Silke film er en hidtil ukendt klasse af biomaterialer let tilpasses til en række biomedicinske anvendelser. Den præsenterede silke filmkultur system er meget fleksibel i en række<em> In vitro</em> Analyser. Dette system repræsenterer et biomateriale design platform tilbud<em> In vitro</em> Optimering, før direkte oversættelse til<em> In vivo</em> Modeller.
Silke film er lovende protein-baserede biomaterialer, som kan fremstilles med stor nøjagtighed og økonomisk i en forskningslaboratorium miljø 1,2. Disse materialer er ønskelige, fordi de har meget kontrollerbar dimensioner og materiale egenskaber, er biokompatible og fremme celleadhæsion, kan modificeres via topografisk mønsterdannelse eller ved kemisk at ændre overfladen, og kan anvendes som et depot for biologisk aktive molekyler til medikamentafgivelse beslægtede ansøgninger 3-8. Desuden er silke film relativt ligetil at tilpassede design, kan udformes til at opløses inden for minutter eller nedbrydes i løbet af årene in vitro eller in vivo, og producerer med den yderligere fordel af at være transparent i naturen og er derfor særdeles egnet til billeddannelse anvendelser 9 – 13. Kulturen Systemet metode præsenteret her repræsenterer en skalerbar tilgang til hurtige vurderinger af celle-silke filmoverfladeinteraktioner. Af særlig interesse er anvendelsen af overfladeaktive mønstrede silke film at undersøge forskellene i celleproliferation og reaktioner i celler for tilpasning 12,14. De podede Kulturerne blev dyrket på både mikro-mønstret og flade silke filmsubstrater og derefter vurderes ved hjælp af tidsforløb fasekontrast billeddannelse, scanningselektronmikroskopi og biokemiske vurdering af metabolisk aktivitet og nukleinsyre indhold. Sammenfattende giver silke filmen in vitro kultursystem en tilpasselig forsøgsopstilling er egnet til undersøgelse af celleoverflade-interaktioner på et biomateriale substrat, som derefter kan optimeres, og derefter omsættes til in vivo modeller. Observationer under anvendelse af dyrkningssystemet præsenteres her for øjeblikket anvendes til at hjælpe med ansøgninger fra basale celleinteraktioner med medicinsk anordning udformning, og dermed er relevante for en bred vifte af biomedicinske områder.
Brugen af regenererede silke film som et substrat for cellekultur har vundet i popularitet i løbet af de sidste to årtier på grund af omfattende karakterisering af materialeegenskaberne af dette protein og øget forståelse af sin biomateriale nytte 3,8. Kulturen her beskrevne system repræsenterer en roman in vitro testsystem til vurdering af celleoverflade interaktioner på mønstret silke film biomateriale substrater 7. Systemet giver mulighed for dybdegående analyse af cellulære interaktioner over tid, som nemt kan vedtages til high-throughput dataindsamling. Dette er i høj grad aktiveret, fordi silke film besidder en række afstemmelige biomateriale egenskaber, der kan modificeres til direkte at påvirke celle funktion 8,9,12, herunder: kontrol af overfladevand mikro / nano-overflade topografi 7; forskellige overfladebehandlinger kemier gennem kovalent modifikation eller adsorption af biologisk aktive molekyler 13; robust mekaanical egenskaber 15,16; kontrol af materiale hydrofilicitet / hydrofobicitet 16; isætning af biologiske forbindelser til frigivelse 4,8,17, og styret opløsning / enzymatiske nedbrydningshastigheder gennem styring af den sekundære struktur (beta-sheet indhold) 11,18,19 .
