Summary
Denna video visar en modell för att studera utvecklingen av intimal hyperplasi efter stentutveckling med en människa kärl (IMA) i en immunbrist råttmodell.
Abstract
Preklinisk in vivo forskningsmodeller att undersöka patobiologiska och patofysiologiska processer i utvecklingen av intimal hyperplasi efter kärlet stentning är avgörande för translationsrörelse metoder 1,2.
De vanligaste djurmodeller inkluderar möss, råttor, kaniner och grisar 3-5. Dock fortfarande översättningen av dessa modeller i kliniska svårt, eftersom dessa biologiska processer redan studerat i animaliska fartyg men aldrig utförts tidigare i mänsklighetens forskningsmodeller 6,7. I den här videon visar vi en ny humaniserad modell för att övervinna denna translationella gap. Den visade metoden är reproducerbar, enkel och snabb att utföra och är lämplig för att studera utvecklingen av intimal hyperplasi och tillämpningen av olika stent.
Denna video visar hur du utför stenten tekniken i mänskliga kärl följt av transplantation till immunbrist råttor ochidentifierar ursprung prolifererande celler såsom människa.
Protocol
1. Inre bröstartären (IMA) Framställning
- Det arteriella endotelet är blottlagda av passagen av en 2-fransk Fogarty arteriell embolektomikateter (Baxter Healthcare, Deerfield, IL, USA). Katetern dras genom hela kärlet längd två gånger för att säkerställa endotelskada.
- Använd någon människa stent för 8mm längd och 2,5 mm-3 mm i diameter (t.ex. Translumina, Yukon stent). VARNING: diametern hos stenten inte överstiga kärldiametern med mer än 10% för att undvika för-och efter-stent-stenos. VARNING: Slå inte på längden av stenten i samma studie.
- Distribuera stenten med användning av lämplig ballongtryck (som noterats på stenten paketet) för att uppnå den önskade diametern.
- Lagra stent IMA i 4 ° C RPMI + heparin (500 IE/10 ml) på is tills transplantation.
2. Djur Framställning
RNu nakna (Crl: NIH-Foxn1rnu) råttor (300-350 g) är HOUsed under konventionella förhållanden i scantainer ventilerade skåp, matade standard råttmat och autoklaverat vatten ad libitum.
- Bedöva råtta med isofluran (2,5-3%) med en induktion kammare.
- Raka buken håret och placera råttan på rygg och placera en ansiktsmask över sin näsa och mun för att hålla upp anestesi.
- Desinficera buken stor spridning via Provo-Jod, nästa användning 80% etanol - upprepa detta steg två gånger. Kontrollera reflexer klämmande bakfötterna att vara säker på att råttan är tillräckligt bedövad.
- Under mikroskopisk vy utför en övre median laparotomi att exponera infrarenala bukaorta.
- Placera tarmarna i en saltlösning fuktad handske. Vik handsken runt tarmarna att förhindra förlust av fukt.
- Dissekera aorta från infrarenala regionen till förgreningen, försiktigt för att inte orsaka skador på grenarna av fartygen.
- Använd mikro klämmor för att stoppa aorta blodflödet. Placeraproximala klämman först, följt av den distala klämman.
- Ta bort en app. 0,5-0,7 mm aortasegmentet och spola den återstående aorta med heparin (200 enheter).
- Ta stentförsedda IMA och förkorta den till lämplig längd och placera den i gapet.
- Anslut IMA till mottagaren aorta, genom att köra suturer med 8-0 prolen sutur (Ethicon, Norderstedt, Tyskland).
- Öppna försiktigt den första kraniala klämman och sedan den näst sista klämman.
- Det bör finnas en synlig puls i den transplanterade IMA och vid den distala änden av aorta.
- Placera tarmarna tillbaka in i buken.
- Spola buken med förvärmd steril saltlösning.
- Stäng muskellagret av bukväggen med 6-0 prolen löpande suturer (Ethicon, Norderstedt, Tyskland).
