i figur 2.
Med hensyn til begrensningene i tilnærmingen, bør visse forsiktighet tas med hensyn til valgav agn protein og om ikke å plassere TAG-koden på N-eller C-terminus. Det kan være lurt å foreta en funksjonell analysen eller undersøke lokalisering av fusion protein ved mikroskopi før full skala rensing for å sikre at tagget deriverte er funksjonell. Integral membran eller kjernefysiske proteiner kan ikke nødvendigvis bli utgitt av de relativt mildt vaskemiddel forhold som beskrives i lysis trinn. Som med alle immunoprecipitations og lignende pull-down analyser, kan endringer gjøres til natur og konsentrasjoner av vaskemiddel i lysis buffer for å øke effektiviteten i lysis. Den ioniske konsentrasjonen av lysis og vask buffere kan også bli modifisert for å øke eller redusere stringens av renselse. Det er også mulig å utføre innledende rensing under standard milde betingelser (beskrevet ovenfor), men senere dele streptavidin perlene (pkt. 5.8) inn 4-5 alikvoter, som senere kan vaskes under økende ionisk condene. Dette kan gjøre det mulig for brukeren å identifisere de optimale forholdene som fjerner ikke-spesifikke samspill proteiner. Hele prosessen kan også utføres ved hjelp forbigående transfeksjon hvor samvirkende partnere er kjent og deres tilstedeværelse eller fravær fastsatt av påfølgende Western blot bare. I dette tilfellet vil vi foreslå to 100cm 2 retter av celler hver transfekterte med 8 mikrogram uttrykk plasmid. Denne modifiserte prosedyren er særlig nyttig når undersøke muligheten av muterte derivater av TAP-fusion protein for å samhandle med kjente bindende partnere.
Analysere prøver 1 til 8 på sølv farget SDS-PAGE gel (eller Western blot hvis et antistoff er tilgjengelig) er en utmerket måte å feilsøking, bør teknikken klarer å generere akseptable resultater. Effektiviteten av hver affinitet baserte nedbør og spesifikk eluering kan analyseres ved hjelp av denne systematiske prøvetaking tilnærmingen. Prøver ett til åtte må tas i løpet av optimvisualisering av protokollen for hver nye agn.
TAP tagging teknikk gir en kraftig og robust alternativ til andre tilnærminger som GST rullegardinlistene, gjær to hybrid-analyser etc. dobbel tilhørighet rensing og konkrete eluering trinn (TEV cleavage og biotin eluering) gi spesifisitet og stringens som skal opprettholdes på en høyt nivå gjennom hele rensing prosedyren. Kritisk denne teknikken kan brukes på alle protein og representerer derfor en utmerket metode for å identifisere bindende partnere for et protein mål av interesse.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble finansiert av en Wellcome Trust Senior Fellowship tildelt dr. Ian Goodfellow.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Hygromycin B | Roche | 10843555001 |
Rabbit IgG Agarose | Sigma | A2909 |
AC-TEV Protease | Invitrogen | 12575-015 |
Protease inhibitor cocktail | Calbiochem | 539134 |
Ultralink Immobilized Streptavidin Plus beads | Pierce | 53116 |
Vivaspin 500 centrifugal concentrator (5KDa) | Vivaspin | V50112 |
SilverQuest silver staining kit | Invitrogen | LC6070 |
Novex Colloidal Blue Coomassie staining kit | Invitrogen | LC6025 |
1.7ml prelubricated tubes | Costar | 3207 |
Microcapillary pipette tips | VWR | 37001-150 |
NuPage 4-12% Bis-Tris gradient gels | Invitrogen | NP0322BOX |
CdCl2 | Sigma | 202908 |
5x SDS Sample Buffer | Fisher | PN39000 |