Gennemsigtighed silke film opnås ved annealing filmene for en tid under vakuum i nærvær af vanddamp 7,15. Denne behandling fremgangsmåde tillader dannelsen af β-ark sekundær struktur, fremme uopløselighed af materialet i vand, samtidig med at minimal afbøjning af lys 15. Denne gennemsigtighed af film er nøglen i muliggør direkte live-cell imaging, der kan anvendes under en række billeddiagnostiske metoder (dvs. brede felt og fluorescens) ved hjælp af et vilkårligt antal mikroskop systemer 12,20. Ud over direkte-celle billeddannelse, kan silke film let fjernes fra the kultur-system at give mulighed for yderligere fiksering og analyse. Således, at mange forskellige direkte eksperimentel vurdering, som kan udføres på dette system er anvendelige til en bred vifte af celler / væv kilder for mange tekniske områder 3,8,9,12,13,21. Tids-lapse billeddannende resultater illustrerer, hvordan tidstro kultur data kan opsamles, og som et eksempel blev anvendt til at illustrere, hvordan overfladetopografi påvirker celleinteraktioner. De repræsentative resultater viser, hvordan silke film biomaterialer kan anvendes til at understøtte HCLE kulturvækst og er amendable en række standard cellulær proliferation og metaboliske assays (fig. 4). Derudover er kulturerne fikseret og behandlet for scanning elektron billeddannelse eller andre protokoller (fig. 3).
Silk film substrater er produceret i laboratoriet med high fidelity, konsistens, og med relativt lave omkostninger (fig. 1). Dette muliggør reproducifleksibilitet under både kultur systemopsætningen og eksperimentelle resultater. Det er blevet påvist, at vand-anneale behandling frembringer en stabil silke filmmateriale i kultur, som er defineret nedbrydningshastigheder indtil koncentrationen af proteaser i opløsning 2,15,22. Som et resultat af disse materialer kan anvendes i længere tid til langsigtet cellekultur, eller forblive implanteret i måneder eller år, afhængigt af fysiologisk placering 8. Desuden har nyere arbejde vist, at både protein-strukturen og materialeegenskaberne af vand-annealede silke film er konsistente fra batch til batch tillader reproducerbare kultur resultater som vist ved hjælp af forskellige mekaniske og biofysisk testmetoder 15,16. Derudover er materialets overflade vist stor troskab blandt film partier som angivet af SEM, atomic force micrscopy (AFM), og cellekulturundersøgelser {Lawrence: 2008wr, Omenetto: 2008tc, Bray: 2011kq} 7,23,24. Materiale stabilhed og konsekvens er en vigtig faktor for, hvordan cellen vil fornemme kulturen underlaget gennem de forskellige mechanotransduction veje, og i sidste ende producere en ønsket / uønsket cellulært respons 25,26.
Historisk for kultursubstrater, såsom vævskultur behandlet plast eller glas, giver passende substrater for cellevedhæftning. Disse materialer er ikke amendable yderligere anvendelighed in vivo. Det kan forudses, at en silke film biomateriale kan tilpasses in vitro, og når eksperimentelle forventninger blevet opnået tilpassede filmen kan translateres direkte til en in vivo model. F.eks parret design mellem in vitro og in vivo eksperimenter giver en stor fordel for sådanne implanterbare silke biomaterialer i forhold til andre substrater, som rutinemæssigt anvendes in vitro.
The authors have nothing to disclose.
Støtte fra NIH K08EY015829, R21EY019561, R24EY015656, P41 EB002520, og R01 EY020856 forskning for at forebygge blindhed Career Development Award, og Tri-Institutional Stem Cell Initiative. HCLE cellelinie stillet til rådighed af Dr. Ilene Gipson. Forfatterne vil gerne takke Dr. Aihong Liu på Weill Cornell Medical College for hende teknisk bistand og vejledning med cellekultur, Anthony Labissiere på hospitalet til særlige operationer for hendes teknisk bistand til SEM billeddannelse, det Tissue Engineering Resource Center (tert) på Tufts University for teknisk support med materiale udvikling, og Cornell Center for Nanoscale Science and Technology Facility (CNF) til bistand i silicium wafer produktion.
Material Name | Company | Catalogue Number |
Silk cocoons | Tajima Shoji Co., LTD. | NA |
PDMS monomer and cross-linker | Momentive | RTV615A 01P |
Sodium Carbonate | Sigma | S2127 |
Lithium Bromide | Sigma | 213225 |
Slide-A-Lyzer | Thermo Scientific | 66110 |
1 mL Syringe | Becton-Dickenson | 309602 |
Stainless steel washer | Superior Washer | 81610 |
24-well plate | VWR | 353047 |