- Medan råttan är fortfarande i anestesi, injicera 4-5 mg / kg Karprofen subkutant.
- Administrera postoperativ analgesi så är lämpligt (t.ex. Karprofen eller Meloxicam) under 3 dagar efter Surgery.
3. Representativa resultat
För histologi, proverna fixerades i 4% formalin, dehydratiserades i en graderad serie av alkohol, och infiltrerade i en blandning (MMA I) av 80% metylmetakrylat och 20% dibutylftalat under 1 dag, MMA I med 1% torr bensoylperoxid för 1 dag och MMA I med 3% torr bensoylperoxid (MMA III) under 1-2 dagar vid 4 ° C. Därefter proverna polymeriserades i nytt MMA III i glasflaskor i ett vattenbad på en pre-polymeriserad bas. Långsam polymerisation uppnåddes genom att hålla rören vid 26 ° C över natten, vilket ökar temperaturen till 28 ° C på morgonen, och sedan öka temperaturen successivt med 0,5 ° C över 12 h tills polymerisation inträffade. De polymeriserade blocken snittades vid 5 m tjocklek med hjälp av en MICROM HM 360 mikrotom utrustad med en volframkarbid kniv.
Att identifiera ursprunget av prolifererande celler (figur 1), slides färgades med antikroppar som identifierar antingen grönt fluorescerande protein (GFP) eller rått-MHC-I-och humana glatta muskelceller. För dessa studier var humant IMA inkuberades med reportergenen GFP över natten med användning lentivirala partiklar för stabil transduktion av IMA-celler. Delande dotter celler från människa kunde identifieras genom att uttrycka GFP. Efter deparaffinization, värme-inducerad epitopretrieval utförs genom att värma glasen i antigenåtervinning med hjälp av en ångbåt. Den bild-IT FX-signal förstärkare kan användas för blockering steg. Celler av humant ursprung är identifierade med användning av de mus-monoklonala antikroppar mot GFP (1:100 utspätt i primär antikropp utspädningsmedel (Dako)), och vidare är märkt med get-anti-mus-IgG, Alexa Fluor 488 (1:1000 utspätt i sekundär antikropp utspädningsmedel ). De glatta muskelcellerna märktes med kanin polyklonala anti-glattmuskel α-aktin (1:100 utspätt i primär antikropp utspädningsmedel), följt av get-anti-kanin-IgG, Alexa Fluor 555 (1:1000 utspädd i sekundära antikroppar spädningsmedel). Varje antikropp inkubation utförs vid 37 ° C under 1 timme med tre gånger PBS tvättning däremellan. Kärnor färgas med DAPI under 10 minuter. Efter montering av bilder med hjälp Förläng Gold antifad reagens, prover analyserades med hjälp av konfokalmikroskopi.
Figur 1. De neointimala celler som humana glatta muskelceller A:. Grön = anti GFP, märkning celler av mänskligt ursprung, röd = anti human glatta muskelceller aktin, blått = DAPI, identifiera cellkärnor B: Grön = anti rått MHC-I, märkning celler av råttursprung; röd = anti humana glattmuskelceller aktin; blå = DAPI, identifiera cellkärnor. Prolifererande celler identifieras som glatta muskelceller och positiva för GFP, men negativ för rått-MHC-I-molekylen. Därför celler som förökar sig är humant ursprung.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Även om olika in vivo forskning modeller befintliga att undersöka utvecklingen av intimal hyperplasi efter stentbehandling, dessa modeller fortfarande inför translationella hinder att övervinna. Dessutom stora djurmodeller är dyra och särskilt boende förhållanden och kirurgisk utrustning inte är tillgänglig för alla laboratorier.
Med hjälp av en människa IMA att studera utvecklingen av mänskliga intima proliferation och in-stent restenos studerades innan ex situ i organkulturer 8,9. Den nya humaniserade IMA-modellen utgör ett translationell arbetsmodell för att hantera frågan om i stent re-stenos in vivo, genom att implantera den mänskliga IMA till bukaortaaneurysm ställning immundefekta råttor. Human IMA: s är en perfekt match till storleken på bukaorta hos råttor. Därför är vår presenterade modellen reproducerbar, enkel och snabb att utföra, kräver inte speciell kirurgisk utbildning och ärbillig.
Identifieringen av neointimala cellerna som mänskliga glatta muskelceller stänger translationella avståndet till kliniska miljöer och visar möjlighet att undersöka de mänskliga patofysiologiska processer in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna tackar Christiane Pahrmann för hennes bidrag. Speciellt tack till Ethicon, Norderstedt, Hamburg (Tyskland) för att ge suturmaterial.
Medel
Sonja Schrepfer har fått ett forskningsanslag från Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (SCHR992 / 3 1 och SCHR992/4-1).] Arbetet stöddes av ISHLT Shumway karriärutveckling Grant 2010 och Falk forskningsfinansieringen (Stanford University).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 French Fogarty catheter | Baxter Internationl Inc. | 120602F | |
| Yukon Stent | Translumina GmbH, Hechingen, Germany | Use the stent of your choice according to your study protocol | |
| RPMI media | Biochrom AG | Nr.F1275 | |
| heparin | Baxter Internationl Inc. | 2B0953 | |
| isoflurane | Abbott Laboratories | B506 | |
| Provo-Iodine | Betadine Puredue Pharma | EAN:5995327165830 | |
| 80% ethanol | Geyer | ETV 80/0500 | |
| Micro clamp | Harvard Apparatus | PY2-61-0186 | |
| Sutures 8-0 | Johnson & Johnson | 2808G | |
| Sutures 6-0 | Johnson & Johnson | 1698 H | |
| Carprofen | Feizer Vet | PZN:0110208 | |
| Metamizol | Ratiopharm | ||
| Target retrieval solution, pH9 | Dako | S2368 | |
| Image-iT FX signal enhancer | Invitrogen | I36933 | |
| mouse monoclonal anti-GFP antibody | BD Biosciences | 632381 | |
| primary antibody diluent | Dako | S3022 | |
| goat-anti-mouse IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11017 | |
| secondary antibody diluent | Dako | S0809 | |
| rabbit polycolonal anti-smooth muscle α-actin | Abcam | ab5694 | |
| goat-anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21430 | |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 |
References
- Deuse, T., Ikeno, F., Robbins, R. C., Schrepfer, S. Imaging In-Stent Restenosis: An Inexpensive, Reliable, and Rapid Preclinical Model. J. Vis. Exp. (31), e1346 (2009).
- Oyamada, S. Trans-iliac rat aorta stenting: a novel high throughput preclinical stent model for restenosis and thrombosis. J. Surg. Res. 166, e91-e95 (2011).
- Chamberlain, J. A novel mouse model of in situ stenting. Cardiovascular research. 85, 38-44 (2010).
- Deuse, T. Introducing the first polymer-free leflunomide eluting stent. Atherosclerosis. 200, 126-134 (2008).
- Finn, A. V. Differential healing after sirolimus, paclitaxel, and bare metal stent placement in combination with peroxisome proliferator-activator receptor gamma agonists: requirement for mTOR/Akt2 in PPARgamma activation. Circulation research. 105, 1003-1012 (2009).
- Tellez, A. Coronary bare metal stent implantation in homozygous LDL receptor deficient swine induces a neointimal formation pattern similar to humans. Atherosclerosis. 213, 518-524 (2010).
- Suzuki, Y., Yeung, A. C., Ikeno, F. The pre-clinical animal model in the translational research of interventional cardiology. JACC Cardiovasc. Interv. 2, 373-383 (2009).
- Holt, C. M. Intimal proliferation in an organ culture of human internal mammary artery. Cardiovascular research. 26, 1189-1194 (1992).
- Swanson, N., Javed, Q., Hogrefe, K., Gershlick, A. Human internal mammary artery organ culture model of coronary stenting: a novel investigation of smooth muscle cell response to drug-eluting stents. Clin. Sci. (Lond). 103, 347-353 (2002).
